Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

PBIBAC-GW ikili vektör oluşturma transgenik bitkiler sağlam tek kopya eklemeler, kolay bir süreç ile kolaylaştırır. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik Arabidopsis bitkiler üretme ve bitkiler intactness için sınama işlemi boyunca rehberlik ve ekleme sayısı kopyalamak sunulur.

Abstract

Transgenik bitkiler oluştururken, genellikle nesnel bir transgene istikrarlı ifade sahip olmaktır. Çoklu kopya entegrasyonlar kez gen susturmak için tabi olan gibi bu transgene tek, bozulmamış entegrasyonunu gerektirir. Bakteriyel yapay kromozomu (pBIBAC-GW), diğer pBIBAC türevleri gibi temel ağ geçidi uyumlu ikili vektör tek kopya transgenes ekleme ile yüksek verim sağlar. Faiz dizisi şimdi kolayca vektör transfer içine DNA (T-DNA) ağ geçidi klonlama tarafından eklenebilir böylece orijinal pBIBAC bir gelişme, bir ağ geçidi kaset pBIBAC-GW kopyalamış. Yaygın olarak, dönüşüm pBIBAC-GW ile sonuç 0,2-0,5 bir verimlilik %, mademki transgenics yarısı taşımak T-DNA'ın sağlam tek kopya tümleştirme. PBIBAC-GW vektörel çizimler Glufosinate-amonyum direnç veya DsRed floresan seçilmek üzere bitkiler tohum kat olarak ve sefaloridin direnç bakteri içinde bir seçim olarak kullanılabilir. Burada, bir dizi protokol okuyucu transgenik bitkiler pBIBAC-GW kullanarak oluşturma işlemi boyunca rehberlik sunulur: faiz dizileri tercih bir dönüşüm tesisi için pBIBAC-GW vektör içine yeniden birleştirme başlatma Agrobacterium, seçim transgenics ve bitkiler DNA kurutma kullanarak ekleme intactness ve kopya sayısı için sınama. Dikkat bir DNA blotting stratejisi tasarlama için tek ve çok kopyayı entegrasyonlar, tekli ve çoklu loci tanımak için verilir.

Introduction

Transgenik bitkiler oluştururken, genellikle nesnel stabil ifade entegre transgene(s) sahip olmaktır. Bu bir transgene sağlam tek kopya entegrasyonlar tarafından sağlanabilir. Birden çok entegrasyonlar bir transgene artan ifade, aynı zamanda gen susturmak için yol açabilir. Eklenen dizileri tandem veya ters tekrarlar1,2,3,4düzenlenmiştir Eğer transgenes susturmak daha yüksektir. İkili vektörel çizimler mekikler Agrobacteriumiçinde sınırlayıcı olarak kullanılır-faiz dizileri bitki genleri içine sunmak için dönüştürme deneyler aracılı. Tümleştirmeleri bitki genom içine sayısı Agrobacterium tumefaciens5,6. ikili vektör kopya sayısına bağlıdır Birçok sık kullanılan ikili vektörel çizimler vektör yüksek Kopyala vardır ve bu nedenle yüksek ortalama transgene kopya numarası verim: 3.3-4,9 kopya Arabidopsis5.

T-DNA entegrasyonlar sayısı BIBAC7gibi veya bir T-DNA A. tumefaciens kromozom5başlatarak A. tumefaciensiçinde düşük-kopya numarası olan ikili vektörel çizimler kullanarak indirdi. Ortalama transgene entegrasyonlar bu gibi durumlarda 25,8,9,10aşağıda sayısıdır. Olması sebebiyle tek-kopya A. tumefaciens ve aynı zamanda Escherichia coli, BIBAC türevleri korumak ve yapıları 150 kb11büyüklüğünde teslim.

GW-uyumlu BIBAC vektörler10,12 genler ilgi kolay başlangıç ağ geçidi klonlama kullanarak vektör içine izin verir. Ağ Geçidi teknoloji kullanımı büyük ölçüde kolaylaştırır klonlama yordamı, ama aynı zamanda büyük düşük-kopya-sayı vektörel çizimler13,14, düşük bir DNA verim ve benzersiz kısıtlama sınırlı bir seçim gibi ile ilgili ortak sorunları üstesinden gelir 7,11klonlama için kullanılabilir bir bölge. PBIBAC-GW türevleri Glufosinate-amonyum (pBIBAC-BAR-GW) her iki direnç veya DsRed floresan tohum kat (pBIBAC-RFP-GW) seçilmek üzere bitkiler (şekil 1)10,12olarak mevcuttur. Her iki Vektörler, sefaloridin direnç gen bakteri seçim işaretçisi olarak kullanılır.

PBIBAC-GW vektörel çizimler birleştirmek: (1) kolay tasarım ve E. colive (2) sağlam tek kopya entegrasyonlar planta içinde yüksek verimlilikle genetik manipülasyon. PBIBAC-GW vektörel çizimler verim ortalama 1.7 entegrasyonlar Arabidopsis içinde tek bir taşıyan transgenik bitkiler yaklaşık yarısı üzerinde T-DNA10entegre.

Kararlı transgenes çoğu transgenics oluşturulan için zorunlu bir ifadesidir. İstikrarlı transgene ifade olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar tarafından elde edilebilir. Transgenik bitkiler olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar taşıyan ile çalışıyor, ancak, örneğin, amaç süreçlerinin verimliliği Kromatin tabanlı, mutagenesis, Rekombinasyon, veya onarım ve bu bağımlılık gibi çalışma için ise daha da önemli süreçleri genomik konumu ve Kromatin yapısı ekleme sitesi. Bizim ilgi için yönetmen Oligonükleotid mutagenesis (ODM) bağımlılığı yerel genomik içeriğine, eğitim için oluşturulan (Şekil 2)10bir muhabir çizgi kümesi mutagenesis muhabir gen olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar ile oldu. Bu çizgiler kümesi kullanarak, ODM verimliliği transgenik loci rağmen oldukça benzer olarak transgene ifade düzeyleri farklı genomik yerlerde entegre arasında değişir gösterildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ilgi dizisi ikili vektör ekleme

  1. Ağ geçidi giriş ve ikili vektörel çizimler hazır olun.
    1. Bir DNA parçası veya tedarikçi öneriler göre Mini hazırlık seti kullanarak ilgi gen içeren ağ geçidi giriş vektör yalıtmak.
      Not: BIBAC-GW vektörel çizimler sefaloridin (Km) seçilmek üzere bakteri, bu nedenle kullanılmasını sağlayın, sefaloridin yerine başka bir direnç marker ile bir giriş vektör kullanın. Örneğin, gentamisin direnci gen taşıyan pENTR-gm vektör iyi seçim12' dir.
    2. Yaymak ve ilgi BIBAC-GW vektör yalıtır. Ağ Geçidi kaset içinde mevcut ccdB gen toksisite dayanıklıdır bir E. coli zorlanma kullanın. Kullanarak ayrı tut moduyla BIBAC vektörler protokolleri veya tedarikçi öneriler göre büyük plazmid için özel olarak tasarlanmış kitleri.
  2. Bir ağ geçidi tepki taşımak.
    1. LR Rekombinasyon tepkimesi tedarikçi öneriler göre hazırlayın. Aşağıdaki bileşenler, oda sıcaklığında (RT) 1.5 mL microcentrifuge tüp, mix: 100 – 300 ng giriş klon (supercoiled), 300 ng BIBAC-GW vektörünün, LR Clonase reaksiyon arabellek (son konsantrasyonu: 1 x). TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) ile 16 µL karışıma seviyesini ayarlamak. Son olarak, LR Clonase enzim karışımı ve mix 4 µL tarafından vortexing ekleyin. 25 ° C için 1 h karisimin kuluçkaya.
    2. LR tepki İndinavir K çözüm (2 µg/µL) 2 µL ekleyerek 1.2.1 adımda hazırlanan karışıma sonlandırın. Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. E. coli elektroporasyon tarafından ağ geçidi tepki karışımı ile dönüşümü.
    1. LR tepki karışımı elektroporasyon önce desalt.
      Not: Bu başarılı elektroporasyon için kritik bir adımdır. Diyaliz açıklanan, ama diğer yöntemler gibi yağış sodyum asetat ile yöntemidir ve etanol de kullanılabilir.
      1. Belgili tanımlık tertibat LR tepki filtre diyaliz için hazırlayın. Ultrasaf deiyonize su 20 mL steril Petri kabına dökün. Bir membran filtre disk yerleştirin (gözenek boyutu 0.025 µm =) su yüzeyinde.
      2. Tüm LR tepki dikkatle membran üstüne pipette ve RT 1 h için diyaliz karışım izin verin.
    2. Elektro-yetkili DH10B hücrelerde bir elektroporasyon küvet (0.1 cm) 5 µL desalted LR karışımı ekleyin. Electroporate hücreler (1,5 V/cm, direnç 200 Ω, kapasite 25 µF) ve hemen 1 mL Önceden ısıtılmış Super Optimal Catabolite baskı (SOC) orta kuluçka 45 dk, 180 rpm için 37 ° C'de ve ardından hücreleri ekleyin. (SOC orta, Bacto tryptone, Maya 5 g 1 l: 20 g özü, NaCl, 0,5 gr 1 m KCl 2.5 mL, 1 m 20 mL filtre sterilize-glikoz).
      Not: DH10B hücreleri stabil büyük plazmid korumak diğer E. coli hücreler için yedek olabilir.
      Not: Optimum elektroporasyon koşulları elektroporasyon ayg bağlıdır.
    3. Cips bakteri 30 için maksimum hızda s bir microcentrifuge kullanarak aşırı SOC kaldırmak ve Pelet yaklaşık 50-100 µL Luria-Bertani (LB) orta içinde resuspend. Sefaloridin-LB (Km-LB) plakaları (Km konsantrasyon, 40 µg/mL) bakteri yaymak ve 37 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya. (LB orta, Bacto tryptone, Maya 5 g 1 l: 10 g özü NaCl 10 g. Katı orta için ekleyin agar, 15 g/L).
  4. Recombined BIBAC-GW türevleri tanımlanmasını ve yalıtılmasını plazmid DNA.
    1. Km-LB Tabaklarda büyümek için E. coli hücreleri ccdB sıra ile istenen Ekle yerine recombined BIBAC-GW plazmid içermelidir. Koloni Polimeraz zincir tepkimesi (PCR)15 bakteri kolonileri tabak BIBAC-GW omurga ve faiz ekleme sahip doğru plazmid içerip içermediklerini denetlemek için kullanın.
      1. PBIBAC-BAR-GW omurga tanımlamak için astar DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 ile PCR15 reaksiyonu gerçekleştirmek 've DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Bu astar set bar gen 563 bp parçası güçlendirir.
      2. BIBAC-RFP-GW omurga varlığını denetlemek için astar M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 kullanarak bir PCR15 tepki gerçekleştirmek 've M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Bu astar kombinasyon cruciferin promotor ve rfp sırası örtüşen bir 791 bp parçası güçlendirir.
      3. PCR15 reaksiyonlar ilgi Ekle varlığı için kontrol etmek için gene özgü primerler kullanılarak gerçekleştirin.
    2. 2-5 ml sefaloridin (40 µg/mL) DNA izolasyon16içeren LB orta pozitif bir koloni aşılamak. Orbital Çalkalayıcı 180 RPM, 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
    3. Plazmid DNA izole (bkz. Adım 1.1.2).

2. çiçek daldırma, Arabidopsis için A. tumefaciens hazırlanması

  1. BIBAC-GW türevleri için A. tumefaciensdönüşümü.
    1. A. tumefaciens zorlanma C58C1 pCH32 taşıyan yardımcı elektro-yetkili hücreleri plazmid7hazırlayın. Bakteri varlığında tetrasiklin (5 µg/mL) ve pCH32 için seçin ve yalnızca Agrobacterium hücrelerinin büyümesini sağlamak için Rifampisin (100 µg/mL) büyümek.
    2. Eklemek 0,25-0,5 µg DNA pBIBAC-GW türev önceden çözünmüş 10-20 µL steril ultrasaf deiyonize su, 20 µL yetkili Agrobacterium hücre çoğalmasıyla cuvettes (0.1 cm). Hücreler buz üzerinde tutmak.
    3. Electroporate hücreleri (1,5 V/cm, direnç 400 Ω, kapasite 25 µF). Hemen sonra çoğalmasıyla, 1 mL Önceden ısıtılmış (28 ° C) SOC orta için bakteri ekleyin ve 60-90 dakika 28 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    4. 100 µL ve bakteri Rifampisin (100 µg/mL), tetrasiklin (5 µg/mL) ve sefaloridin (40 µg/mL) içeren ayrı LB Tabaklarda kalan yaymak ve karanlıkta 28 ° c için 1-2 gün kuluçkaya.
  2. Agrobacterium süspansiyon hazırlamak.
    1. PCR tarafından birkaç adım 2.1.4, doğru vektör varlığı için hazırlanan plaka A. tumefaciens kolonileri kontrol edin (bkz. Adım 1.4.1).
    2. Çizgi (bkz. Adım 2.1.4) antibiyotik içeren bir LB plaka üzerinde uygun eklemek ile ikili vektör içerecek bir koloni doğruladı. 28 ° C'de gecede büyümek.
    3. 2.2.2. adımda elde bir koloni ile çizgiler tekrarlayın.
    4. Bir koloni preculture için antibiyotik (bkz. Adım 2.1.4) ile takıma LC orta 2.5 ml aşılamak. En az 8 h 28 ° C'de veya gecede, 180 RPM kuluçkaya. (LC orta, Bacto tryptone, Maya 5 g 1 l: 10 g özü, 0,5 gram NaCl, 2.5 g MgSO4 · 7 H2O, maltoz, 2 g).
    5. Preculture--dan adım 2.2.4 ekleyin. 250 ml LC (bkz. Adım 2.1.4) antibiyotik ile desteklenmiş ve 28 ° c, 180 RPM, gecede büyümek.
    6. Pelet iplik 5.500 x g 12 dakika süreyle de kültüründen yeniden askıya Pelet 100 mL solüsyon içeren % 5 sukroz, %0,05 Silwet L-77, MS. Pour süspansiyon çiçek daldırma için steril bir kap içine x 0.5 bitkiler.

3. Arabidopsis dönüştürme

  1. Arabidopsis bitkiler dönüşüm için hazır olun.
    1. Onlar (daldırma başına 9 bitkiler ile her 12 tencere) çiçeklenme kadar sera veya iklim kontrollü büyüme odasında Arabidopsis bitkiler büyümek.
    2. İlk cıvata ortaya daha fazla ikincil cıvata izin vermek için küçük. Bitki bitkiler pek çok olgunlaşmamış çiçek başları ve çok değil varken 4-6 gün sonra kırpma, daldırma için hazır siliques döllenmiş.
  2. Çiçek daldırma
    1. 5 – 10 s 2.2.6 adımda hazırlanan Agrobacterium süspansiyon için çiçek daldırma. Nazik ajitasyon kullanın.
    2. Yüksek nem tutmak için sarılmak film bitkilerde birbiri bölümlerini sarın ve bitkiler karanlıkta tutmak için bir kutu ile bitki kapları kapsar. Bitkiler sera/büyüme odasında 2 gün kuluçkaya.
    3. Kutu ve sarılmak film kaldırın ve bitkiler olgunluk bir sera/büyüme odası büyümek.
      Not: dönüşüm verimliliğini artırmak için aynı bitkiler ilk daldırma sonra yeniden daldırma galvaniz 7 gün olabilir.
    4. Tohumlar hasat. Havuz ve tek bir set olarak aynı yapı ile dönüştürülmüş bitkilerin tohum (T1) analiz.
  3. Transgenik bitkiler için ekran.
    1. Transgenik bitkiler pBIBAC-RFP-GW türev ile dönüştürülmüş için ekran için Floresans mikroskobu kullanılarak tohum analiz. DsRed ifade tohum kat algılamak için tohumlar bir uyarma 560 nm ve emisyon 600-650 nm görüntü. Floresan tohum floresan sigara karşıtları forseps kullanarak ayırın.
    2. PBIBAC-BAR-GW türev ile dönüştürülmüş transgenik bitkiler için ekran için toprak (~ 2500 tohum/0,1 m2) ile dolu kasetlerine tohumları ekmek. Hatta tohumları tepsileri yayılmasını sağlamak için tohumlar Murashige Skoog orta (MS) x %0.5 0,1 agar askıya ve 1 mL pipet kullanarak Tohum yaymak.
      Not: zaman uyumlu bir şekilde çimlenme için tohum harekete geçirmek için tohumlar 4 ° C'de en az 2 gün kuluçkaya Bu önce veya sonra tohum Ekim yapılabilir.
      1. Fidan % 0.5 Glufosinate-amonyum çözüm 2 hafta ve 3 hafta sonra tepsilerde Ekim ile sprey. 500 mL Glufosinate-amonyak çözeltisi 1 m2başına kullanın.
      2. Hayatta kalan Fideler için bireysel tencere aktarın. Fidan (ikinci) Glufosinate-amonyum işlemden önce ve sonra bir tepsiye tipik bir görüntüsünü şekil 3' te gösterilmektedir.
      3. PCR tarafından Glufosinate amonyum dayanıklı bitkiler faiz yapı varlığı için analiz (bkz. Adım 1.4.1. Astar için).
        1. Genomik bitki DNA PCR Edwards ve ark. tarafından açıklanan yöntemi kullanarak ayrı tut 17

4. sayı ve güvenilirlik-in T-DNA tümleştirmeleri için Transgenics karakterize

  1. Kısıtlama sindirim stratejisi
    Not: enzimleri kullanılarak DNA Blot tarafından T-DNA entegrasyonlar ve kendi bütünlüğünü sayısını belirler. Bu yöntem tek tanıtılmasına olanak sağlar, ancak aynı zamanda entegrasyonlar genom içinde aynı veya farklı loci, tekrarlanan.
    1. Kısıtlama kesimi bir dizi olası farklı entegrasyon biçimlerini belirlemek için kullanın:
      1. Bir kez T-bağımsız olarak dizileri akış yukarı ve aşağı akım sınırlama sitenin (şekil 4A ve Şekil 7A-C) prob edebilmek için DNA ortasında, keser bir enzim seçin. Bkz: şekil 4Ave şekil efsane beklenen sonuçları ve yorumu için.
      2. Bir enzim veya faiz hemen (şekil 4B ve şekil 7A-D) tüm dizi kesme enzimleri birleşimini seçin. Bilinen uzunluğu herhangi bir sapma entegre kaset kesilmesi gösterir.
        Not: yalnızca sitozin metilasyonu için hassas olmayan enzimleri kullanmak için dikkat ediniz.
  2. Genomik DNA örnekleri hazırlayın.
    1. Faiz yapı taşıyan bitkilerden genomik DNA izole et. CTAB DNA miniprep yöntem DNA izolasyon18için kullanılabilir. DNA örneği almak için Arabidopsis DNA analizini leke, 2-2,5 µg genomik DNA'ın gereklidir. DNA'te 50 µL geçiyoruz.
    2. Jel Elektroforez16tarafından DNA bütünlük denetimi. Sağlam genomik DNA jel üstündeki bir ayrı grup olarak geçirir. DNA bozulma bir smear varlığı kabul edilebilir. Tekrarlanan donma-çözülme nedeniyle DNA hasarı önlemek için genomik DNA örnekleri 4 ° C'de tutulur
    3. Enzim tedarikçi tarafından önerilen arabellek koşul kullanma genomik DNA (2 – 2,5 µg Arabidopsis genomik DNA durumunda) 50 µL, gecede, toplam hacmine sindirmek.
      1. Bir test tüpünde 2-2,5 µg Arabidopsis genomik DNA, 5 µL 10 x kısıtlama arabellek ve 5 U restriksiyon enzimi toplam 50 µL ultrasaf deiyonize suyla karıştırın.
    4. Kısıtlama örnekleri üzerinde bir jel yüklemeden önce yükleme boya (1 son konsantrasyonu x) ekleyin. İyi görsel izleme için aşağıdakilerden birini kullanın: küçük parçaları (Bromophenol mavi, 350-400 bp) ile comigrating veya daha büyük parçaları (Cylene cyanol, 3-4 kbp) ile comigrating.
  3. DNA jel çalıştırın.
    1. Bir uzun (20 cm) 0.5 x TBE özel jel19hazırlayın. Özel jel içinde yüzde beklenen parça boyutlarına bağlıdır. 0,8-%1 en iyi şekilde ayıran parçaları > 1 kb içinde büyüklük. 1-%1,5 özel parçaları için kullanın < 1 kb. Etidyum bromür jöleye eklemeyin. (5 x TBE, Trizma 1 l: 54 g taban, Borik asit, EDTA 3.75 g 27,5 g).
      Not: DNA kirlenmesini önlemek için DNA Plazmid ve PCR fractionate için kullanılmayan kullanım jel tepsileri güçlendirilmiş.
    2. Jel19örnekleri yükleyin.
    3. Beklenen parçaları boyut aralığında olan jel DNA işaretlerine ekleyin. Yaklaşık 1 µg işaretleyici (50-250 ng farklı ölçekli parçasının) görselleştirme UV ışık tarafından izin jel üzerinde yük.
    4. Alçak gerilim (40-50 V/500 mA), DNA gecede boyutu fractionate.
  4. Transfer özel jel DNA'ın naylon membran için hazırlayın.
    1. Jel ayrı bir tepsiye aktarın ve 20-25 dakika içinde 0,5 leke etidyum bromür içeren x TBE (5 µg/mL) tarafından bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de döner.
    2. UV transilluminator üzerinde jel görselleştirin. Genomik DNA görünürlüğünü ayrı uydu bantları (şekil 5A) dahil olmak üzere, boyut ayrılması doğrulayın. Düşük molekül ağırlıklı boyutları doğru bir smear DNA Bozulması gösterir.
    3. UV transilluminator bir şeffaflık jel üzerinde yatıyordu ve bir işaretleyici kalem (şekil 5B) Yuvaları ve marker grup konumunu işaretlemek. Bu işaret dizileri özellikle sonda DNA ile melez değil diye melezleşmiştir parçaları daha sonra boyutunu belirleme kolaylaştıracaktır. Bu adımda marker parçaları belirterek, hybridizing parçaları boyutunu izlemek mümkündür.
    4. Jel tepsisine geri koyun, ultrasaf deiyonize suyla durulayın ve jel içinde DNA fragmentize için 0.25 M HCl 15 dakika içinde daldırın. Ultrasaf deiyonize su ile yıkayın. Yeterince HCl ve su içinde belgili tanımlık tepsi jel kapsayacak şekilde kullanın ve orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de batık jel tepsiye döndürün.
    5. Ultrasaf deiyonize su ile yıkama 30 dakika süreyle denatürasyon arabellekte jel kuluçkaya. İçinde belgili tanımlık tepsi jel karşılamak için yeterli arabellek ve su kullanın ve orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de batık jel tepsiye döndürün. (Denatürasyon arabellek: 0,5 M NaOH, 1.5 M NaCl).
    6. Nötralizasyon arabelleği ultrasaf deiyonize su ile 30 dk. yıkama jeli kuluçkaya. Yeterli arabellek ve su içinde belgili tanımlık tepsi jel kapağı, orbital Çalkalayıcı üzerinde 40 rpm'de batık jel tepsiye döndürmek için kullanır. (Nötralizasyon arabellek: 0,5 M Tris, 1.5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. DNA bir naylon membran aktarın.
    1. Kapiller genomik DNA transferini Kurulum hazırlığı. Plastik tabak (yaklaşık boyutu jel veya daha büyük) 20 serum sodyum sitrat (SSC) x dolu bir tepsi üzerine getirin. Böylece her ikisi de uçlarından SSC içinde asılı olan kalın filtre kağıt tepsisi katlayın. Pozitif yüklü naylon membran Hybond N + jel ölçekli bir parçası ve 2 adet kalın filtre kağıdı kesti. (20 x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M sodyum sitrat).
    2. Blotting kurulum (şekil 6) jel, plastik plaka üzerinde filtre kağıdı üstünde aşağı yuvaları yerleştirerek hazırlayın. Hybond n membran üst üzerinde yer filtre kağıdı 2 kat tarafından takip. 20 her katmanda önceden ıslak onları derlemeye eklemeden önce x SSC. Bunlar DNA aktarımı engel olarak katmanlar arasında herhangi bir hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun.
    3. Kağıt mendil kalın bir tabaka ile montaj kapak. Üstüne küçük bir şişe gibi bir ağırlık ile bir plastik tabak koyun. Basınç jel üzerinde eşit olarak bölünür emin olun. Bu DNA'ın uygun transfer sağlayacaktır.
      Not: Ağırlığı yaklaşık 200-300 g olmalıdır; ağır ağırlık DNA aktarımı engel.
    4. 20 x SSC tampon ve naylon membran doğru kılcal kuvvetler hedef buharlaşma önlemek için sarılmak film (şekil 6) ile maruz kalan filtre kağıdı dahil derleme çevreleyen alanı kapsamaktadır. Gecede leke.
    5. Yuvaları, adı ve/veya tarihi membran üstüne konumunu kalemle işaretlemek ve membran montaj kaldırın. Not jel ile temas oldu alt yüzünde DNA taşır.
    6. UV Crosslinker kullanarak DNA UV ışınlama (2400 µJ/m2) tarafından membran için sorunu hemen.
      Not: Crosslinking koşulları kullanılan membran türüne göre değişir.
      Not: Bu noktada membran-20 ° C'de depolanan ve olması için hibridizasyon bir sonda ile daha sonra kullanılan. 2 x SSC ve buna ön-20 ° C'de yerleştirerek önce ısı polietilen boru katlanmış mühür çapraz membran durulama
  6. Hibridizasyon için sonda hazırlayın.
    1. DNA PCR20tarafından kurutma için sonda kullanılmak üzere sıra yükseltmek. 50-100 ng 250 bp-2 kbp PCR parçanın bir sonda kullanılır. İki ayrı problar, bir sağ kenarlık proksimal bölge ve diğer T-DNA'ın sol kenarlık proksimal bölgesine hybridizing varlığı tüm T-DNA'ın (şekil 4A ve Şekil 7) değerlendirmek için kullanılabilir.
    2. 50-100 ng tüp bebek ultrasaf deiyonize su 24 µL PCR ürününün sulandırmak.
    3. Su ve ısı bloğunun bir ölçek için 5 dk kaynatılarak seyreltilmiş PCR ürünü tabiatını, sonra doğrudan buz üzerinde serin.
    4. Hazır GCT-mix buz çözme. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (tüm 0,5 mM), rastgele hexamers 43,2 ng/µL, Acetylated BSA 1.33 mg/mL, β-mercaptoethanol, 0.67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6.8, 17 mM MgCl 33 mM).
    5. 21 µL GCT karıştırın ve 2 Klenow U parçası PCR ürünü ekleyin.
    6. [32P] ATP 2 µL karışıma ekleyin ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
      Dikkat: tüm adımları [32P] ATP içeren uygun koruma kullanırken radyoaktif çalışma için belirlenmiş bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekir.
      Not: [32P] ATP taze olduğundan emin olun (fazla 1 yarı zamanlı geçti).
    7. Sephadex G-50 (kaba veya orta) sütun21 etiketli sonda gelen adi (radyoaktif) nükleotit arıtma için hazır olun. 2 mL şırınga al ve kalın filtre kağıdı küçük bir daire ile çıkış kapağı. Sephadex G-50 2 mL şırınga TE içinde çözünmüş eklemek ve tüm sıvı iplik tarafından sütundan kaldırın.
    8. Sütun bir 15 mL plastik tüpün içine yerleştirin, sütun etiketli sonda yük ve spin oda sıcaklığında (750 x g santrifüj ayarla, 750 x g ulaşılana kadar artırmak devir/dakika izin ver, sonra santrifüj durdurmak ve 0 x g azalmaya dönüş) elute için sonda. TE 200 µL sütun ve spin kalan sonda elute ekleyin; bir kez yinelenir. Bu koşullarda etiketli DNA parçalarının Sephadex matris hariç tutulur ve ücretsiz nükleotit sütunda kalırken elute.
    9. Etiketli inceleyebilirsek hibridizasyon tüp başına 300 µL kullanın. -20 ° c daha sonra kullanım için kalan etiketli sonda tutun. Ancak, yarı [32P] ATP göz önünde bulundurun.
  7. DNA leke melezlemek.
    1. Isı 2 x SSC ve hibridizasyon tampon (hibridizasyon tüp, tüp başına 2 lekesi, maksimum başına 15 mL) ile 65 ° c (Hibridizasyon arabellek: % 10 dextran sülfat, % 1 SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 65 ° C'de geçiyoruz, aliquots-20 ° C'de tutmak).
    2. Ön ısı hibridizasyon fırın 65 ° C.
    3. Yer naylon mesh içinde biraz ısıtmalı (65 ° C) 2 ile bir tepsi tepsi kapsayacak şekilde x SSC. DNA leke DNA tarafı ile mesh üstüne yerleştirin. Leke mesh ile birlikte rulo ve rulo hibridizasyon tüp içine yerleştirin. Fazla 2 dökmek x SSC.
    4. Microcentrifuge tüp içinde somon Sperm DNA'ın 150 µL kaynatın (konsantrasyonu 10 mg/mL) 5 min için hibridizasyon tüp başına (Ayrıca bkz: adım 4.6.3). Hemen buz üzerinde serin ve Önceden ısıtılmış hibridizasyon arabelleğe eklemek.
    5. Hibridizasyon arabellek-somon Sperm çözüm leke ile tüp ekleyin. 65 ° c en az 1 h 12 rpm'de dönen bir tekerlek için önceden melezlemek.
    6. Ne zaman adım 4.7.5 ön kuluçka. Neredeyse bitti kaynatın 300 µL 5 min için etiketli inceleyebilirsek (Ayrıca bkz: adım 4.6.3) ve hemen sonra kuluçka leke için ekleyin.
    7. Gecede 63 ° c, 12 rpm dönen tekerlek melezlemek. Sondayı doğrudan üzerinde leke ama hibridizasyon arabellek-somon Sperm çözüm içine pipette değil.
  8. Leke yıkayın.
    1. Yıkama çözümler Onceden (1 x SSPE, SDS % 0,1 ve 0,1 x SSPE, % 0,1 SDS) ile 65 ° c (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7,0).
    2. Hibridizasyon çözüm atın ve yaklaşık 100-150 mL 1 eklemek x SSPE, % 0,1 SDS çözüm hibridizasyon tüp, tüp kapatın ve el ile döndürün. Hibridizasyon ve uygun sıvı radyoaktif atık çözümde yıkama dökün.
    3. Yaklaşık 100-150 mL 1 eklemek x SSPE, tüp, % 0,1 SDS çözüm kapatın ve tüp dönen tekerlek, 12 rpm 63 ° C'de 15 dakika kuluçkaya. Yıkama çözüm uygun şekilde atın.
    4. Yaklaşık 100-150 mL 0.1 eklemek x SSPE, % 0,1 SDS çözüm hibridizasyon tüp kapatın ve 63 ° c, 12 devir/dakika 5 min için tüp döndürün. Yıkama çözüm uygun şekilde atın.
    5. Tüp dışarı leke alıp yeterli Önceden ısıtılmış 0.1 x SSPE, % 0,1 SDS ve sallamak 3 dk. 65 ° C'de titreyen bir su banyosunda için içeren bir tepsi içinde yerleştirin Bu arada, kafes içinde su ile dolu bir tepsi durulayın.
    6. Leke çıkar, önceden katlanmış plastik (polietilen boru) arasında yer, dikkatle aşırı sıvı temizle ve kısa bir süre kuru blot izin. Sıvı phosphorimager ekran berbat olacak unutmayın.
    7. Leke plastik üç tarafı kapatın. Leke çevreleyen tüm aşırı sıvı kaldırmak ve dördüncü yan mühürleme tarafından plastik tüp kapatın. Plastik fazla kesti. Mühürlü leke değil sızdırıyor ve plastik dışarıdan kuru olduğundan emin olun.
  9. Phosphorimager ekran maruz.
    1. Mühürlü leke leke DNA tarafında karşı karşıya phosphorimager ekran ile bir phosphorimager kaset yerleştirin. Kaseti kapatmak ve radyoaktif etiketleme mukavemet ve duyarlılığını phosphorimager bağlı olarak 2-4 gün için ± bırakmak.
    2. Bir phosphorimager kullanarak phosphorimager ekran tarama. Taramadan önce ekran ışık için mümkün olduğu kadar az maruz için dikkat ediniz. Resmi kaydedin. Sinyal ekrandan parlak ışığa açarak silmek.
  10. Leke analiz.
    1. 4.1. adımda kullanılan kısıtlama strateji analiz bağlıdır. 4.1.1.1 (şekil 4A) adımda gösterilen strateji göre hazırlanan leke analiz ederken tespit parçaları sayar. Bu strateji, melezleşmiştir parça sayısı T-DNA entegrasyonlar sayısını ifade eder.
      1. Bir sonda soldaki (şekil 7B) ve T-DNA doğru (şekil 7C) parçası ile tespit parça sayısı karşılaştırın.
        Not: Eğer farklı bir hybridizing parça sayısı tespit, sonra her iki i) birden çok T-DNA kopya (ya doğrudan ya da ters yönde) veya II) eksik olarak entegre T-DNA'lar mevcut.
      2. Leke melezleşmiştir parçaları boyutlarda marker bantları boyutuna göre ve melezleşmiştir parçaları ile tandem eklemeleri (şekil 4A) kısıtlama stratejisinin temel boyutları hesaplanmasına beklenen parçası boyutunu karşılaştırmak tahmin T-DNA'lar düzenlenmesi mümkün tandem tanımlayın. Şekil 4A beklenen parçaları boyutunu hesaplamak için bir kılavuz olarak kullanın.
        Not: melezleşmiştir parçaları boyutunu hesaplanan olanlarla kabul sonra mevcut entegrasyonlar olasılıkla biri tamamlanmış değil.
    2. 4.1.1.2 (şekil 4B) adımda gösterilen strateji göre hazırlanan leke analiz ederken, işaretleyici bantları boyutuna göre leke üzerinde hybridizing parçası boyutunu tahmin etmek ve beklenen boyutu ile karşılaştırın. Sağlam bir ekleme ile tanımlanmış bir uzunluğu tek bir parça verir. Herhangi bir sapma beklenen uzunlukta eksik Tümleştirme (Şekil 7 d) gösterir.
  11. Şerit leke için yeniden hibridizasyon (isteğe bağlı).
    Not: Aynı leke arka arkaya farklı probları ile melezleşmiştir. Yeni bir sonda ile devam etmeden önce bir önceki melezleşmiştir sonda gelen leke şerit.
    1. Sonda leke kaldırmak için leke bir tepsi içinde onun DNA-yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. % 0.5 SDS bir fazlalık tepsiye dökün. Membran 2-5 dakika kaynatın. Tedavi süresi boyutu ve GC-kullanılan sonda içeriğine bağlıdır. Daha uzun ve daha zengin GC probları daha uzun bir tedavi gerekir.
    2. Sıyırma sonra başka bir sonda ile leke melezlemek veya mühür ve -20 ° C'de depolayın

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

BIBAC-GW sistemiyle, muhabir yapıları ODM bitkilerde eğitim için oluşturulan10vardı. Yapıları içinde ağ geçidi giriş vektör pENTR-gm12 tasarlanmış ve pBIBAC-BAR-ağ geçidi LR Rekombinasyon tepkimesi kullanarak GW (şekil 1) eklenir.

Arabidopsis pDM19, BIBAC-BAR-GW plazmid translasyonel kodonu pozisyonda 120 eYFP okuma çerçevesi içinde taşıyan bir mTurquoise-eYFP muhabir ile ile dönüştürülmüş (mTurquoise2-eYFP * 40) (Şekil 2)10. Toplamda, 126 Arabidopsis bitkiler dönüştürülmüş (pot, 14 tencere başına 9 bitkiler) olduğunu. Bu bitkilerin tohum, toprak ile tepsiler üzerinde ekili ve iki hafta önce tedavi Glufosinate-amonyak solüsyonu ile büyümeye izin havuzlu. (BIBAC-BAR-GW içinde mevcut) bar gen ifade fidan Glufosinate-amonyum tedavi (şekil 3) hayatta. Toplamda 11 transgenics pDM19 ile dönüştürülmüş, %0.02 analiz tohumların bir dönüşüm verimliliği için karşılık gelen tespit edilmiştir.

İzole 11 transgenics için DNA kurutma T-DNA entegrasyonlar sayısını belirlemek için kullanıldı. Bu amaçla, genomik DNA kesildi BglII ya da ani kalp durmasıile ben (stratejisi olarak hazirlanmis şekil 4Aüzerinde). Bu enzimleri her ikisi de yalnızca bir kez T-DNA dizisi (şekil 7A) kesti. Hibridizasyon bar ve Kodlayıcı bölgeler eYFP tanıma probları ile ilgili DNA parçalarının sayısı tespiti izin.

T-DNA eklemeleri muhabir satırlarındaki (Tablo 1) sayısını tahmin etmek için izin lekesi üzerinde bireysel DNA sayısı parçaları. Bar ve eYFP sonda ile tek hybridizing parçaları tek bir T-DNA entegrasyon varlığını göstermiştir. Analiz 11 transgenics altı tek entegrasyonlar taşıdı. Tümleştirmeleri ortalama sayısı 1.2 yapıldı.

Tek bir T-DNA entegrasyon taşıyan 6 satır için eklenen muhabir yapısı bütünlüğünü DNA (stratejisi olarak hazirlanmis üzerinde şekil 4B) kurutma kullanarak test edildi. Genomik DNA kesildi BglII ve PCIile ben Bar ve mTurquoise-eYFP füzyon gen (şekil 7A) içeren bir 5.5 kb parçası serbest bırakmak için. EYFP karşı bir soruşturması beklenen parçası algılamak için kullanıldı. Tüm bitkiler test sağlam bir parçası yapılır. Parça muayene Not sol ve sağ T-DNA sınır içermez ve bu nedenle tüm T-DNA, ama sadece faiz transgenes içeren bölüm bütünlüğünü incelemek değil.

Floresan muhabir gen ifadesinin yalnızca T-DNA genomik konumlarına göre farklı bağımsız tek-transgenik satırları kopyalayın tespit edilmiştir. CaMV-35S organizatörü tahrik mTurquoise-eYFP muhabir göreli transkript düzeyleri genomik pozisyon belirlenen10olduğu olduğu gibi tek kopya entegrasyonlar taşıyan dört DM19 muhabir satırlarında RT-qPCR tarafından ölçüldü. Muhabir gen ifade düzeyleri satır aralarını varyasyon küçük: mTurquoise-eYFP RNA düzeylerinde en fazla farkı logosuna 2 kat (şekil 8A).

Ardından, ODM Bu muhabir satırları gerçekleştirilmiştir. Üç dört bağımsız gazeteci satır dışında oldukça benzer ODM verimliliği (şekil 8B) gösterdi. Ancak, birinci hatta, DM19 [4] 1, diğer satırların karşılaştırıldığında çok düşük bir ODM verimliliği vermiştir. Bu sonuçlar ODM yerel genomik bağlamı tarafından etkilenir gösterir. Ne şekilde DM19 T-DNA Wuppertal'de yerel genomik bağlamında [4] 1 diğer satırlarında kalıntılar tespit edilmesi bundan farklıdır. Etkin ve etkin olmayan Kromatin izler, Sigara transgenik bitkiler genomik T-DNA Tümleştirme sitelerdeki kullanılabilir veri analizini bir cevap10sağlamadı.

Figure 1
Şekil 1: pBIBAC-GW vektörlerin fonksiyonel haritalar. pBIBAC-GW türevleri Glufosinate (bar) her iki direnç veya tohum kat (DsRed) olarak DsRed floresan tesislerinde bir seçim işaretçisi olarak mevcuttur. Her iki Vektörler, sefaloridin direnç gen seçim bakteri olur. CcdB kaset rekombinasyon gösteren Yeşil ok uçları arasında gösterilen ağ geçidi siteleri attR1 ve attR2. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Mutagenesis muhabir yapýsý. MTurquoise-eYFP muhabir gen 35S-CaMV promotor tarafından tahrik edilmektedir. Bölge desteği mTurquoise bir eYFP nükleotit pozisyonda 120 C-A mutasyonu taşıyan, bir erken translasyonel kodonu TAA ve füzyon proteinin çeviri erken sona ermesi ile sonuçlanan bölge desteği için erimiş. 3'Nopaline Synthase (3' nos) Poliadenilasyon sinyal yapı22transkripsiyon sonlandırmak için kullanılır. Nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) çekirdek için çevrilmiş proteinler hedeflemek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: tepsi dolu Arabidopsis fidan ile Glufosinate-amonyum işlemden önce ve sonra. Fidan pBIBAC-BAR-GW T mevcut bar gen ifade değil-Glufosinate-amonyum çözüm püskürtme sonra DNA die. Fotoğrafları aynı tepsiyi fidan(a)Glufosinate-amonyum, Ekim sonra 14 gün ve (B) ile 10 gün sonra püskürtme daha önce iki kez püskürtülür sonra göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: genel DNA kısıtlama strateji, intactness ve numarası belirlemek için eklenen T-DNA'lar. (A) bir kısıtlama site (R) T-DNA ortasında sağlar bağımsız T-DNA (yeşil R) sağ tarafında ve sol (kırmızı L) sondalama. Karikatürler sağdaki tek - veya multi - kopyayı T-DNA entegrasyonlar bağlı olarak, farklı bant desen DNA kurutma ile elde edilen gösterin. Bantları ile işaretlenmiş bir * kanat genomik DNA en yakın kısıtlama sitedeki diğer gruplarla uzunluğunu bağlıdır tanımlanmış bir uzunluğu vardır. Tek ekle: L ve R her iki vermek bir bağımsız parça sonda. Beklenen ortalama parça boyutu tabanlı genom kısıtlama sitedeki sıklığı hesaplanabilir. Uzaklık kısıtlama sitesinden sol kenarlık (LB) veya sağ kenarlık (RB), hangi ucunu entegrasyonu probed ve T-DNA sağlam olup olmadığını bağlı olarak en az boyutudur. Tandem tekrar: Probları L ve R için her iki iki parçaları ver; genomik DNA kanat parçaları içerir her sonda için ikinci parçası beklenen bir boyutu vardır ve her iki probları tarafından tanımlanır. Ters tekrar: Entegre kaset yön bağlı olarak bir m ve iki R parçaları, veya İki L ve bir R tespit edilebilir. Tek tek tek ekleme: Sonucu bir bağımsız parça sayısı ve parça sayısı entegrasyonlar sayısına karşılık gelir. (B) kısıtlama T-DNA ekstremite sitelerinde izin sınırlama siteler arasında parçasının bütünlüğü belirleme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: bir özel jel kısıtlama desen ve eşleşen şeffaflık. (A)üzerinde özel jel, genomik DNA sindirilmiş EcoRile ben gösterilir. DNA'ın doğru sindirim ayrı uydu bant varlığı ile gösterilmektedir. (B) işaretleme yuvaları ve marker bantları bir şeffaflık konumunu için daha sonra kolayca sağlar parçaları hybridizing boyutunu hesaplamak. Burada, MRC Holland işaretleri (mavi ve kırmızı), M. tarafından belirtilen kullanılan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: kılcal kurutma için Kur. Kurulum kurutma bir kılcal damar içinde filtre kağıdı 20 x SSC arabellekte asılı kağıt uçları ile plastik tabak içinde yer alıyor. Kağıdın 20 ile ıslak x SSC ve üzerinde yerleştirilmiş bir özel jel ardından naylon membran, filtre kağıdı ve dokuların bir yığın ekleyin. Bir hafif üst üzerinde yer alıyor. Bakım jeli, kağıt ve membran arasında hava kabarcıkları kaldırmak için alınır. Sarılmak film Kur dışarı kurutma önlemek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: strateji ve deneysel sonuç kurutma DNA örneği. Sayı ve T-DNA entegrasyonlar intactness belirlemek için strateji kurutma(a)DNA'sı. T-DNA içinde seçili enzimleri kesim yerleri ile dikey çubuklar gösterilir. Sindirilir genomik DNA hibridizasyon için kullanılan eYFP ve bar probları T-DNA aşağıda terminal noktalı bir çizgi kullanarak belirtilir. (B-D) Örnek DNA engelliyor. Genomik DNA ben ve leke bir bar ve eYFP sonda ile (B ve C) probed ani kalp durmasıile kesildi. Genomik DNA BglII ve PCIile ben kesilmiş ve bir bar sonda ile probed. Sağlam boyutu (D) 5.5 kbp oluşuyor. El örnekleri d B ve c gösterilenlerden farklı olduğunu not * beklenen parça boyutu; gösterir M, işaretleyici. B, C ve D aynı boyutu marker kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: mTurquoise-eYFP ifade düzeyleri ve ODM verimliliği bağımsız mTurquoise-eYFP muhabir satırlarındaki. (A)göreli mTurquoise-eYFP transkript düzeyleri RT-qPCR tarafından DM19 muhabir satırlarında ölçülür. Normalleştirme için transkript düzeyleri aktin kullanılmıştır. (B) ODM verimlilik DM19 muhabir satırlarında ölçülür. A ve B, barlar için en az beş biyolojik çoğaltır ortalamasını gösterir. Hata Çubuklarõn SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

T-DNA locus türü T-DNA entegrasyonlar Nr Muhabir hattı Tespit parça sayısı Bütünlük
Ani kalp durması Ben BGL II BGL II/PciI
Bar eYFP Bar eYFP eYFP
Tek locus entegrasyonlar 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2] -5 1 1 1 1 +
1 19 [2] -9 1 1 1 1 +
1 19 [2] -11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
2 ters, tekrar 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, eksik Tümleştirme 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Birden çok odağı entegrasyonlar 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND – belirlenmemiştir.

Tablo 1: Özet veri dönüştürme pDM19 ile sonra izole transgenics için kurutma DNA'ın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Üreten transgenics bir transgene tek, bozulmamış entegrasyonlar ile kullanılan ikili vektör seçimi çok önemlidir. BIBAC aile vektörel çizimler dizileri çıkarlarının birçok bitki türü23için,24,25,26,27,28teslim etmek için kullanılmaktadır. BIBAC Vektörler, BIBAC-GW, dahil olmak üzere verim tek kopya entegrasyonlar ile yüksek verim: 1.5 ile 2,5,9, en çok kullanılan ikili vektörler için 3 veya daha fazla karşılaştırıldığında eklenenleri satır başına, ortalama sayısıdır 29. BIBAC-GW vektörel çizimler ile diğer BIBAC Vektörler ile karşılaştırıldığında önemli bir gelişme olarak faiz dizisi kolayca ağ geçidi rekombinasyon siteleri12kullanarak eklenebilir. Değiştirilmiş vektörel çizimler geleneksel klonlama stratejileri kullanıldığında BIBAC vektörlerin genel sorunların üstesinden: i) çok sınırlı sayıda benzersiz kısıtlama siteleri ve II) düşük DNA verim. Ağ Geçidi rekombinasyon siteler BIBAC-GW vektörel çizimler transgenik bitkiler üretmek için ikili başka vektörler için cazip bir alternatif yapmak.

BIBAC-GW türevleri, faiz dizileri içeren bitki için dönüştürme ve DNA analizi için sayı ve transgenik sıralarının intactness leke oluşturma iletişim kuralları, bir dizi burada açıklanmıştır. Bu yazıda, bildirilen birkaç iletişim kurallarının klonlama, ağ geçidi elektroporasyon bakteri ve bitki dönüşümü, birçok laboratuar yaygın uygulama vardır ve hafif değişiklikler ile de gerçekleştirilebilir. BIBAC-GW bir tek kopya vektör E. coli ve A. tumefaciensolduğunu bilmek önemlidir. Bu nedenle, DNA izole, verimi düşük olur; Bu kadar yalıtım prosedürü ölçeklemek için tavsiye edilir.

Transgenics, birden çok T-DNA entegrasyonlar taşıyan tanıtılan transgenes kez gen1,2,4,30susturmak için tabi tutulmaktadır ve bu nedenle çoğu uygulama için kaçınılmalıdır. Transgenik bitkiler tek, bozulmamış entegrasyonlar ile tanımlamak için bu DNA blot analizi kullanmak için tavsiye edilir. DNA dışındaki yöntemleri kurutma T-DNA kopya sayısı ve T-DNA'lar transgenik satırlarındaki bütünlüğünü belirlemek için kullanılabilir (segregasyon analizi, kuyruk-PCR, kantitatif PCR (qPCR) ve dijital damlacık PCR), emek her ne kadar yoğun, DNA kurutma, çoğunlukla yönteminin seçimi. Segregasyon analizi çoklu arasında ayırt etmek mümkün değildir ve tek tek loci, T-DNA entegrasyonlar. KUYRUK-PCR kez altında tahminler kopya sayısı, özellikle birden çok T-DNA entegrasyonu hediyesi31' dir ve qPCR ihtiyacı ayrıntılı optimizasyonu için güvenilir sonuçlar31,32. Gerekli ekipman mevcut31ise dijital damlacık PCR kopya sayı algılama için oldukça hassas bir yöntemdir. DNA kurutma yararı kesilmiş T-DNA'lar, kolayca tüm PCR tabanlı teknikleri cevapsız facile algılama olduğunu.

DNA blot analizi ile hybridizing parçaları üzerinde leke sinyal ve boyut olarak iyi olarak tanımlanabilir olması gerekir. Çeşitli faktörler DNA kurutma sonucu etkileyen olduğu bilinmektedir. Ek olarak enzimleri ( şekil 4' te gösterilen strateji) uygun bir seçim ve boyutu işaretleri, kaliteli yeterli DNA gereklidir. Genomik Arabidopsis DNA az 2 µg iyi olarak tanımlanabilen parçaları vermez. Daha büyük genleri ile uğraşırken, daha fazla DNA gereklidir. Arabidopsis DNA yeterli miktarda elde etmek için çiçek dokular veya 1 - hafta eski fidan kullanılabilir. Bir Petri kabına üzerinde yetiştirilen Fideler toplu 2 – 8 µg DNA'ın verir. DNA yıkımı sırasında yalıtım önlemek amacıyla, bitki materyali hızlı işlemek için özen gösterilmelidir. Ayrıca, genomik DNA Tris-EDTA içinde onun bozulma azaltmak için enzimler tarafından resuspended ve 4 ° C'de depolanan yerine donma-çözülme döngüsü nedeniyle DNA nicking önlemek için-20 ° C tekrarladı. Emin eğer tüm DNA örnekleri tamamen sindirilmiş, DNA leke endojen, benzersiz genomik bölge tanıma bir sonda ile rehybridize için önerilmektedir. Sonda dizileri transgenik veya endojen serileri tanımlamak için seçerken, yalnızca benzersiz serileri seçmek önemlidir. Tam melezleşmiştir parçaları boyutunu belirlemek için DNA'ın pozisyonlar Yuvaları jel ve DNA işaretleyicisi bantları bir şeffaflık (şekil 5B) ne zaman bir etidyum bromür lekeli jel (şekil 5A) görüntülenmesi bir UV üzerinde işaretlenmiş olmalıdır transilluminator. Marker dizileri DNA prob ile melez değil veya hibridizasyon kısmi durumunda, parçaları hybridizing boyutu izlemek için tek yolu bu.

Bir kez bakım iyi hibridizasyon sinyal ve tahmini parça boyutu elde etmek için alınan, blotting sonuçları yorumu basittir. Tek bir restriksiyon enzimi kullanarak ve farklı ile hybridizing de tespit T-DNA sağa sola parçası probları, tespit edilen parça sayısı T-DNA eklemeleri sayısını yansıtır. Örneğin, şekil 7B, C aynı DNA leke gösterir melezleşmiştir ile farklı probları, bar (şekil 7B) ve gelişmiş sarı Floresan şekil 7Aiçinde gösterilen stratejisini kullanarak Protein (eYFP) (şekil 7C). 4 dışında tüm yolları parçaları eşit sayıda her iki açıkları göster: iki parçaları için satır 6 ve diğer tüm satırlar için tek bir parçası. Bu tespit edilen parça sayısı T-DNA eklemeleri sayısıdır.

Parça sayısı tespit ya da bağlama probları ile sol veya sağ T-DNA parçası ( şekil 7BgelinceC, satır 4) farklı eksik eklemeler varsa veya T-DNA'lar tandem düzeninde eklemiş olmanız. Tandem eklemeler rasgele olmayan parçası uzunluğu için bir T-DNA parçalarının (şekil 4A, doğru kapı aynası) görüntülemek ve melezleşmiştir parça boyutu kısıtlama strateji üzerinde dayalı beklediğim ile karşılaştırarak belirlenebilir. Ek bir blotting strateji T-DNA eklemeleri tandem düzenlenmesi onaylamak için gerekli olabilir. 4 (şekil 7B, C) satırında gösterilen örnekte iki eklemeler bir ters tekrar yönlendirmeli olarak düzenlenir.

Bir T-DNA veya bunun bir parçası intactness tahmin ederken, hybridizing parçasının uzunluğu temel kısıtlama strateji üzerinde hesaplanabilir. Beklenen boyutu herhangi bir sapma eksik bir ekleme varlığını gösterir. Örneğin, Şekil 7 diçinde lane 4, hybridizing bir parçası (yerine beklenen 5.5 kbp) gösteren bir kısıtlama sitelerin eksikliği nedeniyle artan parça boyutu 8 kbp adlı geçirir.

BIBAC-GW vektörel çizimler tek kopya sağlam entegrasyonlar bitki türleri bir dizi oluşturmak için mükemmel araçlardır. Rapor burada iletişim kuralı bitkiler tek, sağlam bir transgene ilgi entegrasyonlar ile tanımlamak için güvenilir bir yordam sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları bildirin.

Acknowledgments

Bu araştırma Hollandalı teknoloji Vakfı için bilimsel araştırma (NWO) Hollanda organizasyonun bir parçası olduğu ve hangi kısmen tarafından Ekonomik İşler Bakanlığı (OTP Grant 12385 MS) finanse edilmektedir STW (12385) tarafından desteklenmektedir.  Carol M. Hamilton (Cornell Üniversitesi, Amerika Birleşik Devletleri) pCH20, BIBAC-GW vektörel çizimler omurgası sağlamak için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Tags

Genetik sayı: 133 ikili vektör BIBAC ağ geçidi uyumlu ikili vektör bitki dönüştürme tek Tümleştirme gen susturmak DNA kurutma Southern Blot
Transgenik bitkiler BIBAC-GW ikili vektör kullanarak tek kopya ekleme ile oluşturma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter