Summary
Поток, описал сотовой привязку на основе цитометрии пробирного, который используется главным образом как инструмент скрининга для выявления соединений, которые тормозят привязки дневно обозначенные КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12) КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4).
Abstract
Фармакологических ориентации G белок рецепторы (GPCR) имеет большое значение для здоровья человека, как дисфункциональные GPCR-опосредованной сигнализации способствует прогрессированию многих заболеваний. Лиганд/рецептор пара КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12) / КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4) вызвало значительный клинический интерес, например, как потенциальной мишенью для лечения рака и воспалительных заболеваний. Малые молекулы, а также терапевтических антител, которые конкретно нацелены CXCR4 и препятствовать рецепторов функция поэтому считается ценным фармакологическим инструменты. Здесь описан поток на основе цитометрии сотовой assay который позволяет идентификации соединений (например, малых молекул), которые отменить привязку CXCR4, CXCL12. По существу assay полагается на конкурс на рецептор, привязки между фиксированное количество дневно обозначенные CXCL12, естественный хемокиновых агониста для CXCR4 и немеченого соединения. Следовательно в этот assay избегать нежелательных использования радиоактивно помечены зондов. Кроме того живые клетки используются в качестве источника рецептор (CXCR4) вместо препаратов для клеточной мембраны. Это позволяет легко адаптация assay пластины формат, который увеличивает пропускную способность. Этот assay было показано, быть ценным дженериков пробирного обнаружения для определения ориентации CXCR4 соединений. Этот протокол может вероятно быть адаптированы для других GPCR, по крайней мере если дневно обозначенные ligands доступны или могут быть созданы. Не требуется предварительного знания, касающиеся внутриклеточных сигнальных путей, которые индуцированных после активации этих GPCR.
Introduction
Белок-рецепторы G (GPCR) белков на поверхности клеток, которые могут быть активированы внеклеточных лигандов (например, пептиды, белки гормонов, амины), тем самым регулирующих многие физиологические и развития процессов1. Когда агонист занимает его карман привязки GPCR, индуцированная конформационные изменения в рецептор белков способствует привязки внутриклеточных гетеротримерные рецептор связанные G белков, состоящий из Gα- ВВП и Gβγ подразделений. Последующего обмена GTP ВВП по итогам Субблокα G в диссоциации субблоков протеина G (α-GTP, G и Gβγ) которые, в свою очередь, далее будет инициировать вниз по течению сигнальные пути2,3. Когда становится гидролизованный Gα-GTP, повторное объединение Gα- ВВП и Gβγ подразделений будет конвертировать G-белок обратно в его упокоения государства3,4. Различных типов G белков существует (Gs, Gввода-вывода, Gq, G12/13), которые классифицируются на основе последовательности сходство с Gα Субблок5. Все из этих белков G вызывают определенные внутриклеточных сигнальных путей, которые лежат в основе биологической реакции активации рецептора. После активации рецептора GPCR киназ (GRK) фосфорилировать хвост внутриклеточный GPCR, способствуя тем самым взаимодействие с β-arrestins. Этот процесс приводит к прекращению сигнализации, рецептор десенсибилизация и интернализации6G-белка. Β-arrestins, также являются частью мульти молекулярных комплексов, что триггер сигнализации каскады независимо от сигнализации7G-белка.
GPCR находятся среди самых проверенных молекулярным мишеням для терапевтического вмешательства, как дерегулирование GPCR-опосредованной сигнализации, например из-за усиления функции мутации гена рецептора или Избыточная экспрессия рецепторов, способствует этиологию многих 8заболеваний человека. Таким образом GPCR представляют собой один из наиболее важных классов лекарственных препаратов, расследованных в фармацевтической промышленности8,9,10. Ярким примером клинически значимых GPCR является КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4), который может быть активирован единственным естественным лиганд, КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12)11. Из-за своей установившейся роль как основных ко-рецептор для вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1) вход и инфекции в кластер дифференцировки 4 (CD4) позитивные Т-лимфоциты12, CXCR4 впервые исследованы как цель противовирусным препаратам. CXCL12-CXCR4 взаимодействия в костном мозге далее регулирует сохранение и самонаведения стволовых и прогениторных клеток13. Кроме того учитывая его участие во многих аспектах рака биологии (например, выживание клетки опухоли, метастазы, ангиогенез опухоли связанных)14 и несколько других заболеваний человека (например, воспалительные заболевания)15, CXCR4 поднял значительный интерес как перспективные цели для обнаружения наркотиков. AMD3100, малые молекулы, специально предназначенном CXCR4, был первоначально обнаружен как препарат против ВИЧ кандидат16 и по-прежнему является одним из самых мощных антагонистов CXCR4, описал Дата17. Его развития как противовирусных препаратов, однако, было прекращено18. В настоящее время эта молекула используется как средство мобилизации стволовых клеток при лечении лимфомы и множественной миеломы пациентов18. Несколько других химически связанных малых молекул и биопрепаратов, которые препятствуют CXCR4 функция с различной потенции были описаны19.
Методы связывания рецептора являются ценными инструментами в области фармакологии, которые позволяют идентифицировать соединений (например, малых молекул), которые непосредственно взаимодействуют с GPCR интерес. Чтобы выполнить связывание исследования, нет необходимости для предварительных знаний о внутриклеточной сигнализации свойства или функциональность данного GPCR. Хотя это может рассматриваться как преимущество, это означает, что соединений, для которых рецептор может быть продемонстрирована привязки должны характеризоваться дальнейшей оценки их потенциального агонистических или антагонистических деятельности. Эта деятельность может оцениваться с использованием фармакологических или биологических анализов, связанных с GPCR изучается. В зависимости от профиля их деятельности, связывания молекулы рецептор может затем потенциально развиваться, чтобы стать соединений Роман свинца для расследования в доклинических и клинических исследований. Молекулы, которые конкретно связать рецептора с высоким сродством может также служить в качестве подмости для создания терапевтических или диагностических инструментов, например, radiolabeling их для неинвазивной в vivo изображений опухолевых клеток20, или потенциал транспортные средства для доставки целевых терапии21. В случае CXCR4 в естественных условиях изображений опухолевых клеток уже была продемонстрирована с помощью мыши модели которой помечены CXCR4 ориентации молекул позволило визуализация человека рак ксенотрасплантатов20,22,23 .
В настоящем докладе мы описываем подробный протокол assay конкуренции привязки, который позволяет идентифицировать малых молекул и биопрепаратов, которая непосредственно вмешиваться агонистов (CXCL12) обязательный CXCR4. Основной принцип анализа является конкуренция между фиксированное количество дневно обозначенные лиганда (CXCL12AF647, см. таблицу материалов и реагентов) и без маркировки соединений для связывания с белком рецептор17, 24. конкретные флуоресцентные сигнал от помечены лиганд, привязаны к одной клетки, выражая CXCR4 затем анализируются проточной цитометрии. Этот флуоресцентного сигнала будет снижена когда немеченого малых молекул нарушить взаимодействие между CXCL12AF647 и CXCR4. Assay использует не манипулировать живых клеток, которые эндогенно Экспресс CXCR4 (то есть, Jurkat клетки). Следовательно, требуется подготовка не клеточной мембраны, что делает assay, удобный, быстрый и совместимы с повышенной пропускной способностью. Поскольку используется дневно обозначенные лиганд, избегать радиоактивности.
Поскольку CXCL12 является естественным агониста для CXCR4, малые молекулы соединений, которые мешают CXCL12AF647 привязки в assay скорее всего взаимодействовать с сайт связывания рецептора orthosteric (т.е. сайт связывания оккупирована природных агонист). Молекулы, которые будут взаимодействовать с сайтов связывания рецептора топографически отличается от orthosteric привязки сайта остаются незамеченными, если они не влияют на привязки CXCL12. Например положительные и отрицательные аллостерический модуляторы, важных и возникающих Категория GPCR ориентации молекулы, действующие на аллостерический привязки сайтов25, будет потенциально не забрать с этот assay. Кроме того не может быть получены ли соединений, выявленных с этой функцией привязки пробирного как антагонисты рецепторов или как агонисты. Будет таким образом расследование выявленных соединений в дополнительных фармакологических или функциональных анализов, связанных с рецептором. Эти анализы могут включать (комбинация) сотовых флуоресценции или люминесценция-на основе анализов для выявления второй посыльных (например, Ca2 +, циклический аденозинмонофосфат (лагерь)), фенотипические или биологических анализов и β-arrestin набор анализов, выбор которых зависит от конкретных сигналов свойств GPCR изучается. Таким образом конкурентные привязки assay описанные здесь главным образом служит первоначальный отбор assay который необходимо дополнить другими на основе ячеек анализов для включения углубленная характеристика соединений с потенцией связывания рецептора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. поддержание культуры клеток
Примечание: Все шаги, описанные в разделе 1 и 2 проводятся в стерильных условиях в поток Ламинарный шкаф.
- Рост клеток в колбах T75 культуры при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.
Примечание: В этот assay, используются Jurkat клетки (т.е. человеческой лейкозных лимфоцитов T которые эндогенно Экспресс CXCR417). Выражение CXCR4 на клеточной поверхности должны оцениваться на протяжении культивирования клеток с помощью проточной цитометрии. Описание потока цитометрии процедуры и реагентов для определения уровни выражения рецептором на поверхности клетки, однако, не входит в сферу действия этого протокола, но было описано ранее17. - Пусть Jurkat клетки растут в суспензии, пока они не достигают 80-85% confluency. Прежде чем пассированый клетки Роман колбу, разрешить все реагенты до комнатной температуры (RT).
- Добавьте 20 мл свежего полный рост средних (RPMI 1640 средний, 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), глютамин 2 мм) роман T75 культуры колбу.
- Добавьте 5 мл суспензии клеток Jurkat от оригинального T75 колбу (содержащие 25 мл суспензии клеток) роман T75 культуры колбу. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.
2. Подготовка CXCL12, Assay Buffer, и Jurkat клетки для участия в конкурсе привязки Assay.
- Подготовьте Стоковый раствор CXCL12AF647 (20 мкг/мл; см. таблицу материалы и реагенты), растворяя лиофилизированные реагента (температуре-80 ° C, в темноте) в ультрачистая вода, дополнена 0,01% (объем/объем) Полисорбат 20. Храните одноразовые аликвоты от этого Стоковый раствор на-80 ° C, защищать от света.
- Подготовьте аналитический буфер путем добавления 40 мл HEPES (1 М, 20 мм окончательный концентрация) 200 мл Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS, 10 x, без фенола красного и бикарбонат натрия, 1 x конечная концентрация). Добавить ультрачистая вода получить окончательный объем 2 л добавить 4 g (0,2% вес/объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА), и распустить BSA через магнитные помешивая. Наконец, скорректировать рН 7,4 (для этого используйте NaOH) и фильтрации раствор через 0,2 мкм поры (см. таблицу материалов и реагентов) с помощью вакуумного коллектора.
Примечание: Этот assay буфер будет использоваться во всех дальнейших шагах протокола. - Подсчет числа и жизнеспособность клеток. Для этого взять образец клеток подвеска и развести его в-фосфатный буфер (PBS).
Примечание: Мы регулярно использовать анализатор жизнеспособности автоматизированных клеток (см. таблицу материалов и реагентов) способны подсчета клеточных суспензий в различных концентрациях. Для подсчета клеток, разбавляют 0,5 мл суспензии клеток в 1,5 мл PBS (возможны также другие разведений, например, 0.1 мл в 1.9 мл PBS,). Использование этого метода, который основан на методе исключения Трипановый синий краситель, было описано ранее,26. Для подсчета количества клеток и жизнеспособности, которое должно работать одинаково хорошо коммерчески доступны несколько других устройств. - Собрать нужное количество клеток (т.е. ~ 24 x 106 клеток для запуска анализа с одной полной тарелкой 96-луночных) в стерильных 50 мл трубки центрифугированием (см. таблицу материалов и реагентов для типа центрифуги) на 400 g x 5 мин на RT.
- Осторожно слить супернатант не нарушая Пелле ячейки. Добавить свежие аналитического буфера (например, 20 мл) и Ресуспензируйте клетки, нежно закупорить вверх и вниз.
- Центрифуга клетки снова на 400 g x 5 мин на RT.
- Слить супернатант снова и Ресуспензируйте Пелле клеток в свежих пробирного буфер для получения плотности тарелок 5 x 106 клеток/мл.
3. конкурс привязки Assay
Примечание: Фактической конкуренции привязки выполняется на RT и могут быть выполнены в нестерильных условиях.
- Ослабить соединения под следствием в assay buffer (см. 2.2), для получения желаемой концентрации. Либо подготовить фиксированной концентрации комплекса для первоначальной проверки (например, 10 мкм конечная концентрация) или, альтернативно, серию последовательных разрежения концентрации более подробная характеристика соединений (например, 1/3, 1/4 или 1 / 5 Разведение серии начиная 1 мкм, конечная концентрация). Имейте в виду, что составные решения в конечном счете станет 2 x, разбавленным в пробы; Таким образом подготовьте 2 x концентрированный раствор.
- Лунки 100 мкл составные решения (в основном 2 x) в четкой 96-луночных вокруг нижней плиты (см. таблицу материалов и реагентов) согласно предварительно определенных экспериментальным лежали вне (например, Рисунок 1 c).
Примечание: На данном этапе, отрицательных и положительных контрольных образцов включены в assay. В Пример отрицательного контроля100 мкл аналитического буфера вместо соединения добавляется скважин 96-луночных пластины. Для позитивного управления образцапробирного буфера также добавляется во время этого шага. Смотрите также фигура 1 c для типичной экспериментальной макета, в котором проверяется ряд разбавление несколько соединений. - Добавьте 50 мкл суспензии клеток (см. 2.7; 0,25 х 106 клеток) от водохранилища реагента в 96-луночных пластину с помощью многоканальных дозаторов. Инкубируйте пластину для 15 мин на RT в темноте.
- Добавьте 50 мкл дневно обозначенные CXCL12 (т.е., 100 нг/мл CXCL12AF647 в Пробирной буфера, 4 x, в основном, 25 нг/мл конечная концентрация) от аналогичных водохранилище реагента к добрам плиты 96-луночных. Инкубируйте 30 мин на RT в темноте.
Примечание: Для отрицательных контрольных образцов, вместо этого добавьте аналитического буфера. Следовательно флуоресцентный сигнал обнаружен в образцах отрицательный контроль будет соответствовать autofluorescent фонового сигнала (рис. 1A). Для положительных контрольных образцовдобавьте 50 мкл/ну CXCL12AF647. Положительный контроль образцов даст максимальную флуоресценции сигнал обнаружен, так как не потенциальных ингибирования предварительной инкубации с соединениями был включен (рис. 1A). - Центрифуга 96-луночных пластины на 400 g x 5 мин на RT. удалить супернатант из гранулированного клеток, перевернув пластину. Сухие пластины на ткани.
- Добавьте 200 мкл свежие аналитического буфера из водохранилища реагент для скважин с помощью многоканальных дозаторов. Немедленно.
- Центрифуга пластину снова за 5 мин на 400 x g на RT. удалить супернатант, перевернув пластину и снова сушить на ткани.
- Нежно ресуспензируйте Пелле клеток в 200 мкл параформальдегида 1% растворенных в PBS. Этот шаг будет исправить клетки.
- Продолжать протокола сразу с количественной оценке флуоресцентным проточной цитометрии.
4. Анализ образцов подачей cytometry
CXCL12AF647 окрашенных и зацикленная клетки теперь готовы быть проанализированы с помощью проточной цитометрии. Можно использовать несколько типов потока цитофлуориметрами, но они должны быть оборудованы с правильным лазер (т.е., красный лазер, возбуждения диапазон ~ 630 Нм) для возбуждения и соответствующих фильтров для обнаружения Флюорофор (выбросов фильтры ~ 660 нм). Они должны быть способны обработки образцов в формате 96-луночных пластины. В таблице материалы и реагентыприводятся примеры подходящий поток цитометрии устройств.
- Запустите устройство и откройте соответствующее программное обеспечение (см. таблицу материалы и реагенты).
- Выберите следующие параметры сотовой для отображения в формате блот точка: вперед точечной (FSC), стороны точечной (SSC) и каналом обнаружения Флюорофор (CXCL12AF647).
Примечание: С параметром FSC, клетки подвергаются дискриминации на основании их размера, так как обнаруженные поглощения света пропорциональна диаметр ячеек. Параметр SSC, измерения рассеяния света под углом в 90°, предоставляет сведения о гранулярность клеток. - Выберите один из образцов (например, образец отрицательный контроль) для выполнения стробирования определенных однородных клеток населения на основе параметров FSC и SSC.
- Выберите Автоматический впрыск ~ 100 мкл зацикленная клеток из примера отрицательный контроль в проточный цитометр. Выберите параметр «смешение» перед инъекцией и использовать скорость потока образца 1,5 мкл/сек.
- Запустить этот образец, выбрав «Приобретение данных». FSC и SSC параметров для данного образца теперь появится на экране.
- Выберите стробирования инструмент программного обеспечения. Основываясь на FSC и SSC точка блот визуализации, предварительно определите однородных и жизнеспособных клеток населения стробирования. Чтобы сделать это, создайте многоугольник (с помощью программного обеспечения стробирования инструмента), включающий содержанием однородно распределенных единичных клеток («события»), на основании этих двух аспектов.
Примечание: Стробирования процедура призвана определить однородных и жизнеспособных клеток населения, который будет использоваться для дальнейшего анализа. Стробирования основывается на предположении о том, что большинство жизнеспособных клеток образуют однородные клетки населения на основе параметров FSC и SSC. Выполняя этот шаг, сотовой мусора, мертвые клетки и клетки агрегатов во многом могут быть исключены из дальнейшего анализа. Иллюстрация стробирования процесса приводится на рисунке 1B.
- Выберите, чтобы анализировать 20 000 «события» (то есть, отдельные ячейки) на сэмпл.
Примечание: Это означает, что для каждого образца, 20000 клетки, которые входят в заранее определенных ворот в конечном итоге быть проанализированы. Получение данных для каждого образца будет продолжаться, пока это количество событий анализируется. - Начало выполнения (выберите «запись данных»). Устройства цитометрии потока теперь будет анализировать все образцы один в 1 запись означает флуоресценции интенсивности (МФО) для каждого образца. Этот МФО соответствует средней флуоресцентные сигнал, соответствующий 20000 клетки, которые входят в заранее определенных ворот.
5. анализ данных
Для выполнения все дальнейшие вычисления используйте МФО, полученные для каждого образца. Анализ потока данных цитометрии могут выполняться несколькими пакетами коммерчески доступного программного обеспечения (см. таблицу материалы и реагенты).
- Чтобы определить процент ингибирование флуоресцентные привязки сигнал, в результате соединения предварительной инкубации, примените следующую формулу:
Где:
МФОExp = МФО экспериментальных (= соединение лечение) образец
МФОPC = МФО положительный контроль
МФОNC = МФО отрицательный контроль - Чтобы определить значение50 соединения (т.е., концентрация соединения, которые могут уменьшить сигнал флуоресцентные привязки на 50%), примените следующую формулу:
Где:
Журналconc.2 = журнал концентрации смеси, что приводит к менее чем 50% ингибирования разницы между МФО значение PC и NC
Журналconc.1 = журнал концентрации смеси, что приводит к более чем 50% ингибирования разницы между МФО значение PC и NC
Примечание: в качестве альтернативы, в случае весьма активных соединений, кривая доза реакция, охватывающих несколько журналов величины могут быть созданы на основании МФО, соответствующий каждой опытах концентрации комплекса. Путем применения нелинейной регрессии кривой с использованием соответствующего программного обеспечения (см. таблицу материалы и реагенты), IC50 значения затем может вытекать из созданного кривых. На рисунке 3приведен пример этого анализа подхода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий рабочий процесс привязки анализа представлена на рисунке 1A. Иллюстрации типа потока цитометрии данных, полученных для различных образцов типов в стандартный эксперимент (т.е. отрицательный контроль, положительный контроль и экспериментальный образец) изображен Рисунок 1Bи макет можно пластины для выполнения assay в формат 96-луночных пластины приводится в Рисунок 1 c. Инкубационный Jurkat клеток, которые эндогенно Экспресс хемокиновых рецепторов CXCR4 (т.е., GPCR интерес в этот assay), с увеличением количества дневно обозначенные CXCL12 (т.е. CXCL12AF647) привела в увеличилась уровни флюоресценции (рис. 2), что отражает увеличение уровней Связывание лиганда с CXCR4. Чтобы продемонстрировать рецептор специфика CXCL12AF647 привязки, был использован устоявшихся и рецептор конкретных CXCR4 антагонист (малые молекулы AMD3100). Jurkat клетки инкубировали сначала предварительно с серией разбавления 1/5 AMD3100 от 0,064 нг/мл до 1000 нг/мл, после инкубации с конечной концентрации 25 нг/мл CXCL12AF647 (т.е., фиксированное количество помечены хемокиновых обычно используется в assay). Затем Jurkat клетки были дополнительно обработаны, как описано в протоколе. Флуоресцентного сигнала (средней интенсивности флуоресценции, MFI) после добавления фиксированное количество CXCL12AF647 предварительно инкубирован Jurkat клеток, был получен путем анализа цитометрия потоков для всех образцов. Этот флуоресцентного сигнала может почти быть полностью тормозится в случае Jurkat клетки были предварительно обработаны с высокой концентрацией AMD3100 (1000 нг/мл). При этом условии, ингибированная уровень флуоресценции был лишь слегка выше уровень фона, соответствующий уровню аутофлюоресценция для Jurkat клеток. В заключение применяя 25 нг/мл (конечная концентрация) CXCL12AF647 в assay привязки создается окно большой флуоресцентный сигнал (по сравнению с отрицательного контроля) с минимальной остаточной уровнем неспецифической рецептора привязки ( Рисунок 3A).
Этот assay привязки главным образом был использован для экрана для соединений, нарушая лигандом привязки в панелях немеченого соединения на одной фиксированной концентрации, или для изучения дозозависимый эффект активных соединений. В последнем случае цель – получить IC50 значений (т.е., концентрация соединения, который подавляет сигнал привязки на 50%), которые отражают привязки потенции соединений. Рисунок 3 показывает, как поток цитометрии данные, полученные с этой привязки assay может использоваться для определения ингибирующее потенции (с точки зрения IC50) малых молекул, нарушая привязки CXCL12 CXCR4. Основываясь на ингибирование дозозависимый привязки CXCL12AF647 AMD3100, значение50 определяется здесь-регрессионный анализ. В этом примере вычисленное значение50 IC для AMD3100 соответствует 18.12 нг/мл. Потому что в скрининг кампаний, большинство из случайно выбранных соединений ожидается не подавляют привязки CXCL12AF647 CXCR4+ Jurkat клеток, пример неактивные соединения была также включена в этом исследовании. Здесь малые молекулы маравирок, который обладает мощным анти-ВИЧ-1 деятельность, действуя как специфический антагонист для CC хемокиновых рецепторов 5 (CCR5)27, был испытан в assay привязки. Не торможение максимальной флуоресцентные привязки сигнал был обнаружен после предварительной инкубации клеток Jurkat с maravoric, даже на самую высокую концентрацию испытания (100 нг/мл; Рисунок 3B). В том же эксперименте последовательного растворения серии AMD11070, другой малые молекулы, связанные с AMD3100, но улучшенные фармакокинетические свойства28, был включен. В отличие от Маравирок разбавления 1/5 из серии AMD11070 от 0.0064 до 100 нг/мл, четко и доза зависим тормозится CXCL12AF647 привязки (рис. 3B).
Рисунок 1: обзор рабочего процесса и иллюстрации типа данных, полученных. (A). Основные этапы протокола схематизируются для отрицательных и положительных контрольных образцов и лечение сложных образцов. Определить фон (auto) флуоресцирования (отрицательный контроль образцов) включены образцы без соединения предварительной инкубации и без добавления дневно обозначенные хемокиновых (CXCL12AF647). Образцы без соединения предварительной инкубации, но с добавлением фиксированное количество CXCL12AF647 используются для определения максимальной привязки сигнал в assay (положительный контроль образцов). В комплексе лечение образцах клетки предварительно инкубируют с смеси перед добавлением фиксированного количества CXCL12AF647. (B). среднее флуоресцентные привязки сигнал определяется поток cytometry анализ Jurkat клеток. Из всех событий (то есть, Jurkat клетки) проанализированы (левая панель) только флуоресцентного сигнала от закрытого субпопуляцию клеток используется для дальнейшего анализа (средняя группа). Предварительной инкубации клеток с малых молекул (например, AMD3100) ингибирует связывание лиганда дневно обозначенные рецептор и это уменьшит максимальной привязки сигнала (правая панель, показано представление гистограммы). (C). возможно пластины макет при выполнении анализа конкурентных привязки в формате 96-луночных пластины. В этом случае, шесть разных соединений (ДСП 1 - 6) проверяются в серию последовательных разбавления 1/5 (в двух экземплярах) начиная от 1000 Нм до 0,32 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Привязка CXCL12AF647 к Jurkat клеткам. Jurkat клетки инкубировали с увеличением количества CXCL12AF647, в отсутствие предварительной инкубации с соединением. Показано среднее флуоресценции интенсивности (MFI, выражается в произвольных легких единиц) ± SD (n = 2). Кривой была выполнена с помощью нелинейной регрессии с использованием модели привязки всего один сайта после уравнения
с BМакс (максимум конкретной привязки) = 18,345; K-d = 92,8 нг/мл; NS (наклон неспецифического связывания) = 2,139; и фон = 332.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Ингибирование привязки CXCL12AF647 активные и неактивные соединения. (A) дозозависимый ингибитирование CXCL12AF647 привязки путем предварительной инкубации клеток с увеличением концентрации AMD3100, перед добавлением 25 нг/мл CXCL12AF647. Обратите внимание, что максимальная препятствует среднее флуоресценции интенсивности (МРИ; выражается в произвольных легких единиц) это еще немного выше флуоресценции фон (auto), полученных для Jurkat клеток (означает ± SD (n = 3)). Кривой была выполнена с помощью нелинейной регрессии с переменной склон (четыре параметра) согласно
Здесь HillSlope 1,313 и рассчитанные IC50 -18.12 нг/мл. (B). дозозависимый эффект AMD11070 и Маравирок на привязку CXCR4 CXCL12AF647 + Jurkat клетки (МРИ ± SD (n = 3)). Кривой ответа AMD11070 была выполнена аналогично с HillSlope 1.458 и вычисляемым значением50 IC 0.9052 нг/мл. Маравирок ответа не установки была выполнена, учитывая отсутствие активности этого соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с другими типами привязки анализов (то есть, насыщенность привязки и кинетические привязки экспериментов), конкурс привязки анализов лучше всего подходит для целей проверки. Действительно они позволяют производить оценку больших партий немеченого соединения, например малые молекулы, набрав их возможность вмешиваться с привязкой фиксированное количество помечены рецептор лиганда. Соединений, которые связывают с других рецепторов, чем помечены лиганд может остаться незамеченным в assay. Хотя эксперимент привязки конкуренции описаного фокусируется на хемокиновых рецепторов CXCR4 в частности, он может вероятно служить основой для дизайна конкуренции привязки анализов для других GPCR. Например КЭС хемокиновых рецепторов 7 (CXCR7) был описан как альтернативный рецептор для CXCL12, способный связывание CXCL12 с высоким сродством29,30. Следовательно же надписью хемокиновых (CXCL12AF647) как используется для описанных CXCR4 пробирного конкуренции привязки может использоваться для настройки привязки CXCR7 экспериментов. Потому что CXCR4 и CXCR7 доля CXCL12 как общий лиганд, было бы важно для работы с сотовой модели, в которых выражается только один обоих рецепторов на поверхности клетки, чтобы оценить специфическим рецептором привязки. Наши предыдущие работы показал, что Jurkat клетки не показывать эндогенного выражение CXCR717. В assay, описанные здесь для CXCR4, таким образом, исключается вмешательство с привязкой к CXCR7.
Несколько ключевых функций анализа конкуренции привязки позволяют использовать как быстрый, первоначальный, скрининга инструмента для выявления мелких молекул, мешая агонист, привязка к CXCR4. Одним из ключевых преимуществ пробирного является использование всего, живых клеток, выражая рецептор интерес. Это исключает необходимость подготовки трудоемких клеточной мембраны. Кроме того низкий уровень флуоресценции фон (auto), с Jurkat клетки обнаружены выгодно. Вместе с окна большого сигнала, полученные после добавления определенное количество дневно обозначенные зонда он способствует благоприятный фон соотношение сигнал. Это облегчает обнаружение потенциальных привязки ингибирование немеченого соединения. В случае, если этой привязки генотипирования с другими клетками выражая CXCR4, мы рекомендуем всегда оценивать эти параметры (фон флуоресценции, окно сигнала) авансом, как они могут отличаться от клеточной линии до линии клеток. Тот факт, что Jurkat клетки эндогенно Экспресс CXCR4 на последовательной уровне более длительных периодов времени, делает его удобным сотовой модели. Же постоянный уровень экспрессии рецепторов могут быть получены с клонами стабильно transfected клеток. Напротив мы не рекомендуем использовать временно transfected клеток потому, что это воля вероятный результат в гораздо более широкое распределение интенсивности флуоресценции, меньше реагировать клеток в assay и меньше согласованности между экспериментами. Так как существует не CXCR4 отрицательные клетки Jurkat, специфика рецептор привязки для этих клеток была продемонстрирована предварительной инкубации с устоявшейся специфическим рецептором антагонистов (AMD3100 и AMD11070). Эти антагонисты структурно отличается от помечены лиганда. Это важно, потому что, при использовании немеченого вариант лиганд как конкурента, маркировку и непомеченного лиганд может также конкурировать для привязки сайтов связывания неспецифической потенциально присутствует на поверхности клеток.
Помимо сотовых хост, некоторые другие аспекты анализа описанных здесь нужно принимать во внимание прежде чем начать строить подобные пробирного для других GPCR. дневно обозначенные зонды, выполняемых GPCR были разработаны в качестве альтернативы для радиоактивных зонды, но в настоящее время доступны только для ограниченного числа GPCR, и они являются относительно дорогими. Кроме того модификация природных рецепторов лиганды с флуорофоров может изменить привязки свойства по сравнению с неподписанных родительского молекулы, особенно при очень малых лигандами (например, амины) или малые пептиды31, 32. Например, в случае небольших лигандов, компоновщик для обычно требуется отделить Фармакофор от Флюорофор, чтобы разрешить доступ к orthosteric рецептор привязки сайта31. Кроме того стабильность комплекс рецептор флуоресцентный зонд должен приниматься во внимание. По нашему опыту, после 90-120 минут (то есть, время, необходимое для запуска двух последовательных 96-луночных пластины), средней интенсивности флуоресценции для позитивного управления скважин обычно уменьшается на ~ 5% по сравнению с в среднем всех положительных контроля скважин на тарелка, с случайные промахи между 5 и 10%.
Кроме того внутренняя деятельность помечены лигандом имеет важное значение. В то время как антагонисты рецепторов отображать никакой внутренней деятельности на рецептор, помечены агонистов может побудить активации рецептора и, следовательно, рецептор интернализации. Это компрометирует обратимого характера взаимодействия лигандов рецепторов33. Чтобы свести к минимуму возможные проблемы с рецептором интернализации, инкубация с меткой лиганда (в случае помечены агонист) должны быть ограничены по времени и преференциально должно выполняться при комнатной температуре или ниже. Тот факт, что процедура выполняется при комнатной температуре делает assay также удобно и более совместимой с скрининг усилия в формат пластины. Наконец достаточное количество клеток на сэмпл (например, 250 000 за хорошо 96-луночных плиты) должны использоваться в assay, в конечном счете сохранить достаточное количество клеток (20 000 клеток, «единый события, «основанный на стробирования клеточных населения; см. Рисунок 1) для анализа потока цитометрии. Используя меньше клетки затруднило бы его последовательно достичь это количество анализируемого клеток, которые могут поставить под сомнение надежность чтения вне. Используя меньше клеток на сэмпл (за хорошо) будет также увеличить интервал времени, необходимых для анализа образца проточной цитометрии и таким образом увеличивает общее время для анализа всего 96-луночных пластины. Это компрометирует повысить пропускную способность. По причине вышеупомянутых будущего миниатюризации assay может превратиться в таким образом, чтобы не быть тривиальной задачей.
Вместе взятые, конкурс assay привязки, который используется главным образом в нашей лаборатории как инструмент скрининга для выявления мелких молекул, которые могут конкурировать с фиксированное количество помечены CXCL12 для привязки к CXCR4 были описаны подробно. Эти привязки исследования представляют интерес, поскольку они являются относительно быстрый и простой метод для выявления соединений, способных связывания рецептора. Хотя идентификации соединений с привязкой мощности ценно уже само по себе, этот тип анализа не предоставляют информацию о деятельности указанных соединений. Следовательно он по-прежнему необходимые для дальнейшей проверки и характеризуют их потенциальных агонистических или антагонистических активность в других фармакологических и функциональных рецептор анализов. Интерес в случае CXCR4, было показано, что антагонисты рецепторов, которые показывают увеличение активности в assay привязки (т.е., который генерирует низкие значения50 IC для привязки ингибирование) выполняют относительно лучше в других функциональных Связанных с CXCR4 assays также17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Фонтейн за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана ку Лёвен (Грант нет. PF/10/018), Фонд воор Wetenschappelijk институте (FWO, Грант нет. G.485.08) и Фонд Dormeur Вадуц.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
References
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
- Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
- Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
- Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
- Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
- Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
- De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
- Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
- Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
- Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
- Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).
