Summary
Ett flöde flödescytometri-baserade cellulära bindande analys beskrivs som används främst som en screeningmetod för att identifiera substanser som hämmar bindningen av en fluorescently märkt CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) till CXC chemokine receptorn 4 (CXCR4).
Abstract
Farmakologiska inriktning av G-proteinkopplade receptorer (varandra) är av stor betydelse för människors hälsa, eftersom dysfunktionell GPCR-medierad signalering bidrar till utvecklingen av många sjukdomar. Ligand/receptor paret CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) / CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) har höjt betydande kliniska intresse, till exempel som ett potentiellt mål för behandling av cancer och inflammatoriska sjukdomar. Små molekyler samt terapeutiska antikroppar som specifikt rikta CXCR4 och hämmar receptorns funktion anses därför vara värdefulla farmakologiska verktyg. Här, beskrivs ett flöde flödescytometri-baserade cellulära analysmetod som möjliggör identifiering av föreningar (t.ex. små molekyler) att upphäva CXCL12 bindning till CXCR4. I huvudsak åberopat analysen konkurrensen om receptor bindande mellan ett fast belopp på fluorescently märkt CXCL12, den naturliga chemokine agonist för CXCR4 och omärkt föreningar. Därmed undviks oönskad användning av radioaktivt märkt sonder i denna analys. Dessutom används levande celler som källa för receptorn (CXCR4) i stället för cellmembranet preparat. Detta tillåter enkel anpassning av analysen till ett format som plattan, vilket ökar genomströmningen. Denna analys har visat sig vara en värdefull generiska läkemedel upptäckt analysen identifiera CXCR4-targeting föreningar. Protokollet kan sannolikt anpassas till andra varandra, åtminstone om fluorescently märkt ligander är tillgängliga eller kan genereras. Förkunskaper om de intracellulära signalvägar som induceras vid aktivering av dessa varandra, krävs inte.
Introduction
G-proteinkopplade receptorer (varandra) är cell surface proteiner som kan aktiveras av extracellulära ligander (t.ex. peptider, proteinhormoner, aminer), därmed reglera många fysiologiska och utvecklande processer1. När en agonist upptar sin GPCR bindande ficka, den inducerade conformationaländring i receptorprotein främjar bindningen av intracellulär receptor-associerad heterotrimeric G proteiner, som består av Gα- BNP och Gβγ subenheter. Efterföljande utbyte av GTP för BNP på Gα -subenheten resultaten i dissociationen av G protein subunitsna (Gα-GTP och Gβγ) som, i sin tur ytterligare kommer att inleda nedströms signalering vägar2,3. När det Gα-GTP blir hydrolyserat, ny förening av de Gα- BNP och Gβγ subenheter kommer omvandla proteinet G tillbaka till dess vilande stat3,4. Olika typer av G proteiner finns (Gs, Gi/o, Gq, G12/13), som kategoriseras baserat på sekvens likheten med Gα -subenheten5. Alla dessa G proteiner inducera definierade intracellulära signalvägar som ligger bakom det biologiska svaret på receptor aktiveringen. Efter receptor aktiveringen fosforylera GPCR kinaser (GRKs) intracellulära svansen av varandra, vilket främjar interaktion med β-arrestins. Denna process leder till uppsägning av G protein signalering, receptor desensibilisering och internalisering6. Β-arrestins är också en del av flera molekylära komplex att utlösa signalering kaskad oberoende av G protein signalering7.
Varandra är bland de mest validerade molekylära målen för terapeutisk intervention, eftersom avreglerad GPCR-medierad signalering, till exempel på grund av vinst-av-funktion mutationer i receptorn gen eller receptor överuttryck, bidrar till etiologin av många mänskliga sjukdomar8. Varandra utgör därför en av de viktigaste klasserna av målmolekyler för utredas av läkemedelsindustrin8,9,10. Ett framträdande exempel på en kliniskt relevant GPCR är CXC chemokine receptorn 4 (CXCR4), som kan aktiveras med en enda naturliga ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12)11. På grund av dess etablerade roll som en större gemensam receptor för humant immunbristvirus 1 (HIV-1) inresa och infektion i kluster av differentiering 4 (CD4) positiv T-lymfocyter12, CXCR4 undersöktes först som ett antiviralt läkemedel mål. CXCL12-CXCR4 interaktion i benmärgen ytterligare reglerar bibehållandet och homing av stamceller och stamceller celler13. Också, med tanke på dess roll i många aspekter av cancer biologi (t.ex. tumör cellöverlevnad, metastaser, tumör-relaterade angiogenes)14 och flera andra sjukdomar (t.ex. inflammatoriska sjukdomar)15, CXCR4 uppkommer betydande intresse som en lovande måltavla för läkemedelsutveckling. AMD3100, en liten molekyl som specifikt riktar CXCR4, upptäcktes ursprungligen som en anti-HIV drug kandidat16 och är fortfarande en av de mest potenta CXCR4-antagonister som beskrivs till datum17. Dess utveckling avbröt som ett antiviralt läkemedel var dock18. Denna molekyl används för närvarande som en agent för mobilisering av stamceller under behandling av multipelt myelom och lymfom patienter18. Flera andra kemiskt närstående små molekyler och biologiska läkemedel som hämmar CXCR4 funktion med varierande styrka har varit beskrivs19.
Receptor bindande metoder är värdefulla verktyg i farmakologi som tillåter identifiering av föreningar (t.ex. små molekyler) att interagerar direkt med GPCR sevärdheter. För att utföra studier, behövs det ingen tidigare kunskap om Intracellulär signalering egenskaper eller funktioner av en given GPCR. Även detta kan anses vara en fördel, innebär det att föreningar för vilken receptor bindande kan påvisas behöver ytterligare kännetecknas genom att utvärdera deras potentiella agonistiska eller antagonistisk aktivitet. Denna aktivitet kan utvärderas med hjälp av farmakologisk eller biologiska analyser relaterade till GPCR under studien. Beroende på deras aktivitetsprofil, receptor bindande molekyler kan då potentiellt utvecklas till att bli romanen blyföreningar för utredning i prekliniska och kliniska studier. Molekyler som specifikt binder till en receptor med hög affinitet kan också fungera som ställningar att generera terapeutiskt eller diagnostiskt verktyg, till exempel genom att radiolabeling dem för noninvasiv i vivo imaging av tumör celler20, eller potential fordon för riktade leverans therapeutics21. Vid CXCR4, har i vivo imaging tumörceller redan visats använder musmodeller vari märkt CXCR4-targeting molekyler tillåtna visualisering av mänskliga cancer xenograft20,22,23 .
I den här rapporten beskriver vi ett detaljerat protokoll för en analys av konkurrens-bindande som möjliggör identifiering av små molekyler och biologiska läkemedel som direkt stör agonist (CXCL12) bindande till CXCR4. Den grundläggande principen för analysen är konkurrensen mellan ett fast belopp av fluorescently märkt ligand (CXCL12AF647, se tabell för material och reagenser) och omärkt föreningar för bindning till receptorn protein17, 24. specifika fluorescerande signalen från märkt ligand bunden till enstaka celler som uttrycker CXCR4 analyseras sedan av flödescytometri. Fluorescerande signalen kommer att minskas när omärkt små molekyler störa samspelet mellan CXCL12AF647 och CXCR4. Analysen använder icke-manipulerade levande celler som endogent express CXCR4 (dvs. Jurkat celler). Därför inga cellmembranet förberedelser krävs, vilket gör analysen bekväm, snabb och kompatibel med ökad genomströmning. Eftersom en fluorescently märkt ligand används, undviks radioaktivitet.
Eftersom CXCL12 är den naturliga agonist för CXCR4, är liten molekyl föreningar som störa CXCL12AF647 bindande i analysen benägna att interagera med orthosteric receptor bindningsstället (dvs bindningsstället upptas av naturligt agonist). Molekyler som skulle interagera med receptorer bindande topographically skild från orthosteric bindningsstället förblir oupptäckta, om de inte påverkar bindning av CXCL12. Exempelvis kommer positiva och negativa Allosteriska modulatorer, en viktig och växande kategori av GPCR inriktning molekyler som agerar på Alloster bindande platser25, eventuellt inte att plockas med denna analys. Dessutom, om föreningarna som identifieras med bindande analys funktionen som-receptorantagonister eller agonister kan inte härledas. Undersökningen av de identifiera föreningarna i ytterligare farmakologiska eller funktionella receptor-relaterade analyser kommer alltså att krävas. Dessa analyser kan innehålla (en kombination av) cellulär fluorescens - eller luminiscens-baserade analyser för detektion av andra linjens budbärare (t.ex., Ca2 +, cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)), fenotypiska eller biologiska analyser och β-arrestin rekrytering-analyser, valet av vilket beror på de specifika signalering egenskaperna hos GPCR under studien. Därav, konkurrenskraftiga bindande analysen beskrivs häri främst fungerar som en inledande screening analysmetod som behöver kompletteras med andra cellbaserade analyser för att möjliggöra en djupgående karakterisering av föreningar med receptor bindande potens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. underhåll av cellodling
Obs: Alla stegen som beskrivs under 1 och 2 skall utföras under sterila förhållanden i ett laminärt flöde skåp.
- Odla cellerna i T75 kultur kolvar på 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
Obs: I denna analys används Jurkat celler (dvs mänskliga leukemiska T-lymfocyter celler som endogent express CXCR417). Uttryck för CXCR4 på cellytan bör utvärderas i hela cellen odling med hjälp av flödescytometri. En beskrivning av flöde flödescytometri och reagenser till avgöra uttrycksnivåerna receptor på cellens yta är dock inte omfattas av detta protokoll, men har varit beskrivs tidigare17. - Låt Jurkat celler växa i suspension tills de når 80-85% confluency. Låt samtliga reagenser nå rumstemperatur (RT) före passaging celler till en ny kolv.
- Tillsätt 20 mL färsk komplett odlingsmedium (RPMI-1640 medium, 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin) till en roman T75 kultur kolv.
- Tillsätt 5 mL av Jurkat cellsuspension från ursprungliga T75 kolven (innehållande 25 mL cellsuspension) till romanen T75 kultur kolv. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad inkubator.
2. beredning av CXCL12, analysbuffert och Jurkat celler för tävlingen bindande Assay.
- Förbereda en stamlösning av CXCL12AF647 (20 µg/mL, se tabell för material och reagenser) genom att lösa det frystorkade reagenset (lagras vid-80 ° C, i mörkret) i ultrarent vatten kompletteras med 0,01% (volym/volym) polysorbat 20. Lagra engångsbruk alikvoter av denna utgångslösning vid-80 ° C, skyddas från ljus.
- Förbereda analysbuffert genom tillsats av 40 mL HEPES (1 M, 20 mM slutliga koncentration) till 200 mL Hanks balanserad saltlösning (HBSS, 10 x, utan fenolrött och utan natriumbikarbonat, 1 x slutlig koncentration). Lägg till ultrarent vatten att erhålla en slutlig volym av 2 L. lägga till 4 g (0,2% vikt/volym) bovint serum albumin (BSA), och upplösa BSA via magnetisk omrörning. Slutligen, justera pH till 7,4 (Använd NaOH för detta) och filtrera lösningen genom 0,2 µm porer (se tabell för material och reagenser) med hjälp av ett vakuum samlingsrör.
Obs: Denna analysbuffert kommer att användas i alla ytterligare steg i protokollet. - Räkna antalet och livskraften hos cellerna. För detta, ta ett prov av cellsuspensionen och späd det i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
Obs: Vi använder rutinmässigt en automatiserad cell livskraft analyzer (se tabell för material och reagenser) kan räkna cellsuspensioner vid varierande koncentrationer. För cell inventering, späd 0,5 mL cellsuspension i 1,5 mL PBS (andra utspädningar, t.ex., 0,1 mL i 1,9 mL PBS, är också möjliga). Användningen av denna metod som är baserad på metoden trypan blått färgämne utslagning, har tidigare beskrivits26. Flera andra enheter är kommersiellt tillgängliga för att räkna antalet celler och lönsamhet som ska fungera lika bra. - Samla in önskat antal celler (dvs ~ 24 x 106 celler att köra analysen med en komplett plattan med 96 brunnar) i en steril 50 mL tub genom centrifugering (se tabell material och reagenser för typ av centrifug används) vid 400 x g i 5 min på RT.
- Häll försiktigt av supernatanten utan att störa cellpelleten. Lägga till färska analysbuffert (t.ex. 20 mL) och resuspendera cellerna genom pipettering försiktigt upp och ner.
- Centrifugera cellerna igen vid 400 x g i 5 min på RT.
- Häll igen av supernatanten och återsuspendera cellpelleten i färska analysbuffert att erhålla en densitet på 5 x 106 celler/mL.
3. konkurrens bindande Assay
Obs: Den faktiska konkurrensen bindande assay utförs på RT och kan utföras under icke-sterila förhållanden.
- Späd föreningar under utredning i analysbuffert (se 2.2) för att erhålla önskad koncentration. Antingen förbereda en fast koncentration av förening för inledande screening (t.ex. 10 µM slutlig koncentration) eller, alternativt, en seriell utspädning serie koncentrationer för mer detaljerad karakterisering av föreningar (t.ex. en 1/3, 1/4 eller 1 / 5 spädningsserien börjar på 1 µM, slutlig koncentration). Tänk på att den sammansatta lösningen sist kommer att bli 2 x utspädd i analysen; Därför förbereda en 2 x koncentrerad lösning.
- Dispensera 100 µL av sammansatta lösning (2 x koncentrerad) i en tydlig 96-bra rund bottenplatta (se tabell för material och reagenser) enligt en fördefinierad experimentella lägger ut (t.ex. figur 1 c).
Obs: I detta skede, negativa och positiva kontrollprover ingår i analysen. I negativa kontrollprovläggs 100 µL analysbuffert istället för förening till brunnarna av plattan med 96 brunnar. För positivt kontrollprovläggs analysbuffert också under detta steg. Se även figur 1 c för en typisk experimental layout där en utspädning serie av flera föreningar testas. - Tillsätt 50 µL cellsuspension (se 2.7; 0,25 x 106 celler) från en reagens reservoir i den plattan med 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera plattan för 15 min vid RT i mörkret.
- Tillsätt 50 µL av fluorescently märkt CXCL12 (dvs. 100 ng/mL CXCL12AF647 analysbuffert, 4 x koncentrerad, 25 ng/mL koncentration) från en liknande reagens reservoir till brunnarna av plattan med 96 brunnar. Inkubera i 30 min på RT i mörkret.
Obs: För negativa kontrollprover, lägga till analysbuffert istället. Därför motsvarar den fluorescerande signal upptäckt i de negativa kontrollproverna den autofluorescent bakgrund signalen (figur 1A). För positiva kontrollprover, tillsätt 50 µL per brunn av CXCL12AF647. De positiva kontrollproverna kommer att ge maximal fluorescens signalen identifieras, eftersom ingen potentiell hämning av före inkubering med föreningar ingick (figur 1A). - Centrifugera plattan med 96 brunnar vid 400 x g i 5 min på RT. ta bort supernatanten från pelleterat cellerna genom att vända över plattan. Torka plattan på en vävnad.
- Tillsätt 200 µL färska analysbuffert från en reagens reservoir i brunnarna med hjälp av en flerkanalspipett. Genast fortsätta.
- Centrifugera plattan igen för 5 min vid 400 x g i RT. ta bort supernatanten genom att vända över plattan och torka den igen på vävnad.
- Försiktigt Återsuspendera cellpelleten i 200 µL av 1% PARAFORMALDEHYD upplöst i PBS. Detta steg kommer att fixa cellerna.
- Fortsätta protokollet omedelbart med kvantifiering av fluorescensen av flödescytometri.
4. analys av proverna med flödescytometri
CXCL12AF647 färgas och fixerade celler är nu redo att analyseras med flödescytometri. Flera typer av flöde cytometers kan användas, men de behöver utrustas med rätt laser (dvs. en röd laser, excitation området ~ 630 nm) för magnetisering och lämpliga filter för fluorophore upptäckt (utsläpp filter ~ 660 nm). De behöver kunna hantera prover i plattan med 96 brunnar format. Exempel på lämplig flöde flödescytometri enheter ges i tabell av material och reagens.
- Starta upp enheten och öppna motsvarande programvara (se tabell för material och reagenser).
- Välj följande cellulära parametrar till visualiseras i ett dot blot format: vidarebefordra scatter (FSC), side scatter (SSC) och fluorophore (CXCL12AF647) upptäckt kanalen.
Obs: Med parametern FSC, celler diskrimineras utifrån deras storlek, eftersom den upptäckta ljusabsorption är proportionell mot cellens diameter. Parametern SSC, mäta ljusspridning 90° vinkel, ger information om precisionen av cellerna. - Välja ett prov (t.ex. negativa kontrollprov) att utföra gating definierade homogen cell befolkningen baserat på parametrarna FSC och SSC.
- Välj automatisk injektion av ~ 100 µL av fixerade celler från denna negativa kontrollprov in flödescytometer. Välj alternativet ”blandning” före injektion och Använd en provtagningsflödet 1,5 µL/s.
- Kör detta urval genom att välja ”Hämta Data”. FSC och SSC parametrarna för det här exemplet visas nu på skärmen.
- Välj programvarans Usenets verktyg. Baserat på FSC och SSC dot blot visualisering, pre definiera en homogen och livskraftig cell befolkningen av gating. Att göra det, skapa en polygon (med programvarans Usenets verktyg) som innehåller en likartad distribuerade enstaka celler (”händelser”) baserat på dessa två dimensioner.
Obs: Usenets förfarandet syftar till att definiera en homogen och livskraftig cell befolkningen som kommer att användas för ytterligare analys. Gating bygger på antagandet att majoriteten av viabla celler kommer att bilda en homogen cell befolkningen baserat på parametrarna FSC och SSC. Genom att utföra det här steget, kan cellulära skräp, döda celler och cell aggregat till stor del undantas från ytterligare analys. En illustration av Usenets processen ges i figur 1B.
- Välj om du vill analysera 20.000 ”händelser” (dvs enstaka celler) per prov.
Obs: Detta innebär att för varje prov, 20.000 celler som faller inom fördefinierade grinden kommer så småningom analyseras. Datainsamling för varje prov kommer att fortsätta tills detta antal händelser analyseras. - Börja kör (Välj ”Spara Data”). Flöde flödescytometri enheten kommer nu analysera alla prover one-by-one genom att registrera genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI) för varje prov. Denna MFI motsvarar medelvärdet fluorescerande signalen motsvarande 20.000 cellerna som faller inom fördefinierade grinden.
5. dataanalys
Använd de MFI som erhålls för varje prov för att utföra alla ytterligare beräkningar. Analys av flöde flödescytometri data kan utföras av flera kommersiellt tillgängliga programvarupaket (se tabell för material och reagenser).
- För att bestämma procentsatsen hämning av signalen fluorescerande bindande, till följd av sammansatta före inkubering, gäller följande formel:
Var:
MFIExp = MFI av den experimentella (= förening-behandlade) prov
MFIPC = MFI den positiva kontrollen
MFINC = MFI av den negativa kontrollen - För att fastställa IC50 värdet av en förening (dvs. koncentrationen av förening som kan minska den fluorescerande bindande signalen med 50%), gäller följande formel:
Var:
Loggconc.2 = loggen för en koncentration av förening som resulterar i mindre än 50% hämning av skillnaden mellan MFI värdet av PC och NC
Loggconc.1 = loggen för en koncentration av förening som resulterar i mer än 50% hämning av skillnaden mellan MFI värdet av PC och NC
Obs: Alternativt, vid mycket aktiva föreningar, en dos-respons kurva som täcker flera loggar storleksordning kan genereras baserat på MFI motsvarar varje testade koncentrationen av förening. Genom att tillämpa icke-linjär regression kurva montering med lämplig programvara (se tabell för material och reagenser), IC50 värden kan då utläsas från den genererade kurvor. Ett exempel på denna analys metod visas i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det allmänna arbetsflödet för bindande analysen presenteras i figur 1A. En illustration av typ av flöde flödescytometri data erhållna för olika provtyper i en standard experiment (dvs negativ kontroll, positiv kontroll och experimentella provet) avbildas i figur 1B, och en möjlig plattan layout för att utföra analysen i plattan med 96 brunnar format ges i figur 1 c. Inkubering av Jurkat celler, som endogent express chemokine receptorn CXCR4 (dvs. GPCR av intresse i denna analys), med ökande mängder fluorescently märkt CXCL12 (dvs CXCL12AF647) resulterade i ökade nivåer av fluorescens (figur 2), återspeglar ökade nivåer av liganden bindning till CXCR4. För att demonstrera receptor-specificitet CXCL12AF647 bindande, användes en väletablerad och receptor-specifika CXCR4-antagonist (små molekylen AMD3100). Jurkat celler inkuberades först pre med en 1/5 utspädning serie AMD3100 alltifrån 0,064 ng/mL till 1000 ng/mL, följt av en inkubation med en slutlig koncentration av 25 ng/mL CXCL12AF647 (dvs. fasta mängden märkt chemokine rutinmässigt används i analysen). Sedan bearbetades ytterligare Jurkat celler som beskrivs i protokollet. Fluorescerande signalen (genomsnittlig fluorescerande intensiteten, MFI) efter tillsats av det fasta beloppet av CXCL12AF647 på förhand ruvade Jurkat cellerna, erhölls genom flödescytometri Flödesanalys för alla prover. Denna fluorescerande signal kunde nästan hämmas helt om Jurkat celler var förbehandlade med den högsta koncentrationen av AMD3100 (1000 ng/mL). Under detta tillstånd, hämmad fluorescens var endast något över bakgrundsnivå motsvarar nivån på autofluorescens för Jurkat celler. Sammanfattningsvis, genereras tillämpa 25 ng/mL (slutlig koncentration) CXCL12AF647 i bindande analysen en stor fluorescerande signal fönster (jämfört med den negativa kontrollen) med minimala rester av icke-specifik receptor bindande ( Figur 3A).
Denna bindande analys har främst använts till skärmen för föreningar störa ligand bindning i paneler av omärkta föreningar på en enda fast koncentration eller att studera de dosberoende effekten av aktiva föreningar. I det senare fallet är målet att få IC50 värden (dvs. koncentrationen av förening som hämmar bindande signalen genom 50%), som avspeglar bindande styrkan av föreningar. Figur 3 visar hur flödet flödescytometri data som erhållits med denna bindande analys kan användas att bestämma hämmande potens (i form av IC50) av små molekyler störa bindningen av CXCL12 till CXCR4. Baserat på dosberoende hämning av CXCL12AF647 bindande av AMD3100, fastställdes IC50 värdet här genom att tillämpa icke-linjär regressionsanalys. I det här exemplet motsvarar det beräknade IC50 värdet för AMD3100 18.12 ng/mL. Eftersom screening kampanjer, majoriteten av slumpmässigt utvalda föreningar inte förväntas hämma bindningen av CXCL12AF647 till CXCR4+ Jurkat celler, ett exempel på en inaktiv förening ingick också i denna studie. Här, testades den liten molekyl maravirok, som uppvisar potent anti-HIV-1-aktiviteten genom att agera som en specifik antagonist för CC chemokine receptorn 5 (CCR5)27, i bindande analysen. Ingen inhibition av maximal fluorescerande bindande signalen upptäcktes efter före ruvning Jurkat celler med maravoric, även vid högsta testade (100 ng/mL; Figur 3B). I samma experiment ingick en seriell utspädning serie AMD11070, en annan liten molekyl med anknytning till AMD3100, men med förbättrad farmakokinetiska egenskaper28. Till skillnad från maravirok hämmade en 1/5 spädningsserien från AMD11070 alltifrån 0.0064 till 100 ng/mL klart och dosberoende ligandinducerad CXCL12AF647 bindande (figur 3B).
Figur 1: översikt över arbetsflödet och illustration av typ av data som erhållits. (A). de viktigaste stegen i protokollet är schematized för negativa och positiva kontrollprover och förening-behandlade prover. Prover utan förening före inkubering och utan tillsats av fluorescently märkt chemokine (CXCL12AF647) ingår att fastställa bakgrund (auto) fluorescensen (negativa kontrollproven). Prover utan förening före inkubering, men med tillägg av ett fast belopp på CXCL12AF647 används för att bestämma maximal bindning signalen i analysen (positiva kontrollprover). I förening-behandlade prover inkuberas cellerna pre med förening före tillsats av ett fast belopp på CXCL12AF647. (B). den genomsnittliga fluorescerande bindande signalen bestäms av flödescytometri Flödesanalys av Jurkat celler. Från alla händelser (dvs. Jurkat celler) analyserade (till vänster) används endast fluorescerande signalen från en gated subpopulation av celler för vidare analys (mellersta panelen). Före inkubering av celler med små molekyler (t.ex. AMD3100) hämmar bindningen av den fluorescently märkt receptor liganden och detta kommer att minska maximal bindning signalen (rätt panel, visas i ett histogram representation). (C). en möjligt platta layout när du utför konkurrenskraftiga bindande analysen i ett format som plattan med 96 brunnar. I detta fall sex olika föreningar (cpd 1 - 6) testas i en 1/5 följetong spädningsserien (i dubblett) sträcker sig från 1000 nM ner till 0,32 nM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bindande av CXCL12AF647 Jurkat celler. Jurkat celler inkuberades med ökande mängder CXCL12AF647, i avsaknad av före inkubering med förening. Genomsnittliga fluorescens intensitet (MFI, uttryckt i godtyckliga ljus enheter) ± SD visas (n = 2). Kurva montering utfördes med hjälp av icke-linjär regression använder en en-plats totalt bindande modell efter ekvationen
med Bmax (maximal specifik bindning) = 18,345; Kd = 92,8 ng/mL; NS (lutningen av ospecifik bindning) = 2.139; och bakgrund = 332,6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Hämning av bindningen av CXCL12AF647 av aktiva och inaktiva föreningar. (A) dosberoende hämning av CXCL12AF647 bindande av före ruvning celler med ökande koncentrationer av AMD3100, före tillsats av 25 ng/mL CXCL12AF647. Observera att maximal hämmade genomsnittlig fluorescensintensiteten (MFI, uttryckt i godtyckliga ljus enheter) är fortfarande något över bakgrunden (auto) fluorescensen erhålls för Jurkat celler (genomsnitt ± SD (n = 3)). Kurva montering utfördes med hjälp av icke-linjär regression med varierande lutning (fyra parametrar) enligt
I HillSlope är här 1.313 och den beräkna IC50 är 18.12 ng/mL. (B). dosberoende effekt av AMD11070 och maravirok på CXCL12AF647 bindning till CXCR4+ Jurkat celler (MFI ± SD (n = 3)). Kurva montering för AMD11070 svar utfördes på samma sätt med en HillSlope av 1.458 och ett beräknat IC50 värde 0.9052 ng/ml. För maravirok svar utfördes ingen montering bristen på aktivitet av denna förening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med andra typer av bindning analyser (dvs mättnad bindande och kinetiska bindande experiment), lämpar konkurrens bindande analyser sig bäst vid screening. Faktiskt, de tillåter utvärdering av stora partier av omärkta föreningar, till exempel små molekyler genom poängsättning deras förmåga att störa bindningen av ett fast belopp av en märkt receptor ligand. Föreningar som binder till andra receptorer än märkt liganden kan förbli oupptäckt i analysen. Även om konkurrensen bindande experimentet beskrivs häri fokuserar på chemokine receptorn CXCR4 i synnerhet, kan det sannolikt tjäna som underlag för utformningen av konkurrens bindande analyser för andra varandra också. Exempelvis har CXC chemokine receptorn 7 (CXCR7) beskrivits som en alternativ receptor för CXCL12, kan CXCL12 bindning med hög affinitet29,30. Därför, den samma märkt chemokine (CXCL12AF647) som används för den beskrivna CXCR4 konkurrens bindande analys kan användas för att ställa in CXCR7 bindande experiment. Eftersom CXCR4 och CXCR7 delar CXCL12 som en gemensam ligand, skulle det vara viktigt att arbeta med cellular-modeller där endast en av båda receptorer uttrycks på cellytan, för att utvärdera specifik receptor bindande. Vårt tidigare arbete har visat att Jurkat celler inte visar endogena uttryck för CXCR717. Således, i analysen beskrivs här för CXCR4, störningar med bindning till CXCR7 är uteslutet.
Flera viktiga funktioner i konkurrens bindande analysen gör det möjligt att användas som en snabb, initial, screening verktyg för att identifiera små molekyler stör agonist bindande till CXCR4. En av analysens viktigaste fördelarna är att utnyttja hela, levande celler uttrycker receptorn av intresse. Detta utesluter behovet av arbetsintensiva cellmembranet preparat. Den låga nivån på bakgrunden (auto) fluorescens med Jurkat celler upptäckts är också fördelaktigt. Tillsammans med stora signal fönstret erhållits vid tillägg av definierade mängden fluorescently märkt sond, bidrar det till en positiv signal till baserat på bakgrunden. Detta underlättar upptäckt av potentiella bindande hämning av omärkta föreningar. Ifall denna bindande analys utförs med andra CXCR4 uttrycker celler, rekommenderar vi att alltid utvärdera dessa parametrar (bakgrunden fluorescens, signal fönster) förskott eftersom de kan skilja sig från cell fodrar till cellinje. Det faktum att Jurkat celler endogenously express CXCR4 på en konsekvent nivå över långa perioder, gör det en bekväm cellular-modell. Samma konsekvent nivå av receptoruttryck kan erhållas med stabilt transfekterade cell kloner. Vi rekommenderar däremot inte användning av övergående transfekterade celler eftersom detta sannolikt kommer att resultera i en mycket bredare distribution av fluorescens stödnivåer, färre lyhörd celler i analysen och mindre konsekvens mellan experiment. Sedan finns några CXCR4 negativa Jurkat celler, visades specificitet receptorbindning till dessa celler av före inkubering med väletablerade specifik receptorantagonister (AMD3100 och AMD11070). Dessa antagonister skiljer sig strukturellt från märkt liganden. Detta är viktigt eftersom, när du använder den omärkta varianten av liganden som konkurrent, både märkta och omärkta ligand också kan konkurrera om bindning till icke-specifik bindning platser potentiellt närvarande vid cellytan.
Bortsett från cellulära värd, flera andra aspekter av analysen beskrivs här måste beaktas innan du börjar bygga en liknande analys för andra varandra. Fluorescently märkt sonder som är riktade till varandra har utvecklats som alternativ för radioaktiva sonder, finns men för närvarande endast tillgänglig för ett begränsat antal varandra och de är relativt dyra. Dessutom kan modifiering av naturliga-receptorligander med fluorophores påverka bindande egenskaper jämfört med omärkt överordnade molekylen, speciellt vid mycket små ligander (t ex aminer) eller små peptider31, 32. exempelvis vid små ligander, en länkare krävs generellt att separera pharmacophore från fluorophore att ge tillträde till receptorns orthosteric bindande webbplats31. Receptor-fluorescerande sonden komplexa stabilitet måste också beaktas. Vår erfarenhet efter 90-120 minuter (dvs den tid som behövs för att köra två på varandra följande 96 brunnar), genomsnittlig fluorescerande för de positiva kontrollbrunnarna vanligtvis reduceras intensiteten med ~ 5% jämfört med genomsnittet av alla positiva kontrollbrunnar på den platta med enstaka extremvärden mellan 5 och 10%.
Den inneboende aktiviteten av märkt liganden är också av betydelse. -Receptorantagonister textbild ingen inneboende aktivitet på receptorn, märkt agonister sannolikt framkalla receptor aktiveringen och följaktligen, receptor internalisering. Detta äventyrar den reversibla naturen av de ligand-receptor interaktion33. För att minimera möjliga problem med receptorn internalisering, inkubation med märkta liganden (vid en märkt agonist) behöver vara tidsbegränsade och bör företrädesvis utföras vid rumstemperatur eller lägre. Det faktum att förfarandet utförs vid rumstemperatur gör analysen också enklare och mer kompatibel med screening ansträngningar i platta format. Slutligen, ett tillräckligt antal celler per prov (t.ex. 250.000 per brunn av en plattan med 96 brunnar) bör användas i analysen slutligen behålla ett tillräckligt antal celler (20.000 celler, ”singel händelser”, baserat på den gating av befolkningens hela cellen, se Figur 1) för flödescytometri Flödesanalys. Använda mindre celler skulle göra det svårare att konsekvent nå detta antal analyserade celler, som kan äventyra tillförlitligheten av Läs ut. Använder mindre celler per prov (per brunn) skulle också öka det tidsintervall som behövs för att analysera provet av flödescytometri, och därmed ökar den totala tid att analysera en plattan med hela 96 brunnar. Detta äventyrar ökad genomströmning. På grund av ovan nämnda anledning, framtida miniatyrisering av analysen kan således visa sig inte vara en trivial uppgift.
Sammantaget har en konkurrens bindande analysmetod som används främst i vårt labb som en screeningmetod för att identifiera små molekyler som kan konkurrera med ett fast belopp på märkta CXCL12 för bindning till CXCR4 beskrivits i detalj. Dessa studier är av intresse eftersom de är en relativt snabb och enkel metod för att identifiera föreningar som kan receptorbindning. Även om identifiering av föreningar med bindande kapacitet redan är värdefull i sig, ger denna typ av analys inte information om aktiviteten av de identifiera föreningarna. Därför förblir det nödvändigt att ytterligare validera och karakterisera deras potentiella agonistiska eller antagonistiska aktivitet i andra farmakologiska och funktionella receptor analyser. Av intresse, när det gäller CXCR4 det har visats att-receptorantagonister som visar ökad aktivitet i bindande analysen (dvs. som genererar låga IC50 värden för bindande hämning) utföra relativt bättre i andra funktionella CXCR4-relaterade analyser samt17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Eric Fonteyn för utmärkt teknisk assistans. Detta arbete har stötts av den KU Leuven (bevilja nr. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, bevilja nr. G.485.08) och den Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
References
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: A short history. Br J Pharmacol. 147 Suppl 1, S46-S55 (2006).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 60-71 (2008).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Gurevich, E. V., Tesmer, J. J., Mushegian, A., Gurevich, V. V. G protein-coupled receptor kinases: more than just kinases and not only for GPCRs. Pharmacol Ther. 133, 40-69 (2012).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-arrestins: Multifunctional regulators of G protein-coupled receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Hopkins, A. L., Groom, C. R. The druggable genome. Nat Rev Drug Discov. 1, 727-730 (2002).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: Novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Chatterjee, S., Behnam Azad,, Nimmagadda, B., S, The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Bleul, C. C., Farzan, M., Choe, H., Parolin, C., Clark-Lewis, I., Sodroski, J., Springer, T. A. The lymphocyte chemoattractant SDF-1 is a ligand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry. Nature. 382, 829-833 (1996).
- Flomenberg, N., DiPersio, J., Calandra, G. Role of CXCR4 chemokine receptor blockade using AMD3100 for mobilization of autologous hematopoietic progenitor cells. Acta Haematol. 114, 198-205 (2005).
- Domanska, U. M., Kruizinga, R. C., Nagengast, W. B., Timmer-Bosscha, H., Huls, G., de Vries, E. G., Walenkamp, A. M. A review on CXCR4/CXCL12 axis in oncology: No place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-230 (2013).
- Tsou, L. K., Huang, Y. H., Song, J. S., Ke, Y. Y., Huang, J. K., Shia, K. S. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Schols, D., Struyf, S., Van Damme, J., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med. 186, 1383-1388 (1997).
- Van Hout, A., D'Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Woodard, L. E., Nimmagadda, S. CXCR4-based imaging agents. J Nucl Med. 52, 1665-1669 (2011).
- Wang, Y., Xie, Y., Oupicky, D. Potential of CXCR4/CXCL12 Chemokine Axis in Cancer Drug Delivery. Curr Pharmacol Rep. 2, 1-10 (2016).
- Nimmagadda, S., Pullambhatla, M., Stone, K., Green, G., Bhujwalla, Z. M., Pomper, M. G. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer xenografts with [64Cu]AMD3100 positron emission tomography. Cancer Res. 70, 3935-3944 (2010).
- De Silva, R. A., Peyre, K., Pullambhatla, M., Fox, J. J., Pomper, M. G., Nimmagadda, S. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of monocyclam 64Cu-AMD3465. J Nucl Med. 52, 986-993 (2011).
- Hatse, S., Princen, K., Liekens, S., Vermeire, K., De Clercq, E., Schols, D. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Moyle, G., DeJesus, E., Boffito, M., Wong, R. S., Gibney, C., Badel, K., MacFarland, R., Calandra, G., Bridger, G., Becker, S. Proof of activity with AMD11070, an orally bioavailable inhibitor of CXCR4-tropic HIV type 1. Clin Infect Dis. 48, 798-805 (2009).
- Balabanian, K., Lagane, B., Infantino, S., Chow, K. Y., Harriague, J., Moepps, B., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Bachelerie, F. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., Summers, B. C., Wang, Y., Melikian, A., Berahovich, R., Miao, Z., Penfold, M. E., Sunshine, M. J., Littman, D. R., Kuo, C. J., Wei, K., McMaster, B. E., Wright, K., Howard, M. C., Schall, T. J. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Stoddart, L. A., Kilpatrick, L. E., Briddon, S. J., Hill, S. J. Probing the pharmacology of G protein-coupled receptors with fluorescent ligands. Neuropharmacology. 98, 48-57 (2015).
- Vernall, A. J., Hill, S. J., Kellam, B. The evolving small-molecule fluorescent-conjugate toolbox for Class A GPCRs. Br J Pharmacol. 171, 1073-1084 (2014).
- Stoddart, L. A., White, C. W., Nguyen, K., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Fluorescence- and bioluminescence-based approaches to study GPCR ligand binding. Br J Pharmacol. 173, 3028-3037 (2016).
