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Un test Flow Cytometry d’identifier des composés qui perturbent la fixation du Ligand de chimiokines CXC fluorescent marqué 12 au récepteur de chimiokines CXC 4

Published: March 10, 2018 doi: 10.3791/57271
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Virology and Chemotherapy, Department of Microbiology and Immunology, Rega Institute for Medical Research, KU Leuven

Summary

Une coulée d’essai de liaison cellulaire axée sur la cytométrie en flux est décrite qui est principalement utilisée comme outil de dépistage pour identifier les composés qui inhibent la fixation d’un ligand de chimiokines CXC fluorescent étiquetée 12 (CXCL12) pour les récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4).

Abstract

Cible pharmacologique des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est d’une grande importance pour la santé humaine, comme dysfonctionnelle GPCR-mediated signaling contribue à la progression de nombreuses maladies. La paire de ligand/récepteur ligand de chimiokines CXC 12 (CXCL12) / récepteurs de chimiokines CXC 4 (CXCR4) a soulevé des intérêts cliniques significatifs, par exemple comme une cible potentielle pour le traitement du cancer et des maladies inflammatoires. Petites molécules ainsi que des anticorps thérapeutiques qui précisément ciblent CXCR4 et inhibent la fonction de récepteur sont donc considérés comme précieux outils pharmacologiques. Ici, un écoulement cytometry cellulaire test d’amplification qui permet l’identification de composés (par exemple, de petites molécules) qui abroge CXCL12 liaison à CXCR4, est décrite. Essentiellement, l’analyse se fonde sur la compétition pour récepteur liaison entre un montant fixe de CXCL12 fluorescent étiquetés, l’agoniste de chimiokine naturelle pour CXCR4 et composés sans étiquette. Par conséquent, l’utilisation indésirable de sondes marquées radioactivement est évitée dans cet essai. En outre, les cellules vivantes sont utilisés comme source de récepteur (CXCR4) au lieu de préparations de la membrane cellulaire. Cela permet une adaptation facile du dosage d’un format de plat, ce qui augmente le débit. Ce test s’est avéré être un test de découverte précieux médicament générique pour identifier les composés de ciblage CXCR4. Le protocole peut probablement être adapté aux autres RCPG, au moins si ligands fluorescent étiquetés sont disponibles ou peuvent être générés. Une connaissance préalable concernant les voies de signalisation intracellulaires qui sont induites lors de l’activation de ces RCPG, n’est pas nécessaire.

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont des protéines de surface de cellules pouvant être activés par des ligands extracellulaires (p. ex., peptides, hormones protéiques, amines), donc réglementer beaucoup physiologique et le développement de procédés1. Quand un agoniste occupe sa poche de liaison de GPCR, le changement conformationnel induit dans la protéine réceptrice favorise la liaison d’intracellulaire récepteurs associés aux protéines G hétérotrimériques, consistant en Gα- PIB et sous-unitésβγ G. L’échange subséquent du GTP pour le PIB sur les résultats de sous-unitéα G dans la dissociation de les sous-unités de protéine G (Gα-GTP et Gβγ) qui, à son tour, va lancer plus loin en aval de signalisation des voies2,3. Lorsque le Gα-GTP est hydrolysé, re-association du Gα- PIB et sous-unitésβγ G convertira la protéine G dans son état au repos3,4. Différents types de protéines G existent (Gs, G,i/o, Gq, G12/13), qui sont classés par catégorie basée sur la similarité de séquence avec le G de sous-unitéα 5. Toutes ces protéines G induisent des voies de signalisation intracellulaire définis qui sous-tendent la réaction biologique à l’activation du récepteur. À la suite de l’activation des récepteurs, kinases GPCR (krg) phosphorylent la queue intracellulaire des RCPG, ce qui favorise une interaction avec le β-arrestins. Ce processus conduit à la résiliation de la signalisation, du récepteur de la désensibilisation et l’internalisation6G de protéines. Β-arrestins font également partie des complexes moléculaires multiples que le déclencheur de signalisation cascades indépendant de signalisation7G de protéines.

RCPG est parmi les cibles moléculaires plus validés pour une intervention thérapeutique, déréglementé GPCR signalisation médiée par, par exemple en raison du gain de fonction des mutations dans le gène du récepteur ou de la surexpression du récepteur, contribue à l’étiologie de la plupart 8de maladies humaines. Par conséquent, RCPG représente l’une des classes plus importantes de médicaments cibles étudiées par l’industrie pharmaceutique8,9,10. Un exemple notable d’un RCPG cliniquement pertinente est le récepteur de chimiokines CXC 4 (CXCR4), qui peut être activé par un ligand naturel unique, le CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. En raison de son rôle établi comme un corécepteur majeur pour 1, virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) entrée et infection en cluster de différenciation 4 (CD4) positive T-lymphocytes12, CXCR4 a d’abord étudié comme une cible de médicament antiviral. Domiciliation de souches et progénitrices cellules13et CXCL12-CXCR4 interaction dans la moelle osseuse plus régule la rétention. Aussi, compte tenu de son implication dans nombreux aspects de la biologie (p. ex., la survie des cellules tumorales, métastase, angiogenèse tumorale liées) de cancer du14 et plusieurs autres maladies humaines (p. ex., les maladies inflammatoires)15, CXCR4 a soulevé beaucoup d’intérêt comme une cible prometteuse pour la découverte de médicaments. AMD3100, une petite molécule qui vise spécifiquement les CXCR4, initialement détectée comme un anti-VIH médicament candidat16 et demeure l’un des plus puissants antagonistes CXCR4 décrits à la date17. Son développement comme un médicament antiviral a toutefois abandonné18. Actuellement, cette molécule est utilisée comme agent de mobilisation des cellules souches pendant le traitement du myélome multiple et lymphome patients18. Plusieurs autres non chimiquement apparentés de petites molécules et des produits biologiques qui inhibent la fonction CXCR4 avec puissance variable ont été décrits19.

Méthodes de liaison du récepteur sont des outils précieux en pharmacologie qui permettent l’identification des composés (par exemple, de petites molécules) qui interagissent directement avec la GRCP d’intérêt. Afin d’effectuer des études de liaison, il n’y a aucun besoin de connaissances préalables concernant les propriétés de signalisation intracellulaires ou fonctionnalités d’un RCPG donnée. Bien que cela peut être considéré comme un avantage, elle implique que composés pour quel récepteur liaison peut être prouvé doivent être davantage caractérisé en évaluant leur potentielle activité agoniste ou antagoniste. Cette activité peut être évaluée à l’aide de tests pharmacologiques ou biologiques associés à la GRCP sous étude. Selon leur profil d’activité, les molécules de liaison du récepteur pourraient alors potentiellement évoluer pour devenir composés de plomb roman d’enquête dans les études précliniques et cliniques. Les molécules qui se lient spécifiquement à un récepteur à haute affinité peuvent aussi servir comme échafaudages à créer des outils thérapeutiques ou diagnostiques, par exemple par radiomarquage eux pour l’imagerie non invasive en vivo de cellules de tumeur20, ou comme potentiel véhicules pour l’administration ciblée d’agents thérapeutiques,21. Dans le cas de CXCR4, l’imagerie in vivo de cellules tumorales a déjà été démontrée à l’aide de modèles de souris dans lequel des molécules marquées CXCR4 ciblage a permis la visualisation du cancer humain xénogreffes20,22,23 .

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole détaillé pour un test de fixation de concurrence qui permet l’identification de petites molécules et des produits biologiques qui interfèrent directement avec agoniste (CXCL12) contraignant à CXCR4. Le principe de base du dosage est la concurrence entre un montant fixe de ligand fluorescent étiqueté (CXCL12AF647, voir la Table des matières et réactifs) et non composés pour la liaison aux récepteurs protéiques17, 24. le signal fluorescent spécifique d’étiquetées ligand lié à des cellules individuelles exprimant le CXCR4 est ensuite analysé par cytométrie en flux. Ce signal fluorescent sera réduit lorsque non étiquetées de petites molécules perturbent l’interaction CXCL12AF647 / CXCR4. Le test utilise des cellules vivantes non manipulé endogène exprimant CXCR4 (c.-à-d., les cellules Jurkat). Par conséquent, aucune préparation de la membrane cellulaire n’est nécessaire, ce qui rend le test pratique, rapide et compatible avec un débit plus élevé. Comme un ligand fluorescent étiqueté est utilisé, la radioactivité est évitée.

CXCL12 étant l’agoniste naturel pour CXCR4, composés de petites molécules qui interfèrent avec la liaison CXCL12AF647 dans l’essai sont susceptibles d’interagir avec le site de liaison du récepteur orthosteric (c.-à-d., le site de liaison occupé par le naturel agoniste). Les molécules qui interagissent avec les sites de fixation de récepteurs topographiquement distincts de l’accepteur orthosteric ne sont pas détectés, si ils n’influencent pas la liaison de CXCL12. Par exemple, les MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs et négatifs, une catégorie importante et émergente des RCPG ciblant les molécules agissant sur les sites de liaison allostérique25, seront potentiellement pas ramassés avec ce test. En outre, si les composés identifiés avec cette fonction de test de liaison agonistes ou antagonistes des récepteurs ne peuvent pas être dérivés. Enquête des composés identifiés dans les essais pharmacologiques ou fonctionnelles supplémentaires axés sur le récepteur sera donc nécessaire. Ces tests pourraient inclure (une combinaison de) cellulaire fluorescence ou luminescence-tests pour la détection des seconds messagers (p. ex., Ca2 +, adénosine monophosphate cyclique (AMPc)), phénotypiques ou dosages biologiques et la β-arrestine tests de recrutement, le choix dont dépend les signalisation des propriétés spécifiques de la GRCP sous étude. Par conséquent, le test de liaison compétitive décrit dans les présentes principalement sert un test de dépistage initial qui doit être complétée par d’autres analyses pour permettre à une caractérisation approfondie des composés avec puissance de fixation de récepteurs cellulaires.

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Protocol

1. maintien de la Culture cellulaire

Remarque : Toutes les étapes décrites aux points 1 et 2 sont effectués dans des conditions stériles dans une enceinte à flux laminaire.

  1. La croissance de cellules en T75 flacons de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
    Remarque : Dans cet essai, Jurkat cellules (c'est-à-dire des lymphocytes T leucémiques humaines qui expriment endogène CXCR417) sont utilisés. Expression de CXCR4 à la surface de la cellule doit être évaluée tout au long de mise en culture cellulaire par cytométrie en flux. Une description de la procédure de cytométrie de flux et de réactifs pour déterminer les niveaux d’expression de récepteurs à la surface cellulaire est, cependant, pas dans le champ d’application du présent protocole, mais a été décrit précédemment17.
  2. Laisser pousser en suspension jusqu'à ce qu’ils atteignent 80-85 % confluency les cellules Jurkat. Avant le passage des cellules dans une fiole de roman, permettent tous les réactifs à température ambiante (RT).
  3. Ajouter 20 mL de milieu frais complet (milieu RPMI-1640, 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 2 mM de glutamine) dans une fiole de culture T75 roman.
  4. Ajouter 5 mL de suspension de cellules Jurkat du flacon original de T75 (contenant 25 mL de suspension cellulaire) dans le roman T75 flacon de culture. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.

2. préparation des cellules Jurkat CXCL12 et du tampon d’essai pour la compétition Binding Assay.

  1. Préparer une solution de CXCL12AF647 (20 µg/mL ; voir Table des matières et réactifs) en dissolvant le réactif lyophilisé (stocké à-80 ° C, dans l’obscurité) dans de l’eau ultrapure additionné de 0,01 % (volume/volume) de Polysorbate 20. Stocker les aliquotes à usage unique de cette solution mère à-80 ° C, abri de la lumière.
  2. Préparer du tampon en ajoutant 40 mL HEPES (concentration finale de 1 M, 20 mM) de 200 mL Hank Balanced Salt solution (HBSS, 10 x, sans rouge de phénol et sans bicarbonate de sodium, 1 x concentration finale). Ajouter de l’eau ultrapure pour obtenir un volume final de 2 L. Ajouter 4 g (0,2 % poids/volume) l’albumine sérique bovine (BSA) et dissoudre la BSA via magnétique en remuant. Enfin, ajuster le pH à 7,4 (utiliser le NaOH pour cela) et filtrer la solution par le biais de 0,2 µm pores (voir Table des matières et réactifs) à l’aide d’une tubulure de vide.
    Remarque : Ce tampon sera utilisé dans tous les autres mesures du protocole.
  3. Compter le nombre et la viabilité des cellules. Pour ce faire, prélever un échantillon de la suspension cellulaire et le diluer dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    Remarque : Nous utilisons systématiquement un analyseur de viabilité cellulaire automatisée (voir Table des matières et réactifs) capable de compter les suspensions cellulaires à des concentrations variables. Pour le comptage de cellules, diluer 0,5 mL de suspension cellulaire dans 1,5 mL de PBS (autres dilutions, p. ex., 0,1 mL dans 1,9 mL PBS, sont également possibles). L’utilisation de cette méthode, qui repose sur la méthode d’exclusion du colorant bleu trypan, a été décrit précédemment26. Plusieurs autres dispositifs sont disponibles dans le commerce pour compter le nombre de cellules et de viabilité qui devrait fonctionner tout aussi bien.
  4. Recueillir le nombre désiré de cellules (c.-à-d. ~ 24 x 106 cellules pour exécuter le test avec une plaque à 96 puits complete) dans un tube stérile de 50 mL par centrifugation (voir Table des matières et réactifs pour le type de centrifugeuse utilisée) à 400 x g pendant 5 min à RT.
  5. Doucement de décanter le liquide surnageant sans déranger le culot cellulaire. Ajouter frais de tampon (par exemple, 20 mL) et remettre en suspension les cellules par pipetage doucement verticalement.
  6. Centrifuger les cellules à nouveau à 400 x g pendant 5 min à température ambiante.
  7. Décanter le liquide surnageant à nouveau et Resuspendre le culot dans frais de tampon pour obtenir une densité de 5 x 106 cellules/mL.

3. essai de liaison de la concurrence

Remarque : L’essai de liaison réelle concurrence est effectuée à la RT et peut être effectuée dans des conditions non stériles.

  1. Diluer les composés incriminés dans du tampon (voir 2.2) pour obtenir la concentration désirée. Soit préparer une concentration fixe du composé pour le dépistage initial (par exemple, 10 concentration finale de µM) ou, alternativement, une série de dilutions de concentrations pour de plus amples caractérisation des composés (par exemple, un 1/3, 1/4 ou 1 / 5 série de dilutions à partir de 1 µM, concentration finale). N’oubliez pas que la solution composée deviendra à terme 2 x dilué lors de l’essai ; par conséquent, préparer un 2 x solution concentrée.
  2. Déposer 100 µL du composé en solution (2 x concentré) dans un clair 96 puits rond plaque de fond (voir Table des matières et réactifs) selon un prédéfinis expérimental prédisposer (p. ex., Figure 1).
    Remarque : À ce stade, des échantillons témoins positifs et négatifs sont inclus dans l’essai. Dans l' échantillon témoin négatif, 100 µL de tampon est ajouté au lieu de composé dans les puits de la plaque à 96 puits. Pour l' échantillon de contrôle positif, le tampon est également ajouté au cours de cette étape. Voir aussi la Figure 1 pour une mise en page expérimentale typique dans lequel une série de dilutions de plusieurs composés est testée.
  3. Ajouter 50 µL de la suspension cellulaire (voir 2.7 ; 0,25 x 106 cellules) provenant d’un réservoir de réactif dans la plaque 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber les plaques pendant 15 minutes à la RT dans l’obscurité.
  4. Ajouter 50 µL de CXCL12 fluorescent étiquetés (c.-à-d. 100 ng/mL de CXCL12AF647 dans du tampon d’essai, 4 x concentré, concentration finale de 25 ng/mL) provenant d’un réservoir de réactif semblables aux puits de la plaque à 96 puits. Incuber 30 min à ta dans l’obscurité.
    Remarque : Pour les échantillons de contrôle négatif, ajouter du tampon à la place. Par conséquent, le signal fluorescent détecté dans les échantillons de contrôle négatif correspondra à la signal de fond auto-fluorescente (Figure 1 a). Pour les échantillons de contrôle positif, ajouter 50 µL/puits de CXCL12AF647. Les échantillons de contrôle positif donnera le signal de fluorescence maximale détecté, puisque aucune inhibition éventuelle par incubation préalable avec des composés a été incluse (Figure 1 a).
  5. Centrifuger la plaque 96 puits à 400 x g pendant 5 min à RT. Enlever le surnageant des cellules granulés en basculant sur la plaque. Sécher la plaque sur un mouchoir en papier.
  6. Ajouter 200 µL de tampon frais provenant d’un réservoir de réactif dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Procéder immédiatement.
  7. Centrifuger la plaque à nouveau pendant 5 min à 400 x g à RT. Enlever le surnageant en retournant sur la plaque et séchez-le à nouveau sur le tissu.
  8. Doucement Resuspendre le culot dans 200 µL de paraformaldéhyde à 1 % dissous dans du PBS. Cette étape va fixer les cellules.
  9. Continuer le protocole immédiatement avec la quantification de la fluorescence par cytométrie en flux.

4. analyse des échantillons par cytométrie en flux

CXCL12AF647 colorées et obsédé de cellules sont maintenant prêtes à être analysées à l’aide de cytométrie en flux. Plusieurs types de cytomètres peuvent être utilisés, mais ils ont besoin d’être équipés avec le laser correct (c'est-à-dire, un laser rouge, excitation entre ~ 630 nm) pour l’excitation et de filtres adaptés pour la détection de fluorophore (émission filtres ~ 660 nm). Ils doivent être capables de traiter des échantillons dans un format de plaque à 96 puits. Exemples de dispositifs de cytométrie en flux appropriés sont donnés dans Table des matières et réactifs.

  1. Démarrer l’appareil et ouvrez le logiciel correspondant (voir Table des matières et réactifs).
  2. Sélectionnez les paramètres cellulaires suivants pour être visualisé en format dot blot : transmettre scatter (FSC), diffusion latérale (SSC) et la chaîne de détection fluorophore (CXCL12AF647).
    Remarque : Avec le paramètre FSC, les cellules sont discriminés selon leur taille, étant donné que l’absorption de la lumière détectée est proportionnelle au diamètre de la cellule. Le paramètre SSC, mesurer la diffusion de la lumière à un angle de 90°, fournit des informations sur la granularité des cellules.
  3. Choisir un échantillon (par exemple, un échantillon témoin négatif) pour effectuer le blocage d’une population de cellules homogènes définie selon les paramètres FSC et SSC.
    1. Sélectionnez injection automatique de ~ 100 µL de cellules obsédés de cet échantillon de contrôle négatif dans le cytomètre en flux. Sélectionnez l’option « mixage » avant l’injection et utiliser un débit d’échantillon de 1,5 µL/s.
    2. Exécuter cet exemple, sélectionnez « Acquire Data. » Les paramètres FSC et SSC pour cet échantillon apparaîtra maintenant sur l’écran.
    3. Sélectionnez l’outil de blocage du logiciel. Basée sur la visualisation de la tache de dot FSC et SSC, prédéfinir une population cellulaire homogène et viable de blocage. Pour ce faire, créez un polygone (en utilisant l’outil de blocage du logiciel) qui comprend les cellules simples distribuées de façon homogène (« événements ») basés sur ces deux dimensions.
      Remarque : La procédure de blocage a pour but de définir une population de cellules homogènes et viable qui sera utilisée pour une analyse plus approfondie. Gating repose sur l’hypothèse que la majorité des cellules viables forment une population de cellules homogènes selon les paramètres FSC et SSC. En effectuant cette étape, les débris cellulaires, les cellules mortes et agrégats cellulaires peuvent largement être exclus de l’analyse. Une illustration du processus d’injection est donnée dans la Figure 1 b.
  4. Sélectionnez cette option pour analyser les 20 000 « événements » (p. ex., les cellules individuelles) par exemple.
    Remarque : Cela signifie que pour chaque échantillon, 20 000 cellules qui entrent dans le portail prédéfini seront éventuellement analysés. Acquisition de données pour chaque échantillon continuera jusqu'à ce que ce nombre d’événements est analysé.
  5. Lancer l’exécution (sélectionnez « dossier Data »). Le dispositif de cytométrie de flux va maintenant analyser tous les échantillons par un en enregistrant l’intensité de la fluorescence moyenne (MFI) pour chaque échantillon. Cette IMF correspond au signal fluorescent moyens correspondant aux 20 000 cellules qui entrent dans le portail prédéfini.

5. analyse

L’IFM obtenu pour chaque échantillon permet d’effectuer tous les calculs supplémentaires. Analyse les données de cytométrie de flux peut être interprété par plusieurs logiciels disponibles dans le commerce (voir Table des matières et réactifs).

  1. Pour déterminer le pourcentage d’inhibition du signal fluorescent obligatoire, à la suite de pré-incubation composé, appliquez la formule suivante :
    Equation 1
    Où :
    MFIExp = l’IMF de l’expérimental (= imprégnées d’insecticide composé) échantillon
    MFIPC = l’IMF du contrôle positif
    IFMNC = l’IMF du contrôle négatif
  2. Pour déterminer la valeur50 d’un composé (c.-à-d., la concentration de composés qui peuvent réduire le signal fluorescent obligatoire de 50 %), appliquez la formule suivante :
    Equation 2
    Où :
    Logconc.2 = le journal d’une concentration du composé qui se traduit par moins de 50 % d’inhibition de la différence entre la valeur de l’IFM du PC et NC
    Logconc.1 = le journal d’une concentration du composé qui se traduit par plus de 50 % d’inhibition de la différence entre la valeur de l’IFM du PC et NC
    NOTE : Sinon, dans le cas de composés très actifs, une courbe dose-réponse couvrant plusieurs journaux de grandeur peut être générée basé sur l’IMF correspondant à chaque concentration d’essai du composé. En appliquant l’ajustement de courbe de régression non linéaire à l’aide des logiciels appropriés (voir Table des matières et réactifs), valeurs50 IC peuvent alors déduire les courbes générées. Un exemple de cette approche de l’analyse est illustré à la Figure 3.

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Representative Results

Le déroulement général de l’essai de liaison est présenté dans la Figure 1 a. Une illustration du type de données de cytométrie en flux obtenus pour des types d’échantillons différents dans une expérience standard (c'est-à-dire le contrôle négatif, contrôle positif et échantillon expérimental) est représentée dans la Figure 1 bet un schéma possible pour effectuer le dosage dans un format de plaque à 96 puits est donné en Figure 1. L’incubation des cellules Jurkat, qui endogène expriment le récepteur de chimiokine CXCR4 (c.-à-d. la GRCP d’intérêt dans cet essai), avec l’augmentation des quantités de CXCL12 fluorescent étiquetés (c.-à-d. CXCL12AF647) a donné lieu dans a augmenté niveaux de fluorescence (Figure 2), reflétant des niveaux accrus de liaison du ligand à CXCR4. Pour illustrer la récepteur-spécificité de liaison CXCL12AF647 , un bien établi et axée sur les récepteurs CXCR4 antagoniste (la petite molécule AMD3100) a été utilisé. Les cellules Jurkat ont été incubées tout d’abord pre avec une série de dilution de 1/5 de AMD3100 allant de 0,064 ng/mL à 1 000 ng/mL, suivie d’une incubation avec une concentration finale de 25 ng/mL CXCL12AF647 (c.-à-d. le montant forfaitaire de chimiokine étiquetée couramment utilisés dans le test). Ensuite, les cellules Jurkat ont été transformés comme décrit dans le protocole. Le signal fluorescent (la moyenne intensité de fluorescence, IFM) après l’addition de la quantité fixe de CXCL12AF647 aux cellules Jurkat pré-incubées, a été obtenue par analyse en cytométrie en flux pour tous les échantillons. Ce signal fluorescent pourrait presque être entièrement inhibé dans le cas où les cellules Jurkat ont été traités au préalable avec la plus forte concentration de AMD3100 (1 000 ng/mL). Dans ces conditions, le niveau inhibé de fluorescence a été seulement légèrement au-dessus du niveau de base correspondant au niveau d’autofluorescence des cellules Jurkat. En conclusion, application de 25 ng/mL (concentration finale) de CXCL12AF647 dans l’essai de liaison généré une fenêtre grand signal fluorescent (comparativement au témoin négatif) avec un niveau résiduel minimal du récepteur non spécifique liant ( Figure 3 a).

Cet essai de liaison a été utilisé principalement pour dépister les composés qui perturbent la liaison du ligand dans panneaux de composés non étiquetés à une seule concentration fixe, ou pour étudier l’effet de dose-dépendante des composés actifs. Dans ce dernier cas, l’objectif est d’obtenir des valeurs50 IC (c.-à-d., la concentration du composé qui inhibe la liaison signal de 50 %), qui reflètent la puissance de la fixation des composés. La figure 3 illustre comment les données de cytométrie en flux obtenues avec cet essai de liaison peuvent servir à déterminer la puissance inhibitrice (en termes de IC50) de petites molécules perturber la liaison de CXCL12 à CXCR4. Basé sur l’inhibition dose-dépendante de la liaison CXCL12AF647 de AMD3100, la valeur50 a été déterminée ici en appliquant une analyse de régression non linéaire. Dans cet exemple, la valeur calculée pour AMD310050 correspond à 18,12 ng/mL. Parce que lors de campagnes de dépistage, la plupart des composés choisis au hasard est censée ne pas inhiber la liaison de CXCL12AF647 à CXCR4+ Jurkat cells, un exemple d’un inactif composé fait également partie de cette étude. Ici, le maraviroc de petites molécules, qui présente une puissante activité anti-VIH-1 en agissant comme un antagoniste spécifique du récepteur de chimiokine CC 5 (CCR5)27, a été testé dans l’essai de liaison. Aucune inhibition du signal liaison fluorescent maximale a été détectée après que incubation des cellules Jurkat avec maravoric, même à la plus forte concentration testée (100 ng/mL ; Figure 3 b). Dans la même expérience, une série de dilutions de AMD11070, une autre petite molécule liée à AMD3100, mais avec des propriétés pharmacocinétiques améliorées28, a été incluse. À la différence de maraviroc, une série de la dilution au 1/5 de AMD11070 allant de 0.0064 à 100 ng/mL, clairement et de manière dose-dépendante inhibent la liaison CXCL12AF647 (Figure 3 b).

Figure 1
Figure 1 : vue d’ensemble du workflow et illustration du type de données obtenues à. (A). les principales étapes du protocole sont schématisées pour les échantillons témoins positifs et négatifs et les échantillons traités composé. Les échantillons sans composé pré-incubation et sans ajout de chimiokine fluorescent étiqueté (CXCL12AF647) sont inclus pour déterminer la fluorescence de fond (auto) (échantillons de contrôle négatif). Les échantillons sans pré-incubation composée, mais avec l’addition d’une quantité fixe de CXCL12AF647 servent à déterminer le signal de liaison maximale lors de l’essai (échantillons de contrôle positif). Dans les échantillons traités composé, les cellules sont préalablement incubées avec composé avant l’addition d’une quantité fixe de CXCL12AF647. (B). le signal de liaison fluorescent moyenne est déterminé par analyse en cytométrie en flux des cellules Jurkat. De tous les événements (par exemple, les cellules Jurkat) analysés (panneau gauche) seulement le signal fluorescent d’une gated sous-population de cellules est utilisé pour une analyse ultérieure (panneau central). La pré-incubation des cellules avec des petites molécules (par exemple, AMD3100) inhibe la liaison du ligand du récepteur fluorescent étiquetés et cela permettra de réduire le signal de liaison maximale (panneau de droite, montré une représentation de l’histogramme). (C). un schéma possible lorsque vous effectuez le test de liaison compétitive dans un format de plaque à 96 puits. Dans ce cas, six différents composés (cpd 1 - 6) sont testés dans une série de dilutions de 1/5 (en double) allant de 1 000 nM à 0,32 nM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : La liaison de CXCL12AF647 aux cellules Jurkat. Les cellules Jurkat ont été incubées avec l’augmentation des quantités de CXCL12AF647, en absence d’incubation préalable avec le composé. La fluorescence de moyenne intensité (IFM, exprimées en unités arbitraires de lumière) ± écart-type est montré (n = 2). Ajustement de courbe a été effectuée à l’aide de la régression non linéaire en utilisant un modèle de fixation totale d’un site suivant l’équation

Equation 3

avec Bmax (liaison spécifique maximale) = 18 345 ; Kd = 92.8 ng/mL ; NS (la pente de liaison non spécifique) = 2.139 ; et fond = 332,6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Inhibition de la liaison de CXCL12AF647 par des composés actifs et inactifs. (A) Dose-dépendante l’inhibition de la liaison de CXCL12AF647 en incubant les cellules avec des concentrations croissantes de AMD3100, avant l’addition de 25 ng/mL CXCL12AF647. Note que la maximale inhibée intensité de fluorescence moyenne (IFM, exprimées en unités arbitraires de lumière) est toujours légèrement au-dessus de la fluorescence de fond (auto) obtenue pour les cellules Jurkat (moyenne ± écart-type (n = 3)). Ajustement de courbe a été effectuée par régression non linéaire avec une pente variable (quatre paramètres) selon

Equation 4

Ici les pentes est 1.313 et le calculé ci50 18,12 ng/mL. (B). effet Dose-dépendant de la AMD11070 et le maraviroc sur CXCL12AF647 liaison à CXCR4+ Jurkat cellules (± écart-type de la MFI (n = 3)). Courbe de la réponse de AMD11070 a été réalisée de la même façon, avec une pente de 1,458 et une valeur calculée de50 IC 0.9052 ng/ml. Pour la réponse de maraviroc, aucun raccord a été réalisée étant donné l’absence d’activité de ce composé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Par rapport à d’autres types d’essais de liaison (c.-à-d., liaison de saturation et des expériences de cinétique de fixation), analyses de liaison de compétition sont plus adaptés pour fins de présélection. En effet, ils permettent l’évaluation de grandes quantités de composés sans étiquette, par exemple de petites molécules, en marquant leur capacité d’interférer avec la fixation d’un montant fixe d’un ligand du récepteur marqué. Composés qui se lient à d’autres sites récepteurs que le ligand étiqueté pourraient rester inaperçus lors de l’essai. Bien que l’expérience de liaison de la concurrence décrit ci-après se concentre sur le récepteur de chimiokine CXCR4 en particulier, il peut probablement servir comme un modèle pour la conception des essais de fixation de la concurrence pour autres RCPG ainsi. Par exemple, les récepteurs de chimiokines CXC 7 (CXCR7) a été décrite comme un récepteur alternatif de CXCL12, capable de liaison CXCL12 avec grande affinité29,,30. Par conséquent, la chimiokine même étiquetée (CXCL12AF647) comme utilisée pour le CXCR4 décrit analyse concurrence obligatoire peut être utilisé pour mettre en place des expériences de liaison CXCR7. CXCR4 et CXCR7 partager CXCL12 comme un ligand commun, il serait important de travailler sur des modèles cellulaires dans laquelle seul un des deux récepteurs est exprimé à la surface cellulaire, afin d’évaluer la liaison aux récepteurs spécifiques. Nos travaux antérieurs a montré que les cellules Jurkat ne montrent pas d’expression endogène de CXCR717. Ainsi, dans l’analyse décrite ici pour CXCR4, interférence avec liaison au CXCR7 est exclue.

Les principales fonctionnalités de l’essai de liaison concurrence permettent qu’il soit utilisé comme une rapide, initiale, outil pour identifier les petites molécules interférant avec l’agoniste liant aux CXCR4 dépistage. Un des avantages principaux de l’essai est l’utilisation de cellules entières, de vie exprimant le récepteur d’intérêt. Il omet la nécessité pour les préparations à forte main-d'oeuvre membrane cellulaire. En outre, le faible niveau de fluorescence de fond (auto) détecté par les cellules Jurkat est bénéfique. Ainsi que la fenêtre de grand signal obtenue lors de l’addition de la quantité définie de sonde couplée, elle contribue à un fond rapport signal favorable. Cela facilite la détection des potentiels inhibition de liaison par des composés non étiquetés. Dans le cas où cette analyse de liaison est réalisée avec d’autres cellules exprimant CXCR4, nous recommandons de toujours évaluer ces paramètres (fluorescence de fond, signal fenêtre) dès le départ car ils peuvent différer de la lignée cellulaire de la lignée cellulaire. Le fait que les cellules Jurkat expriment endogène CXCR4 à un niveau constant pendant de longues périodes, il rend un modèle cellulaire commode. Le même niveau cohérent de l’expression des récepteurs peut être obtenu avec des clones de cellules transfectées de façon stable. En revanche, nous ne recommandons pas l’utilisation de cellules transfectées transitoirement car ce provoquera vraisemblablement dans une beaucoup plus large répartition des intensités de fluorescence, moins de cellules sensibles dans l’analyse et moins de cohérence entre les expériences. Pas négatif de cellules Jurkat CXCR4 existent, spécificité de liaison aux récepteurs à ces cellules a été démontrée par incubation préalable avec les antagonistes des récepteurs spécifiques bien établie (AMD3100 et AMD11070). Ces antagonistes sont structurellement différentes de ligand étiqueté. Ceci est important car, lorsque vous utilisez la variante sans étiquette du ligand comme concurrent, ligand étiqueté et sans étiquette pourrait être également en concurrence pour se lier à des sites de fixation non spécifique potentiellement présentes à la surface cellulaire.

En dehors de l’hôte cellulaire, plusieurs autres aspects de l’essai décrit ici doivent être prises en considération avant de commencer à construire une analyse similaire pour les autres RCPG. sondes fluorescent étiquetés qui ciblent les RCPG ont été développées comme alternatives pour radioactifs sondes, mais n’est actuellement disponible pour un nombre limité des RCPG et ils sont relativement coûteux. En outre, modification des ligands des récepteurs naturels avec des fluorophores seraient susceptibles de modifier les propriétés de liaison par rapport à la molécule non étiquetées, surtout en cas de très petits ligands (p. ex. amines) ou de petits peptides31, 32. par exemple, dans le cas de petits ligands, un linker est généralement tenu pour séparer le pharmacophore le fluorophore pour permettre l’accès à l’orthosteric du récepteur de la liaison de site31. Aussi, la stabilité de la sonde fluorescente récepteur complexe doit être pris en compte. Dans notre expérience, après 90-120 minutes (c.-à-d. le temps nécessaire pour faire fonctionner deux plaques à 96 puits consécutives), l’intensité de fluorescence moyenne pour les puits de contrôle positif en général est divisée par environ 5 % par rapport à la moyenne de tous les puits de contrôle positif sur le plaque, avec des valeurs aberrantes occasionnels entre 5 et 10 %.

En outre, l’activité intrinsèque du ligand étiquetée est important. Alors que les antagonistes des récepteurs n’affichent aucune activité intrinsèque sur le récepteur, probablement marqués agonistes induisent l’activation des récepteurs et, par conséquent, internalisation du récepteur. Ce qui compromet le caractère réversible de l' interaction de ligand-récepteur33. Pour réduire au minimum possible les questions à une internalisation du récepteur, d’incubation avec le ligand marqué (dans le cas d’un agoniste marqué) doivent être limitées dans le temps et préférentiellement devraient être réalisées à température ambiante ou inférieure. Le fait que la procédure est effectuée à la température ambiante, le dosage aussi commode et plus compatible avec les efforts dans le format de la plaque de contrôle. Enfin, un nombre suffisant de cellules par échantillon (par exemple, 250 000 / puits d’une plaque de 96 puits) devrait servir dans l’essai à conserver en fin de compte un nombre suffisant de cellules (20 000 cellules, « événements, seul » basé sur le déclenchement de la population de cellules entières ; Voir La figure 1) pour l’analyse en cytométrie en flux. En utilisant moins de cellules rendrait plus difficile d’atteindre systématiquement ce nombre de cellules analysées, ce qui pourrait compromettre la fiabilité de la lecture. En utilisant moins de cellules par échantillon (/ puits) augmenterait aussi l’intervalle de temps nécessaire pour analyser l’échantillon par cytométrie en flux et augmente ainsi le temps d’analyser une plaque 96 puits ensemble. Ce qui compromet un débit plus élevé. Pour la raison précitée, future miniaturisation du dosage pourrait donc tourner hors ne pas d’être une tâche triviale.

Pris ensemble, une analyse obligatoire de la concurrence qui est principalement utilisée dans notre laboratoire comme outil de dépistage pour identifier les petites molécules qui peuvent rivaliser avec un montant fixe de CXCL12 marqués pour la liaison à CXCR4 a été décrite en détail. Ces études de liaison sont intéressants car ils sont une méthode relativement simple et rapide d’identifier les composés susceptibles de liaison aux récepteurs. Bien que l’identification de composés ayant la capacité de reliure est déjà valable en soi, ce type de test ne fournit pas d’informations sur l’activité des composés identifiés. Par conséquent, il demeure nécessaire valider et caractériser leur activité agoniste ou antagoniste potentielle dans d’autres essais de récepteurs pharmacologiques et fonctionnelle. D’intérêt, dans le cas de CXCR4, il a été démontré que les antagonistes des récepteurs qui montrent une activité accrue dans l’essai de liaison (c'est-à-dire, qui génèrent de faibles valeurs de50 IC pour l’inhibition de la liaison) effectuent relativement mieux dans l’autre fonctionnel CXCR4 liés tests ainsi17.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier Eric Fonteyn excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la KU Leuven (subvention no. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, grant no. G.485.08) et la Fondation Dormeur Vaduz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArray Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad Prism Graphpad software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJo FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELL Beckman Coulter Not applicable cell viability analyzer
Sigma 3-18 KS Sigma Not applicable centrifuge
AMD3100 Sigma A5602-5mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc Pfizer antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647) ALMAC CAF-11-B-01 fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Jurkat cells ATCC
Reagent reservoir PP Sigma BR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES Thermo Scientific 566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear Thermo Scientific 611U96
Falcon tubes, 50ml Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024

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References

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Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4. J. Vis. Exp. (133), e57271, doi:10.3791/57271 (2018).

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