Summary
Un flujo de ensayo de enlace celular basado en la citometría se describe que se utiliza principalmente como una herramienta de detección para identificar compuestos que inhiben el atascamiento de un ligand de quimiocina CXC fluorescencia etiquetado 12 (CXCL12) para el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4).
Abstract
Orientación farmacológica de receptores acoplados a proteína G (GPCRs) es de gran importancia para la salud humana, como mediada de GPCR señalización disfuncional contribuye a la progresión de muchas enfermedades. El par de ligando/receptor ligando de quimiocina CXC 12 (CXCL12) / receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4) ha levantado gran interés clínico, por ejemplo como un objetivo potencial para el tratamiento de cáncer y enfermedades inflamatorias. Pequeñas moléculas como anticuerpos terapéuticos que específicamente objetivo CXCR4 e inhiben la función del receptor por lo tanto se consideran como valiosas herramientas farmacológicas. Aquí, se describe un análisis celular flujo base de citometría que permite la identificación de compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas) que derogar CXCL12 vinculante para CXCR4. Esencialmente, el análisis se basa en la competencia por el receptor vinculante entre una cantidad fija de fluorescencia etiquetada CXCL12, el agonista natural chemokine para CXCR4 y compuestos sin etiqueta. Por lo tanto, el indeseable uso de sondas marcadas radiactivamente se evita en este ensayo. Además, las células vivas se utilizan como la fuente del receptor (CXCR4) en lugar de preparaciones de membrana de la célula. Esto permite la fácil adaptación del ensayo a un formato de placa, lo que aumenta el rendimiento. Este ensayo ha demostrado ser un ensayo de descubrimiento valioso medicamento genérico para identificar compuestos dirigidos a CXCR4. El protocolo probablemente adaptables a otros GPCRs, al menos si fluorescencia etiquetadas ligandos están disponibles o pueden generarse. No se requiere conocimiento previo sobre las vías de señalización intracelulares que inducen en la activación de los GPCRs.
Introduction
Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son proteínas de la superficie celular que pueden ser activadas por ligandos extracelulares (por ejemplo, péptidos, hormonas proteicas, aminas), tal modo de regulación fisiológica y del desarrollo de procesos1. Cuando un agonista ocupa su bolsillo de unión de GPCR, el inducido cambio conformacional en la proteína del receptor promueve la Unión de proteínas intracelular asociado a receptor heterotriméricas G, de Gα/ PIB y Gβγ subunidades. El posterior intercambio de GTP para el PIB en los resultados de la subunidadα de G en la disociación de las subunidades de la proteína de G (Gα-GTP y Gβγ) que, a su vez, más inicia aguas abajo de señalización vías2,3. Cuando el Gα-GTP se convierte hidrolizado, la Asociación de laαde la G / PIB y Gβγ subunidades convertirá la proteína G a su reposo estado3,4. Distintos Existen tipos de proteínas G (Gs, Gentrada-salida, Gq, G12/13), que se clasifican basados en la similitud de secuencia con el de subunidadα G5. Todas estas proteínas G inducen definidas vías de señalización intracelular que subyacen a la respuesta biológica a la activación del receptor. Con posterioridad a la activación del receptor, kinasas GPCR (GRKs) fosforilan la cola intracelular de los GPCRs, promoviendo así la interacción con β-arrestins. Este proceso conduce a la terminación de la proteína G señalización, desensibilización e internalización de receptores6. Β-arrestins también forman parte de complejos multi-moleculares que gatillo señalización cascadas independientes de la proteína G señalización7.
GPCRs son entre las dianas moleculares más validados para la intervención terapéutica, como desregulados GPCR-mediada de señalización, por ejemplo debido a las mutaciones de la ganar-de-función en el gene del receptor o sobreexpresión del receptor, contribuye a la etiología de muchas enfermedades humanas8. Por lo tanto, los GPCRs representan una de las más importantes clases de drogas objetivos investigados por la industria farmacéutica8,9,10. Un ejemplo notable de un GPCR clínicamente relevante es el receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4), que puede ser activado por un ligando natural único, la CXC chemokine ligando 12 (CXCL12)11. Debido a su papel establecido como un co-receptor importante para virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) entrada e infección en cúmulo de diferenciación 4 (CD4) positivo linfocitos T12, CXCR4 se investigó en primer lugar como objetivo de un fármaco antiviral. Interacción de CXCL12-CXCR4 en la médula más regula la retención y autoguiado hacia el blanco del vástago y del progenitor células13. También, dada su participación en muchos aspectos del cáncer Biología (p. ej., supervivencia de la célula del tumor, metástasis y angiogénesis tumorales)14 y varias otras enfermedades humanas (p. ej., enfermedades inflamatorias)15, CXCR4 levantado gran interés como un prometedor objetivo de descubrimiento de fármacos. AMD3100, una pequeña molécula que se dirige específicamente a CXCR4, fue descubierto inicialmente como un anti-VIH drogas candidato16 y sigue siendo uno de los más potentes antagonistas CXCR4 descritos hasta la fecha17. Su desarrollo como un fármaco antiviral, sin embargo, suspendió18. Esta molécula se utiliza actualmente como un agente de movilización de células madre durante el tratamiento de mieloma múltiple y linfoma pacientes18. Otras químicamente relacionado con pequeñas moléculas y productos biológicos que inhiben la función de CXCR4 con potencia diferente han sido descritas19.
Métodos de unión del receptor son herramientas valiosas en farmacología que permiten la identificación de compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas) que interactúan directamente con el GPCR de interés. Para llevar a cabo estudios de la Unión, no existe necesidad de conocimientos previos acerca de la propiedades de señalización intracelulares o funcionalidad de un determinado GPCR. Aunque esto puede considerarse una ventaja, implica que compuestos para que receptor pueden demostrarse vinculantes deben caracterizarse aún más mediante la evaluación de su potencial actividad de agonistas o antagonista. Esta actividad puede evaluarse mediante ensayos farmacológicos o biológicos relacionados con el GPCR bajo estudio. Depende de su perfil de actividad, las moléculas de unión del receptor podrían entonces potencialmente evolucionar para convertirse en nuevos compuestos para la investigación en los estudios preclínicos y clínicos. Las moléculas que se unen específicamente a un receptor con alta afinidad también pueden servir como andamios para generar herramientas terapéuticas o de diagnósticos, por ejemplo por radiolabeling para no invasiva en vivo la proyección de imagen del tumor las células20, o como potencial vehículos para la entrega específica de therapeutics21. En el caso de CXCR4, en vivo la proyección de imagen de células del tumor ya ha sido demostrada utilizando modelos de ratón en donde moléculas CXCR4-targeting etiquetadas permitieron la visualización de cáncer humano xenoinjertos20,22,23 .
En este informe, describimos un protocolo detallado para un ensayo de competencia vinculante que permite la identificación de pequeñas moléculas y productos biológicos que interfieren directamente con agonista (CXCL12) vinculante a CXCR4. El principio básico del ensayo es la competencia entre una cantidad fija de fluorescencia etiquetada ligando (CXCL12AF647, véase tabla de materiales y reactivos) y sin etiqueta compuestos por la Unión a los receptores proteína17, 24. la señal fluorescente específica de etiquetado ligando a las células expresan CXCR4 es luego analizada por citometría de flujo. Esta señal fluorescente se reducirá cuando moléculas pequeñas interrumpen la interacción entre CXCL12AF647 y CXCR4. El ensayo utiliza células vivas no manipulado que endógeno expresan CXCR4 (es decir, células de Jurkat). Por lo tanto, ninguna preparación de la membrana de la célula es necesaria, lo que hace el ensayo conveniente, rápido y compatible con el mayor rendimiento. Puesto que un ligando marcado fluorescente se utiliza, se evita la radiactividad.
Porque CXCL12 es el agonista natural para CXCR4, compuestos de pequeñas moléculas que interfieren con la CXCL12AF647 vinculantes en el análisis son capaces de interactuar con el sitio de unión del receptor de la orthosteric (es decir, el sitio de Unión ocupado por los naturales agonista). Moléculas que interactúan con sitios de unión del receptor topográficamente distintos desde el sitio de unión de orthosteric permanecen no detectadas, si no influyen atascamiento de CXCL12. Por ejemplo, moduladores alostéricos positivos y negativos, una categoría importante y emergente de GPCR dirigidos a moléculas que actúan en sitios de Unión alostérica25, serán potencialmente no recogidos con este ensayo. Además, si los compuestos identificaron con esta función de ensayo de enlace como agonistas o antagonistas de los receptores no se puede derivar. Investigación de los compuestos identificados en análisis adicionales farmacológicos o funcionales relacionadas con el receptor por lo tanto será necesario. Estos ensayos pueden incluir (combinación de) celular fluorescencia o luminiscencia-ensayos para la detección de segundos mensajeros (p. ej., Ca2 +, monofosfato de adenosina cíclico (campo)), fenotípicas o ensayos biológicos y β-arrestin Análisis de la contratación, la elección de la que depende de las propiedades específicas de señalización de lo GPCR en estudio. Por lo tanto, el análisis de Unión competitiva descrito en este documento principalmente sirve como un ensayo de prueba inicial que debe ser complementado con otros ensayos celulares para permitir una caracterización detallada de los compuestos con la potencia de unión del receptor.
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Protocol
1. mantenimiento del cultivo celular
Nota: Todos los pasos descritos en 1 y 2 se llevan a cabo en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar.
- Cultivar células en T75 frascos de cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
Nota: En este ensayo, se utilizan células de Jurkat (es decir, linfocitos de T leucémicas humanos células que endógeno expresan CXCR417). Expresión de CXCR4 en la superficie de la célula debe ser evaluado a través de cultivo celular mediante citometría de flujo. Una descripción del procedimiento de citometría de flujo y reactivos para determinar niveles de expresión del receptor en la superficie celular, sin embargo, no es en el ámbito de este protocolo, pero ha sido descrito previamente17. - Dejar que las células de Jurkat crecen en suspensión hasta 80-85% confluency. Antes pases las células a un nuevo frasco, deje todos los reactivos a temperatura ambiente (RT).
- Añadir 20 mL de medio completo fresco (Medio RPMI-1640, 10% suero fetal bovino (FBS), glutamina 2 mM) a un matraz de cultivo T75 novela.
- Añadir 5 mL de suspensión de células de Jurkat del original frasco T75 (contiene 25 mL de la suspensión celular) a la novela T75 frasco de cultura. Incubar a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
2. preparación de células Jurkat, CXCL12 y tampón de ensayo para el concurso de ensayo de enlace.
- Preparar una solución stock de CXCL12AF647 (20 μg/mL; véase tabla de materiales y reactivos) por disolver el Reactivo liofilizado (almacenado a-80 ° C, en la oscuridad) en agua ultrapura con 0,01% (volumen/volumen) de polisorbato 20. Tienda de solo usar alícuotas de esta solución stock a-80 ° C, protegido de la luz.
- Tampón de ensayo se preparan mediante la adición de 40 mL HEPES (concentración final 1 M, 20 mM) para equilibrada solución de 200 mL Hank de sal (HBSS, 10 x, sin fenol rojo y sin bicarbonato de sodio, 1 x concentración final). Agregar agua ultrapura para obtener un volumen final de 2 L. Añadir 4 g (0.2% peso/volumen) albúmina de suero bovino (BSA) y disolver la BSA vía magnética revolviendo. Por último, ajustar el pH a 7.4 (usar NaOH para esto) y filtrar la solución a través de 0,2 poros μm (véase tabla de materiales y reactivos) con un colector de vacío.
Nota: Se utilizará este tampón de ensayo en todas las etapas del protocolo adicionales. - Cuenta el número y la viabilidad de las células. Para ello, tomar una muestra de la suspensión de células y diluido en tampón fosfato salino (PBS).
Nota: Habitualmente utilizamos un analizador de viabilidad celular automatizado (véase tabla de materiales y reactivos) capaz de suspensiones celulares a concentraciones variables de conteo. Para el recuento celular, diluya 0.5 mL de la suspensión celular en 1,5 mL de PBS (las otras diluciones, por ejemplo, 0,1 mL en 1,9 mL de PBS, también son posibles). El uso de este método, que se basa en el método de exclusión de colorante azul de tripano, ha sido descrito previamente26. Varios otros dispositivos están comercialmente disponibles para contar el numero de celular y viabilidad que debería funcionar igualmente bien. - Recoger el número de células (es decir, ~ 24 x 106 células para ejecutar el ensayo con una placa de 96 pocillos completa) en un tubo estéril de 50 mL por centrifugación (véase tabla de materiales y reactivos para el tipo de centrífuga) a 400 x g durante 5 min a RT.
- Suavemente retirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Añadir el tampón de ensayo fresca (p. ej., 20 mL) y resuspender las células transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo.
- Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a TA.
- Retirar nuevamente el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en tampon de ensayo fresca para obtener una densidad de 5 x 106 células/mL.
3. competencia vinculante ensayo
Nota: El ensayo del Enlace real competencia se realiza a temperatura ambiente y puede ser realizado bajo condiciones no estériles.
- Diluir los compuestos investigados en tampon de ensayo (véase 2.2) para obtener la concentración deseada. O bien preparar una concentración fija de compuesto para el cribado inicial (por ejemplo, 10 concentración final μm) o, alternativamente, una serie de dilución seriada de las concentraciones para una más detallada caracterización de los compuestos (por ejemplo, 1/3, 1/4 o 1 / 5 serie de diluciones a partir de 1 μm, concentración final). Tenga en cuenta que la solución compuesta en última instancia será 2 x diluido en el ensayo; por lo tanto, preparar un 2 x solución concentrada.
- Añada 100 μl de solución de compuesto (2 x concentrado) en un claro 96-bien redonda placa inferior (véase tabla de materiales y reactivos) según una endecha experimental previamente definida hacia fuera (por ejemplo, figura 1).
Nota: En esta etapa, se incluyen muestras de control positivo y negativo en el ensayo. En la muestra control negativo, se añade 100 μl de tampón de ensayo en vez de compuesto en los pocillos de la placa de 96 pocillos. Para la muestra control positivo, tampón de ensayo también se agrega durante este paso. Ver también figura 1 para un típico diseño experimental en el que se prueba una serie de diluciones de varios compuestos. - Añadir 50 μl de suspensión celular (véase 2.7; 0.25 x 106 células) de un reservorio de reactivo en la placa de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal. Incubar la placa por 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Añadir 50 μl de fluorescencia etiquetada CXCL12 (es decir, 100 ng/mL de CXCL12AF647 en tampón de ensayo, 4 x concentrado, concentración final de 25 ng/mL) de un reservorio de reactivo similar a los pozos de la placa de 96 pocillos. Incubar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
Nota: Para las muestras control negativo, añadir tampón de ensayo en lugar de otro. Por lo tanto, la señal fluorescente detectada en las muestras control negativo corresponde a la señal de fondo autofluorescent (figura 1A). Para las muestras de control positivo, añadir 50 μL/pocillo de CXCL12AF647. Las muestras de control positivo dará la señal de fluorescencia máxima detectada, puesto que ningún potencial inhibición por preincubación con compuestos se incluyó (figura 1A). - Centrifugar la placa de 96 pozos a 400 x g durante 5 minutos a RT. Retire el sobrenadante de las células sedimentados por los bancos sobre la placa. Secar la placa en un tejido.
- Añadir 200 μL de tampón de ensayo fresco de un reservorio de reactivo a los pozos utilizando una pipeta multicanal. Proceder inmediatamente.
- Centrifugar la placa nuevamente por 5 min a 400 x g en RT. eliminar el sobrenadante por los bancos sobre la placa y secarla otra vez en el tejido.
- Suavemente Resuspender el precipitado de células en 200 μL de paraformaldehído al 1% disuelta en PBS. Este paso será fijar las células.
- Seguir el protocolo inmediatamente con la cuantificación de la fluorescencia mediante citometría de flujo.
4. Análisis de las muestras por citometría de flujo
CXCL12AF647 manchadas y resecos células ya están listas para ser analizados mediante citometría de flujo. Pueden utilizarse varios tipos de citómetros de flujo, pero tienen que estar equipados con el láser correcto (es decir, un láser rojo, excitación rango ~ 630 nm) para la excitación y filtros adecuados para la detección del fluoróforo (emisión filtros ~ 660 nm). Tienen que ser capaces de manejar muestras en un formato de placa de 96 pocillos. Ejemplos de dispositivos de citometría de flujo adecuado se dan en la tabla de materiales y reactivos.
- Puesta en marcha del dispositivo y abrir el software correspondiente (véase tabla de materiales y reactivos).
- Seleccione los siguientes parámetros celulares a visualizarse en formato dot blot: adelante scatter (FSC), lado scatter (SSC) y el canal de detección de fluoróforo (CXCL12AF647).
Nota: Con el parámetro FSC, las células son discriminadas en base a su tamaño, puesto que la absorción de la luz detectada es proporcional al diámetro de la célula. El parámetro de la SSC, mide la dispersión de la luz en un ángulo de 90°, proporciona información sobre el nivel de detalle de las células. - Elige una muestra (por ejemplo, una muestra de control negativo) para realizar el control de una población celular homogénea definida basándose en los parámetros FSC y SSC.
- Seleccione inyección automática de ~ 100 μl de células determinadas de esta muestra control negativo en el citómetro de flujo. Seleccione la opción "mezcla" antes de la inyección y utilizar un caudal de muestra de 1,5 μl/s.
- Ejecutar este ejemplo seleccionando "Datos de adquisición". Los parámetros para esta muestra de FSC y SSC aparecerá en la pantalla.
- Seleccione la herramienta bloquea el software. Basado en la visualización de blot dot FSC y SSC, predefinir una población celular homogénea y viable por compuerta. Para ello, crear un polígono (utilizando herramienta bloquea el software) que incluye las células homogéneamente distribuidas ("eventos") basadas en estas dos dimensiones.
Nota: El procedimiento bloquea pretende definir una población celular homogénea y viable que se utilizará para su posterior análisis. Compuerta se basa en el supuesto de que la mayoría de las células viables forma una población celular homogénea, basándose en los parámetros FSC y SSC. Al realizar este paso, agregados de células, detritos celulares y células muertas en gran medida pueden ser excluidas del análisis. Una ilustración del proceso bloquea se da en la figura 1B.
- Seleccione analizar 20.000 'eventos' (es decir, las células) por muestra.
Nota: Esto significa que para cada muestra, 20.000 células que caen dentro de la puerta predefinida serán finalmente analizadas. Adquisición de datos para cada muestra continuará hasta que se analiza este número de eventos. - Iniciar el funcionamiento (seleccione "datos de registro"). El dispositivo de citometría de flujo ahora a analizar todas las muestras una por una mediante el registro de la intensidad de fluorescencia media (IFM) para cada muestra. Esta IMF se corresponde con la señal fluorescente media correspondiente a las 20.000 células que caen dentro de la puerta previamente definida.
5. Análisis de datos
Utilizar la IMF obtenida para cada muestra para realizar todos los cálculos más. Análisis de los datos de la citometría de flujo puede realizarse por diversos paquetes de software disponibles en el mercado (véase tabla de materiales y reactivos).
- Para determinar el porcentaje de inhibición de la señal fluorescente vinculante, como resultado de preincubación compuesto, aplicar la siguiente fórmula:
Donde:
MFIExp = IMF de la experimental (= Tratado compuesto) muestra
MFIPC = el MFI del control positivo
MFINC = IMF del control negativo - Para determinar el valor de IC50 de un compuesto (es decir, la concentración del compuesto que puede reducir la señal de enlace fluorescente en un 50%), aplicar la siguiente fórmula:
Donde:
Registroconc.2 = el log de la concentración del compuesto que resulta en menos del 50% de inhibición de la diferencia entre el valor de la IMF de la PC y NC
Registroconc.1 = el log de concentración de compuesto que resulta en más del 50% de inhibición de la diferencia entre el valor de la IMF de la PC y NC
Nota: Alternativamente, en caso de compuestos muy activos, una curva de dosis-respuesta que abarca varios registros de magnitud puede generarse en la IMF correspondiente a cada concentración probada de compuesto base. Mediante la aplicación de ajuste de curvas de regresión no lineal utilizando el software apropiado (véase tabla de materiales y reactivos), entonces se deduce valores de IC50 de las curvas generadas. En la figura 3se muestra un ejemplo de este enfoque de análisis.
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Representative Results
El flujo de trabajo general de la prueba de enlace se presenta en la figura 1A. Una ilustración del tipo de datos de citometría de flujo obtenidos para tipos diferentes de la muestra en un experimento estándar (es decir, el control negativo, control positivo y muestra experimental) se representa en la figura 1By un diseño de placa posible para llevar a cabo el ensayo en un formato de placa de 96 pocillos se da en la figura 1. Incubación de las células de Jurkat, que endógeno expresan el receptor de quimiocina CXCR4 (es decir, el GPCR de interés en este ensayo), con cantidades crecientes de fluorescencia etiquetada CXCL12 (es decir, CXCL12AF647) resultó en mayor niveles de fluorescencia (figura 2), reflejando el aumento de los niveles de ligando a CXCR4. Para demostrar la especificidad de receptor de CXCL12AF647 vinculante, un bien establecido y específica del receptor CXCR4 antagonista (la molécula pequeña AMD3100) fue utilizado. Células Jurkat primero fueron incubadas previamente con una serie de diluciones de 1/5 de AMD3100 desde 0.064 ng/mL a 1.000 ng/mL, seguido de una incubación con una concentración final de 25 ng/mL CXCL12AF647 (es decir, la cantidad fija de chemokine etiquetado rutinariamente utilizado en el ensayo). Entonces, células Jurkat más se procesaron como se describe en el protocolo. La señal fluorescente (la fluorescente intensidad media, IMF) después de la adición de la cantidad fija de CXCL12AF647 a las células de Jurkat previamente incubadas, se obtuvo por análisis de citometría de flujo para todas las muestras. Esta señal fluorescente podría casi totalmente inhibida en el caso de las células Jurkat fueron tratadas previamente con la mayor concentración de AMD3100 (1.000 ng/mL). Bajo esta condición, el nivel de inhibición de fluorescencia fue sólo ligeramente por encima del nivel de fondo correspondiente al nivel de Autofluorescencia para células Jurkat. En conclusión, aplicando 25 ng/mL (concentración final) de CXCL12AF647 en el ensayo de enlace genera una ventana grande de la señal fluorescente (en comparación con el control negativo) con un nivel residual mínimo de receptores no específicos vinculantes ( Figura 3A).
Este análisis de enlace se ha utilizado principalmente para detectar compuestos interrumpir ligando en paneles de compuestos sin etiqueta en una sola concentración fija, o para estudiar el efecto dependiente de la dosis de compuestos activos. En este último caso, el objetivo es obtener IC50 valores (es decir, la concentración del compuesto que inhibe la señal de enlace en un 50%), que reflejan la potencia del enlace de los compuestos. La figura 3 ilustra cómo se pueden utilizar datos de citometría de flujo obtenidos con este análisis de enlace para determinar la potencia inhibitoria (en términos de IC50) de moléculas pequeñas interrumpiendo la Unión de CXCL12 a CXCR4. Basado en la inhibición dependiente de la dosis de CXCL12AF647 enlace de AMD3100, el valor de IC50 se determinó aquí aplicando análisis de regresión no lineal. En este ejemplo, el valor de50 IC calculado para AMD3100 corresponde a 18.12 ng/mL. Porque en campañas de detección, la mayoría de los compuestos seleccionados al azar se espera que no inhiben el atascamiento de CXCL12AF647 a CXCR4 células+ Jurkat, un ejemplo de un inactivo compuesto también fue incluido en este estudio. Aquí, el maraviroc de molécula pequeña, que exhibe actividad anti-HIV-1 potente, actuando como un antagonista específico para el receptor de quimiocina CC 5 (CCR5)27, fue probado en el ensayo de enlace. No hay inhibición de la señal de enlace fluorescente máxima fue detectada después de incubar las células Jurkat con maravoric, incluso en la concentración más alta probada (100 ng/mL; Figura 3B). En el mismo experimento, se incluyó una serie de dilución seriada de AMD11070, otra pequeña molécula relacionada con AMD3100, pero con mejores propiedades farmacocinéticas28. A diferencia de maraviroc, una serie de la dilución 1/5, de AMD11070, que van de 0.0064 claramente a 100 ng/mL y dosis dependiente inhibición CXCL12AF647 enlace (figura 3B).
Figura 1: Resumen del flujo de trabajo y la ilustración del tipo de los datos obtenidos. (A). los pasos principales del protocolo son esquematizados para muestras de control positivas y negativas y las muestras tratadas con compuestos. Muestras sin preincubación compuesto y sin adición de fluorescencia etiquetada chemokine (CXCL12AF647) se incluyen para determinar la fluorescencia del fondo (auto) (muestras de control negativo). Muestras sin preincubación compuesto, pero con la adición de una cantidad fija de CXCL12AF647 se utilizan para determinar la señal de Unión máxima en el ensayo (muestras de control positivo). En las muestras tratadas con compuestos, las células se incuban previamente con compuesto antes de la adición de una cantidad fija de CXCL12AF647. (B). la señal de enlace fluorescente media se determina por análisis de citometría de flujo de células Jurkat. De todos eventos (es decir, células de Jurkat) analizadas (panel izquierdo) se utiliza solo la señal fluorescente de una subpoblación cerrada de las células para su posterior análisis (panel central). Preincubación de las células con moléculas pequeñas (por ejemplo, AMD3100) inhibe la Unión del ligando receptor fluorescencia marcada y esto reducirá la señal de máxima unión (panel de la derecha, se muestra en una representación del histograma). (C). un diseño de placa posible al realizar el análisis de Unión competitiva en un formato de placa de 96 pocillos. En este caso, se analizan seis compuestos diferentes (cpd 1 - 6) en una serie de dilución seriada 1/5 (por duplicado) que van desde 1.000 nM hasta 0,32 nM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Unión de CXCL12AF647 a las células de Jurkat. Las células Jurkat fueron incubadas con cantidades crecientes de CXCL12AF647, en ausencia de preincubación con compuesto. Se muestra la intensidad (IMF, expresada en unidades arbitrarias de luz) de fluorescencia media ± SD (n = 2). Ajuste de curvas se realizó mediante regresión no lineal mediante un modelo de enlace total un sitio siguiendo la ecuación
con Bmáximo (máxima unión específica) = 18.345; Kd = 92,8 ng/mL; NS (pendiente de enlace no específico) = 2.139; y fondo = 332.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inhibición de la Unión de CXCL12AF647 compuestos activos e inactivos. Dependiente de la dosis (A) inhibición de CXCL12AF647 vinculante por incubar las células con el aumento de las concentraciones de AMD3100, antes además de 25 ng/mL CXCL12AF647. Nota que el máximo inhibido intensidad de fluorescencia media (IFM, expresada en unidades arbitrarias de luz) es todavía ligeramente por encima de la fluorescencia del fondo (auto) Obtenido de células Jurkat (media ± SD (n = 3)). Ajuste de curvas se realizó mediante regresión no lineal con una pendiente variable (4 parámetros) según
Aquí la ladera es 1,313 y el IC calculado50 18.12 ng/mL. (B). efecto dependiente de la dosis de AMD11070 y maraviroc en CXCL12AF647 Unión a CXCR4+ Jurkat células (MFI ± SD (n = 3)). Ajuste para la respuesta AMD11070 de la curva se realizó igualmente con una geomorfología de 1.458 y un valor de50 IC calculado de 0.9052 ng/mL. Para la respuesta de maraviroc, ningún ajuste fue realizado debido a la falta de actividad de este compuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Comparado con otros tipos de ensayos de unión (es decir, enlace de saturación y experimentos de cinética obligatoria), ensayos de competencia vinculante son los más adecuados para fines de detección. De hecho, permiten evaluación de lotes grandes de compuestos sin etiqueta, por ejemplo pequeñas moléculas, marcando su capacidad para interferir con la Unión de una cantidad fija de un ligando del receptor etiquetados. Compuestos que se unen a otros sitios del receptor que el ligando marcado podrían permanecer no detectados en el ensayo. Aunque el experimento de unión de competencia descritos se centra en el receptor de quimiocina CXCR4 en particular, es probable que puede servir como un modelo para el diseño de ensayos de competencia vinculante para otros GPCRs así. Por ejemplo, el receptor de quimiocina CXC 7 (CXCR7) fue descrito como un receptor alternativo de CXCL12, capaz de CXCL12 de unión con alta afinidad29,30. Por lo tanto, la misma quimiocina etiquetado (CXCL12AF647) como se utiliza para el CXCR4 descrito ensayo obligatorio de competencia puede utilizarse para establecer experimentos de Unión CXCR7. Porque CXCR4 y CXCR7 comparten CXCL12 como un ligand común, sería importante trabajar con modelos celulares en los que sólo uno de ambos receptores se expresa en la superficie celular, con el fin de evaluar atascamiento específico del receptor. Nuestro trabajo previo ha demostrado que las células de Jurkat no muestran expresión endógena de CXCR717. Así, en el ensayo descrito aquí para CXCR4, interferencia con enlace a CXCR7 queda descartada.
Varias características claves de la prueba de enlace de competencia permiten que sea utilizado como una inicial rápida, selección de herramienta para identificar moléculas pequeñas interfiriendo con agonista a CXCR4. Uno de los beneficios clave del ensayo es el uso de las células vivas de todo, expresan el receptor de interés. Esto omite la necesidad de preparaciones de membrana de la célula que requieren mucho trabajo. Además, el bajo nivel de fluorescencia del fondo (auto) detectado en células Jurkat es beneficioso. Junto a la ventana grande de la señal obtenida con la adición de la cantidad definida de sonda de fluorescencia marcada, contribuye a una favorable relación señal a fondo. Esto facilita la detección de potencial inhibición de la Unión de compuestos sin etiqueta. En caso de que se realiza este ensayo de unión con otras células expresan CXCR4, se recomienda siempre evaluar estos parámetros (fluorescencia de fondo, ventana de la señal) por adelantado pueden diferir de la línea celular a línea celular. El hecho de que células Jurkat endógeno expresan CXCR4 en un nivel constante durante largos períodos, se hace un modelo celular conveniente. El mismo nivel constante de la expresión del receptor podría obtenerse con clones de células transfected estable. En cambio, no recomendamos el uso de células transfected transitorio porque esta, probablemente, resulte en una mayor distribución de las intensidades de fluorescencia, menos células sensibles en el análisis y menos coherencia entre experimentos. Puesto que existen ningunas células de Jurkat negativas de CXCR4, especificidad del atascamiento del receptor de estas células fue demostrada por preincubación con los antagonistas de receptor específico bien establecido (AMD3100 y AMD11070). Estos antagonistas son estructuralmente diferentes del ligando marcado. Esto es importante porque, cuando se usa la variante sin etiqueta del ligando competidor, ligando etiquetado y sin etiqueta podría competir por la Unión a sitios de Unión inespecífica potencialmente presentes en la superficie celular.
Aparte del anfitrión celular, varios otros aspectos del ensayo descrito aquí deban tenerse en cuenta antes de comenzar a construir un análisis similar para otros GPCRs. sondas fluorescente etiquetadas GPCRs que se han desarrollado como alternativas para radiactivos puntas de prueba, pero actualmente sólo están disponibles para un número limitado de los GPCRs y son relativamente caros. Por otra parte, modificación de los ligandos del receptor natural con fluoróforos puede alterar las propiedades de Unión en comparación con la molécula del padre sin etiqueta, especialmente en el caso de ligandos muy pequeños (por ejemplo, aminas) o péptidos pequeños31, 32. por ejemplo, en el caso de ligandos, un enlazador es necesaria generalmente para separar el pharmacophore de fluoróforo para permitir el acceso a la orthosteric del receptor binding sitio31. También, la estabilidad de la sonda fluorescente receptor complejo debe tenerse en cuenta. En nuestra experiencia, después de 90-120 minutos (es decir, el tiempo necesario para ejecutar dos placas de 96 pozos consecutivas), la intensidad fluorescente media para los pozos de control positivo normalmente es reducida por ~ 5% en comparación con el promedio de todos los pozos de control positivo en el placa, con afloramientos ocasionales entre 5 y 10%.
Además, la actividad intrínseca del ligando marcado es de importancia. Mientras que antagonistas del receptor de mostrar ninguna actividad intrínseca sobre el receptor, probablemente etiquetados agonistas inducen la activación del receptor y, en consecuencia, la internalización del receptor. Esto compromete la naturaleza reversible de la interacción ligando-receptor del33. Para minimizar posibles problemas de internalización del receptor, la incubación con el ligando marcado (en el caso de un agonista de la etiqueta) deban ser limitado en el tiempo y preferentemente deben realizarse a temperatura ambiente o inferior. El hecho de que el procedimiento se realiza a temperatura ambiente hace que el ensayo también conveniente y más compatible con los esfuerzos en formato placa de detección. Finalmente, un número suficiente de células por muestra (por ejemplo, 250.000 por pozo de una placa de 96 pocillos) debe utilizarse en el ensayo, en definitiva, mantener un número suficiente de células (20.000 células, "solo eventos," basado en el control de la población de células enteras; véase Figura 1) para el análisis de citometría de flujo. Con menos células sería más difícil de alcanzar constantemente este número de células analizadas, que podría poner en peligro la fiabilidad de la lectura hacia fuera. Con menos células por muestra (por pozo) aumentaría también el intervalo de tiempo necesario para analizar la muestra por citometría de flujo y por lo tanto aumenta el tiempo total para analizar una placa de 96 pocillos todo. Esto compromete mayor rendimiento. Debido a la razón mencionada, futura miniaturización del ensayo tal vez así fuera no debe ser una tarea trivial.
Tomados en conjunto, un análisis de unión de competencia que se utiliza principalmente en nuestro laboratorio como una herramienta de detección para identificar moléculas pequeñas que pueden competir con una cantidad fija de CXCL12 marcados por la Unión a CXCR4 se ha descrito en detalle. Estos estudios de enlace son de interés ya que son un método relativamente rápido y sencillo para identificar compuestos capaces de atascamiento del receptor. Aunque la identificación de compuestos con capacidad máxima de encuadernado es ya valiosa en sí mismo, este tipo de análisis no proporciona información sobre la actividad de los compuestos identificados. Por lo tanto, es necesario validar y caracterizar su potencial actividad agonística o antagónico en otros ensayos farmacológicos y funcionales del receptor. De interés, en el caso de CXCR4 se ha demostrado que los antagonistas de los receptores que muestran aumento de la actividad en el ensayo de enlace (es decir, que generan bajos valores de IC50 para atar inhibición) realizan relativamente mejor en otras funciones Relacionados con CXCR4 también ensayos de17.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Eric Fonteyn por asistencia técnica excelente. Este trabajo ha sido apoyado por el KU Leuven (subsidio no. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, subsidio no. G.485.08) y la Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSDIVA Software | |||
| BD FACSArray | Becton Dickinson | Not applicable | Flow cytometry device |
| BD FACSArray System Software | |||
| Graphpad Prism | Graphpad | software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3 | |
| FlowJo | FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD. | ||
| Vi-CELL | Beckman Coulter | Not applicable | cell viability analyzer |
| Sigma 3-18 KS | Sigma | Not applicable | centrifuge |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | Pfizer | antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002) | |
| h-SDF1a (AF647) | ALMAC | CAF-11-B-01 | fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Jurkat cells | ATCC | ||
| Reagent reservoir PP | Sigma | BR703411 | |
| Rapid flow filter: 0.2 µm aPES | Thermo Scientific | 566-0020 | |
| Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear | Thermo Scientific | 611U96 | |
| Falcon tubes, 50ml | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 |
References
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