Протокол описывает инженер perfusable сосудистой сети в сфероида. Окружающие микроокружения сфероида разрабатывается побудить ангиогенеза и подключить сфероида к микроканалов microfluidic устройства. Метод позволяет перфузии сфероида, который является долгожданный технику в трехмерном культур.
Сфероиде (многоклеточных совокупности) рассматривается как хорошая модель живых тканей в организме человека. Несмотря на значительные улучшения в культурах сфероида perfusable сосудистой сети в сфероидов остается важнейшей задачей для долгосрочной культуры, необходимо поддерживать и развивать их функции, такие как выражения протеина и морфогенеза. Протокол представляет новый метод для интеграции perfusable сосудистой сети в пределах сфероида microfluidic устройства. Чтобы побудить perfusable сосудистой сети в сфероида, ангиогенных ростки, подключенных к микроканалов на сфероиде руководствовались используя ангиогенных факторов от человеческих легких фибробластов, культивируемых в сфероида. Ростки ангиогенных достиг сфероида, объединилась с эндотелиальных клеток, совместно культивируемых в сфероида и формируется непрерывный сосудистой сети. Сосудистой сети может perfuse интерьер сфероида без какой-либо утечки. Сконструированный сосудистой сети может далее использоваться в качестве маршрута для поставки питательных веществ и удаления отходов, имитируя циркуляцию крови в vivo. Этот метод предоставляет новую платформу в культуре сфероида сторону лучше перепросмотре живых тканей.
Переход от монослойном культивировании (двухмерный) к трехмерной культуре мотивируется необходимость работы с моделями культуры, которые имитируют клеточных функций живых тканей1,2,3. Плоские и жесткие пластиковые субстраты, широко используется в культуре клеток не напоминают большую часть внеклеточных средах в человеческом теле. В самом деле многие исследования показывают, что трехмерная культуры воссоздать ткани конкретных архитектуры, механические и биохимических подсказки и связи ячеек, которые не наблюдались в обычных двумерных культуры4, 5,6,,78.
Мультиклеточные агрегат или сфероида, является одним из наиболее перспективных методов для реализации этой трехмерной культуры9,10. Клетки секретируют внеклеточного матрикса (ECM) и может взаимодействовать с другими в сфероида. Хотя некоторые другие биоинженерии подходы11,12,13,14, например, клеток укладки, успешно реплицировать пространственная сложность человеческого тела, эти подходы имеют только два или три виды клеток для облегчения анализа и сосредоточены на только одной функции органов-мишеней. В отличие от клеток в сфероидов подвергаются различные культуры среды в зависимости от их позиции в сфероида из-за разнородных поставки питательных веществ и кислорода и паракринными Аутокринный сигнальных молекул в сфероида. Эта особенность сфероидов частично имитирует в естественных условиях состояния культуры и включить клетки в сфероидов для создания гораздо более сложной, организованной ткани структуры в vitro чем те, которые культивировали в укладки ткани9, 15 , 16. Обратите внимание, что если сфероиде состоит из одного вида клеток, функции клеток в сфероида не равномерное вследствие неоднородной среды в сфероида. В последние несколько лет сфероиде культур позволило эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) или ткани резидентов стволовые клетки, чтобы имитировать в естественных условиях развития последовательностей и воссоздать мини органы как мозг17, печени18и почек19,20.
Несмотря на значительный прогресс в сфероида культуры техники по-прежнему проблематично культивирования большой сфероидов долгое время. В трехмерные ткани клетки должны быть расположены в пределах 150-200 мкм кровеносного сосуда из-за ограниченное количество кислорода и питательных веществ,21. Сосудистой сети в пределах сфероида необходимы для пилки обмена веществ между кровью и тканями в естественных условиях. Для достижения этой цели, другие группы совместно культивируемых эндотелиальных клеток с целевой ячейки22,,2324 или индуцированной дифференцировка плюрипотентных клеток в CD31-положительных клеток20. Тем не менее сообщил корабля как структуры не имеют открытые концы lumina на поставку кислорода и питательных веществ в центр сфероида. Чтобы имитировать сосудистой роль питают клетки в трехмерном культуре, открытого и perfusable сосудистой сети должны разрабатываться в сфероида.
В течение последних нескольких лет некоторые исследовательские группы в поле микротехники сообщили методы построить perfusable сосудистой сети, спонтанно формируется в устройстве microfluidic используя ангиогенных факторов от cocultured фибробластов клетки25 ,26. Эти сосудистой сети имеют аналогичные морфология с их коллегами в естественных условиях и может быть перестроен факторами окружающей среды, что делает их пригодными для подражая сосудистой функции в культуре сфероида. Цель настоящего Протокола заключается в строительстве perfusable сосудистой сети в сфероида, используя microfluidic платформа27. Microfluidic устройство изменяется от ранее сообщалось устройство25 , так что сфероиде могут быть включены. Направляя ангиогенных секреции от клетки фибробластов в сфероиде эндотелиальных клеток в микроканалов, ангиогенных ростки от микроканалов, анастамозные с сфероида и сформировали perfusable сосудистой сети. Этот метод позволяет прямой поставкой широкого круга веществ, таких как флуоресцентных молекул и микрометр шкала бусины в интерьер сфероиде, который обеспечивает основу для долгосрочной культуры ткани с сосудистой сети.
Предыдущие доклады показывают, что hLFs выделяют коктейль из нескольких ангиогенных факторов, таких, как Ангиопоэтин-1, Ангиогенин, фактора роста гепатоцитов, превращая фактор роста α, фактора некроза опухоли и некоторые внеклеточного матрикса белки29, 30. Э…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана гребень JST (Грант № JPMJCR14W4), общества для поощрения от науки (JSP) KAKENHI (номер 25600060, 16K 16386 Грант), центр инновационной программы от МПКСНТ и JST, проект был сосредоточен на разработке технологии оценки ключ от Японское агентство для медицинских исследований и развития, AMED, Mizuho Фонд содействия развитию наук. Микротехнологий поддержали Киотский университет нано технологии концентратора.
AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
Aceton | Wako | 012-00343 | |
Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
2-propanol | Wako | 163-04841 | |
Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
(Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
Collagen I | Corning | 354236 | |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |