باستخدام ناقل ثنائي ببيباك-GW يجعل توليد النباتات المعدلة وراثيا مع الملاحق نسخة واحدة سليمة، عملية سهلة. هنا، يقدم سلسلة من البروتوكولات التي ترشد القارئ من خلال عملية توليد نبات النباتات المعدلة وراثيا، واختبار نباتات إينتاكتنيس ونسخ عدد من إدراج.
عند توليد النباتات المعدلة وراثيا، عموما الهدف أن يكون تعبير مستقر التحوير. وهذا يتطلب تكامل واحد، سليمة من التحوير، كما نسخ متعددة من التكامل غالباً ما يتعرضون لإسكات الجينات. ناقل ثنائي متوافق مع العبارة استناداً إلى الصبغيات الاصطناعية البكتيرية (ببيباك-GW)، مثل مشتقات ببيباك أخرى، يسمح إدراج المتسلسلات نسخة واحدة بكفاءة عالية. كما تحسن إلى ببيباك الأصلي، قد تم استنساخ كاسيت عبارة في ببيباك-غيغاواط، حيث أن تسلسل الفائدة يمكن الآن يسهل إدراجها في نقل المتجهات الحمض النووي (تي-DNA) باستنساخ بوابة. عادة، نتائج التحول مع ببيباك-GW في كفاءة من 0.2-0.5 في المائة، حيث نصف الوراثي القيام بدمج نسخة واحدة سليمة من T-الحمض النووي. تتوفر ناقلات غيغاواط ببيباك مع المقاومة إلى جلوفوسيناتي الأمونيوم أو دسريد fluorescence في المعاطف البذور للتحديد في النباتات، ومع مقاومة كاناميسين كمجموعة في البكتيريا. هنا، يقدم سلسلة من البروتوكولات التي ترشد القارئ من خلال عملية توليد النباتات المعدلة وراثيا باستخدام ببيباك-GW: بدءاً من إعادة ضم تسلسل الاهتمام داخل المتجهة غيغاواط ببيباك الاختيار، مصنع التحويل مع المتبعة، الانتقاء الوراثي واختبار النباتات لعدد إينتاكتنيس ونسخة من إدراج استخدام الحمض النووي النشاف. هو إيلاء اهتمام لتصميم استراتيجية blotting الحمض النووي الاعتراف التكاملات أحادية ومتعددة كوبي في المكاني الأحادي والمتعدد.
عند توليد النباتات المعدلة وراثيا، عادة الهدف أن يكون transgene(s) المتكاملة ستابلي أعرب. وهذا يمكن أن تحققه التكاملات نسخة واحدة سليمة للتحوير. تكاملات متعددة يمكن أن يؤدي لزيادة التعبير عن التحوير، ولكن أيضا لإسكات الجينات. إسكات المتسلسلات على الأرجح إذا كان يتم ترتيب متواليات المدرج في ترادف أو تكرار مقلوب1،2،،من34. تستخدم ناقلات ثنائية مكوك في المتبعة-بوساطة تجارب التحول تقديم تسلسل الاهتمام إلى جينوم النبات. عدد اندماجات في جينوم نبات يعتمد على عدد نسخ ناقل ثنائي في5، tumefaciens المتبعة6. العديد من ناقلات ثنائي استخداماً هي نواقل نسخة عالية، وذلك يسفر عن عدد نسخ التحوير متوسط ارتفاع: نسخ 3.3 إلى 4.9 في نبات5.
يمكن خفض عدد تي-دنا التكاملات باستخدام ناقلات الثنائية التي تحتوي على عدد نسخة منخفضة في توميفاسينس أ، مثل بيبك7، أو بواسطة إطلاق تي الحمض النووي من الكروموسوم توميفاسينس أ- 5. عدد متوسط من التكاملات التحوير في مثل هذه الحالات أقل من 25،،من89،10. نظراً لأن نسخة واحدة في توميفاسينس (أ)، وكذلك في الإشريكيّة القولونية، يمكن الحفاظ على بيبك-المشتقات وتسليم بنيات كبيرة بقدر 150 كيلو بايت11.
غيغاواط المتوافقة بيبك ناقلات10،12 تسمح السهل إدخال الجينات للفائدة في الموجه استخدام بوابة الاستنساخ. استخدام التكنولوجيا بوابة يبسط إلى حد كبير إجراء الاستنساخ، ولكن أيضا يتغلب على المشاكل الشائعة المقترنة كبيرة منخفضة-نسخة-عدد ناقلات13،14، مثل الحمض النووي عائد منخفض، ومجموعة محدودة من قيود فريدة من نوعها المواقع المتوفرة لاستنساخ7،11. مشتقات ببيباك-GW متوفرة مع المقاومة أما إلى جلوفوسيناتي-الأمونيوم (ببيباك-بار-GW) أو دسريد fluorescence في المعاطف البذور (ببيباك-RFP-GW) للتحديد في النباتات (الشكل 1)10،12. لكل ناقلات، كجينات مقاومة كاناميسين علامة اختيار في البكتيريا.
الجمع بين ناقلات غيغاواط ببيباك: (1) سهل التصميم والتلاعب بالجينات في كولاي، واندماجات نسخة واحدة (2) سليمة في بﻻنتا بكفاءة عالية. العائد ناقلات غيغاواط ببيباك على التكامل المتوسط 1.7 في نبات مع ما يقرب من نصف النباتات المحورة وراثيا تحمل واحدة متكاملة تي-دنا10.
تعبير مستقر المتسلسلات شرطا لمعظم الوراثي التي تم إنشاؤها. تعبير مستقر التحوير يمكن أن تحققه التكاملات سليمة، ونسخة واحدة. بيد أن العمل مع النباتات المعدلة وراثيا تحمل التكاملات سليمة، ونسخة واحدة من أكثر أهمية إذا كان على سبيل المثال، يهدف إلى دراسة كفاءة العمليات المستندة إلى الكروماتين، مثل الطفرات وممارسو، أو إصلاح، والاعتماد على هذه العمليات في موقع جينومي وهيكل الكروماتين في موقع الإدراج. لمصلحتنا، لدراسة اعتماد الطفرات اليغنوكليوتيد الموجهة (ODM) في سياق الجينوم المحلية، كان مجموعة من خطوط مراسل مع التكاملات سليمة، ونسخة واحدة من الجين المراسل الطفرات التي تم إنشاؤها (الشكل 2)10. باستخدام هذه المجموعة من الخطوط، فقد ظهر أن كفاءة ODM يتراوح بين المكاني المعدلة وراثيا المتكاملة في مختلف المواقع الجينوم، على الرغم من مستويات التعبير التحوير بالأحرى مماثلة.
الحاسمة لتوليد الوراثي مع التكاملات واحد، سليمة من التحوير هو خيار ناقل ثنائي المستخدمة. وقد استخدمت ناقلات الأسرة بيبك تسليم متواليات المصالح إلى العديد من النباتات الأنواع23،24،،من2526،،من27<sup…
The authors have nothing to disclose.
يدعم هذا البحث الهولندية التكنولوجيا مؤسسة STW (12385)، الذي يشكل جزءا من “منظمة هولندا” للبحث العلمي (NWO)، والذي يمول جزئيا من وزارة “الشؤون الاقتصادية” (مكتب المدعي العام منحة 12385 لمرض التصلب العصبي المتعدد). ونحن نشكر كارول م. هاملتون (جامعة كورنيل، الولايات المتحدة) لتوفير pCH20، العمود الفقري لناقلات بيبك-غيغاواط.
Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
DB3.1 competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
DH10B competent cells | Thermo Scientific – Invitrogen | 18290-015 | |
Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific – Invitrogen | 11791-019 | |
tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
Bacto tryptone | BD | 211705 | |
Yeast extract | BD | 212750 | |
Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
Potassium chloride | Merck | 104936 | |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
Agar | BD | 214010 | |
Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
Restriction enzymes | NEB | ||
Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
Agarose | Thermo Scientific – Invitrogen | 16500 | |
Boric acid | Merck | 100165 | |
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
Heat sealer | |||
Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |