Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil
Summary
Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.
Abstract
Disfonksiyonel GPCR aracılı sinyalleşme birçok hastalığın ilerleme katkıda gibi farmakolojik G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) insan sağlığı için büyük önem hedefliyor. Ligand/reseptör çifti CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) / CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) yükseltti önemli klinik faiz, örneğin kanser ve inflamatuar hastalıkları tedavisi için potansiyel bir hedef olarak. Küçük moleküller yanı sıra özellikle CXCR4 hedef ve reseptör’ın işlevi inhibe terapötik antikorlar bu nedenle değerli farmakolojik araçlar olarak kabul edilir. Burada, CXCL12 bağlama CXCR4, iptal etmek bileşikler (Örneğin, küçük moleküller) tanımlaması sağlayan bir Akış Sitometresi tabanlı hücresel tahlil açıklanmıştır. Esasen, tahlil yarışma fluorescently etiketli CXCL12, doğal Kemokin agonist CXCR4 için sabit bir miktarda ve etiketsiz bileşikler arasında bağlama reseptör için kullanır. Bu nedenle, radioactively etiketli probları istenmeyen kullanımı bu tahlil önlenmiş olur. Ayrıca, canlı hücreler reseptör (CXCR4) hücre zarının ürünleri yerine kaynağı olarak kullanılır. Bu tahlil daha fazla işlem hacmi artar bir plaka biçimine kolay uyum sağlar. Bu Tahlil CXCR4 hedefleme bileşenleri tanımlamak için değerli jenerik ilaç keşif tahlil için gösterilmiştir. Protokol büyük olasılıkla en az fluorescently etiketli ligandlar kullanılabilir veya oluşturulabilir diğer GPCRs için adapte edilebilir. Bu GPCRs aktivasyonu indüklenen hücre içi sinyal yolları ile ilgili ön bilgi gerekli değildir.
Introduction
G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) hücre yüzey proteinler hücre dışı ligandlar (Örneğin, peptidler, protein hormonlar, aminler) tarafından etkinleştirilebilir, böylece birçok fizyolojik ve gelişimsel düzenleyen1işler. Ne zaman bir agonist onun GPCR bağlama cep kaplar, indüklenen konformasyonal değişim reseptör protein Gαoluşan bağlama hücre içi heterotrimeric G reseptör ilişkili proteinlerin teşvik – GSYİH ve Gβγ alt birimleri. GTP ki, buna karşılık, daha da aşağı başlatacaktır G protein alt (Gα-GTP ve Gβγ) ayrılma Gα alt birim sonuçlarında üzerinde sonraki exchange GSYİH için yolları2,3işaret. Gα-GTP hidrolize olur zaman yeniden Derneği Gα– GSYİH ve Gβγ alt birimleri gr protein geri onun istirahat devlet3,4dönüştürür. G proteinlerin farklı türleri (Gs, Gg/ç, Gq, G12/13) mevcut, hangi ile Gα alt birim5sıra benzerlik göre kategorize edilir. Tüm bu G protein reseptörü harekete geçirmek için biyolojik yanıt altında yatan tanımlı hücre içi sinyal yolları teşvik. Reseptör etkinleştirme sonraki GPCR kinaz (GRKs) GPCRs, böylece β-arrestins ile etkileşimi teşvik hücre içi kuyruğunun fazdan. Bu işlem sinyal, reseptör duyarsızlaştırma ve içselleştirilmesi6gr protein sona erdirilmesi için yol açar. Β-arrestins de çok moleküler komplekslerin tetikleyici sinyal7sinyal G protein bağımsız basamaklandırır parçasıdır.
Kuralsız GPCR aracılı, örneğin reseptör gen veya reseptör overexpression, işlev kazanç mutasyonların nedeniyle sinyal birçok nedenleri katkıda terapötik müdahale için en doğrulanmış moleküler hedefler arasında GPCRs şunlardır insan hastalıkları8. Bu nedenle, GPCRs ilaç endüstrisi8,9,10tarafından araştırıldı uyuşturucu hedeflerinden en önemli sınıflarından birini temsil eder. Bir kayda değer bir klinik GPCR CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4), bir tek doğal ligand, CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12)11tarafından etkinleştirilen örnektir. Kurulan olarak rolünü büyük bir co reseptör için insan immün yetmezlik virüsü 1 (HIV-1) nedeniyle giriş ve enfeksiyon kümedeki olumlu T-lenfositleri12, CXCR4 ilk bir antiviral ilaç hedef olarak araştırıldı farklılaşma 4 (CD4). CXCL12-CXCR4 etkileşim daha fazla kemik iliğinde tutma düzenleyen ve posta kök ve Dede13hücreleri. Ayrıca, birçok açıdan kanser biyoloji (Örneğin, tümör hücre survival, metastaz, tümör ile ilgili angiogenez)14 ve birkaç diğer insan hastalıkları (Örneğin, inflamatuar hastalıkları)15, CXCR4 onun tutulumu verilen faiz önemli ilaç keşfi için umut verici bir hedef olarak ortaya çıkar. AMD3100, özellikle CXCR4, hedefleyen bağlanabilecek küçük bir moleküldür başlangıçta bir Anti-HIV ilaç aday16 keşfedilmiştir ve hala tarihi17için açıklanan en güçlü CXCR4 antagonistleri biridir. Bir antiviral ilaç olduğu, ancak, onun gelişme18üretilmiyor. Şu anda bu molekül Multipl Miyelom ve lenfoma hastaları18tedavi sırasında bir kök hücre seferberlik ajan olarak kullanılır. Diğer çeşitli kimyasal olarak ilgisiz küçük moleküller ve CXCR4 işlevi ile değişen etki gücüne inhibe destekte açıklanan19olmuştur.
Reseptör bağlama yöntemleri, doğrudan etkileşim bileşikler (Örneğin, küçük moleküller) tanımlaması GPCR ilgi ile izin Farmakoloji değerli araçlardır. Bağlama çalışmaları gerçekleştirmek için hücre içi sinyal özellikleri veya belirli bir GPCR işlevselliğini hakkında ön bilgi için gerek yoktur. Her ne kadar bu bir avantaj olarak kabul, bu bileşikler hangi reseptör için bağlama göstermiş olabilir daha fazla potansiyel agonistik veya antagonistik faaliyetlerini değerlendirerek karakterize edilebilir gerekir anlamına gelir. Bu etkinliği GPCR altında eğitim ile ilgili farmakolojik veya biyolojik deneyleri kullanılarak değerlendirilebilir. Onların etkinlik profili üzerinde bağımlı, reseptör bağlama molekülleri sonra potansiyel olarak roman kurşun bileşikleri önceden klinik ve klinik çalışmalarda soruşturma için olmak için gelişecek. Özellikle yüksek benzeşimli bir reseptör bağlamak moleküller de tedavi veya tanı araçları, örneğin tümör hücreleri20, noninvaziv vivo içinde görüntüleme için radiolabeling tarafından oluşturmak için iskele veya potansiyel olarak hizmet verebilir Araçlar’therapeutics21hedeflenen dır. CXCR4 durumunda, in vivo görüntüleme tümör hücrelerinin zaten neyin Etiketli CXCR4 hedefleme molekülleri insan kanser xenografts20,22,23 görselleştirme izin fare modelleri kullanarak kanıtlanmıştır .
Bu raporda, biz küçük moleküller ve doğrudan agonist (CXCL12) ile CXCR4 bağlayıcı müdahale destekte sağlar bir rekabet bağlama tahlil için detaylı bir protokol tanımlamak. Sabit bir miktar olan fluorescently etiketli ligand arasındaki rekabet testin temel ilkedir (CXCL12AF647, bkz: malzemeler tablo ve reaktifler) ve etiketsiz bileşikler bağlama reseptör protein17, için 24. etiketli ligand CXCR4 ifade tek hücrelere bağlı belirli floresan sinyalden sonra Akış Sitometresi tarafından analiz edilir. Etiketlenmemiş küçük moleküller arasındaki etkileşim CXCL12AF647 ve CXCR4 bozabilir zaman bu floresan sinyal azalacaktır. Tahlil endogenously CXCR4 hızlı sigara manipüle canlı hücreler kullanır (Yani, Jurkat hücreleri). Bu nedenle, hiçbir hücre zarı hazırlık gereklidir uygun, hızlı ve artan işlem hacmi ile uyumlu tahlil yapar. Fluorescently etiketli bir ligand kullanıldığından, radyoaktivite önlenmiş olur.
CXCL12 doğal agonist CXCR4 için olduğundan, tahlil bağlamasında CXCL12AF647 müdahale küçük molekül bileşikler (bağlama sitesi doğal tarafından işgalYani, orthosteric reseptör bağlama site ile etkileşimde muhtemeldir agonist). CXCL12 bağlantısını etkilemez arazi orthosteric bağlama sitesinden farklı reseptör bağlama siteleriyle etkileşim molekülleri undetected, kalır. Örneğin, pozitif ve negatif allosteric modülatörler, allosteric bağlama siteleri25, oyunculuk molekülleri hedefleme GPCR önemli ve gelişmekte olan bir Kategorideki bu tahlil ile seçilmiş olacak potansiyel olarak değil. Buna ek olarak, bileşikleri bu bağlama tahlil işleviyle reseptör antagonistleri veya agonistler olarak tanımlanan olup olmadığını türetilemez. Soruşturma ek farmakolojik veya fonksiyonel reseptör ilgili deneyleri içinde tanımlanan bileşiklerin böylece gerekli olacaktır. Bu deneyleri (birleşimi) içerebilir hücresel floresan veya ışıldama tabanlı deneyleri ikinci haberci (örneğin, Ca2 +, siklik adenozin monofosfattır (kampı)), fenotipik tespiti için veya biyolojik deneyleri ve β-arrestin İşe Alım deneyleri, belirli sinyal özelliklerinde GPCR altında eğitim, hangi seçim bağlıdır. Bu nedenle, burada esas olarak açıklanan rekabetçi bağlama tahlil bileşikler derinlemesine bir karakterizasyonu reseptör bağlama kudret ile etkinleştirmek için diğer hücre tabanlı deneyleri ile tamamlanabilir gerekir bir başlangıç tarama yöntemi olarak hizmet vermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağlama deneyleri (Yani, doygunluk bağlama ve Kinetik bağlama deneyler), diğer türleri için karşılaştırıldığında, rekabet bağlama deneyleri amacıyla filtreleme için en uygundur. Gerçekten de, onların yeteneklilik-e doğru sabit tutar etiketli Reseptör ligand olan bağlama ile müdahale puanlama tarafından etiketlenmemiş bileşikleri, örneğin küçük moleküller, büyük toplu işlemleri değerlendirilmesi sağlarlar. Etiketli ligand daha diğer reseptör sitelere bağlamak bileşikler ta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Eric Fonteyn mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser KU Leuven tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (iki, hayır vermek. G.485.08) ve Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
References
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, ., Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
- Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
- Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
- Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
- Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
- Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
- De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
- Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
- Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
- Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
- Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).
