Summary
باستخدام ناقل ثنائي ببيباك-GW يجعل توليد النباتات المعدلة وراثيا مع الملاحق نسخة واحدة سليمة، عملية سهلة. هنا، يقدم سلسلة من البروتوكولات التي ترشد القارئ من خلال عملية توليد نبات النباتات المعدلة وراثيا، واختبار نباتات إينتاكتنيس ونسخ عدد من إدراج.
Abstract
عند توليد النباتات المعدلة وراثيا، عموما الهدف أن يكون تعبير مستقر التحوير. وهذا يتطلب تكامل واحد، سليمة من التحوير، كما نسخ متعددة من التكامل غالباً ما يتعرضون لإسكات الجينات. ناقل ثنائي متوافق مع العبارة استناداً إلى الصبغيات الاصطناعية البكتيرية (ببيباك-GW)، مثل مشتقات ببيباك أخرى، يسمح إدراج المتسلسلات نسخة واحدة بكفاءة عالية. كما تحسن إلى ببيباك الأصلي، قد تم استنساخ كاسيت عبارة في ببيباك-غيغاواط، حيث أن تسلسل الفائدة يمكن الآن يسهل إدراجها في نقل المتجهات الحمض النووي (تي-DNA) باستنساخ بوابة. عادة، نتائج التحول مع ببيباك-GW في كفاءة من 0.2-0.5 في المائة، حيث نصف الوراثي القيام بدمج نسخة واحدة سليمة من T-الحمض النووي. تتوفر ناقلات غيغاواط ببيباك مع المقاومة إلى جلوفوسيناتي الأمونيوم أو دسريد fluorescence في المعاطف البذور للتحديد في النباتات، ومع مقاومة كاناميسين كمجموعة في البكتيريا. هنا، يقدم سلسلة من البروتوكولات التي ترشد القارئ من خلال عملية توليد النباتات المعدلة وراثيا باستخدام ببيباك-GW: بدءاً من إعادة ضم تسلسل الاهتمام داخل المتجهة غيغاواط ببيباك الاختيار، مصنع التحويل مع المتبعة، الانتقاء الوراثي واختبار النباتات لعدد إينتاكتنيس ونسخة من إدراج استخدام الحمض النووي النشاف. هو إيلاء اهتمام لتصميم استراتيجية blotting الحمض النووي الاعتراف التكاملات أحادية ومتعددة كوبي في المكاني الأحادي والمتعدد.
Introduction
عند توليد النباتات المعدلة وراثيا، عادة الهدف أن يكون transgene(s) المتكاملة ستابلي أعرب. وهذا يمكن أن تحققه التكاملات نسخة واحدة سليمة للتحوير. تكاملات متعددة يمكن أن يؤدي لزيادة التعبير عن التحوير، ولكن أيضا لإسكات الجينات. إسكات المتسلسلات على الأرجح إذا كان يتم ترتيب متواليات المدرج في ترادف أو تكرار مقلوب1،2،،من34. تستخدم ناقلات ثنائية مكوك في المتبعة-بوساطة تجارب التحول تقديم تسلسل الاهتمام إلى جينوم النبات. عدد اندماجات في جينوم نبات يعتمد على عدد نسخ ناقل ثنائي في5، tumefaciens المتبعة6. العديد من ناقلات ثنائي استخداماً هي نواقل نسخة عالية، وذلك يسفر عن عدد نسخ التحوير متوسط ارتفاع: نسخ 3.3 إلى 4.9 في نبات5.
يمكن خفض عدد تي-دنا التكاملات باستخدام ناقلات الثنائية التي تحتوي على عدد نسخة منخفضة في توميفاسينس أ، مثل بيبك7، أو بواسطة إطلاق تي الحمض النووي من الكروموسوم توميفاسينس أ- 5. عدد متوسط من التكاملات التحوير في مثل هذه الحالات أقل من 25،،من89،10. نظراً لأن نسخة واحدة في توميفاسينس (أ)، وكذلك في الإشريكيّة القولونية، يمكن الحفاظ على بيبك-المشتقات وتسليم بنيات كبيرة بقدر 150 كيلو بايت11.
غيغاواط المتوافقة بيبك ناقلات10،12 تسمح السهل إدخال الجينات للفائدة في الموجه استخدام بوابة الاستنساخ. استخدام التكنولوجيا بوابة يبسط إلى حد كبير إجراء الاستنساخ، ولكن أيضا يتغلب على المشاكل الشائعة المقترنة كبيرة منخفضة-نسخة-عدد ناقلات13،14، مثل الحمض النووي عائد منخفض، ومجموعة محدودة من قيود فريدة من نوعها المواقع المتوفرة لاستنساخ7،11. مشتقات ببيباك-GW متوفرة مع المقاومة أما إلى جلوفوسيناتي-الأمونيوم (ببيباك-بار-GW) أو دسريد fluorescence في المعاطف البذور (ببيباك-RFP-GW) للتحديد في النباتات (الشكل 1)10،12. لكل ناقلات، كجينات مقاومة كاناميسين علامة اختيار في البكتيريا.
الجمع بين ناقلات غيغاواط ببيباك: (1) سهل التصميم والتلاعب بالجينات في كولاي، واندماجات نسخة واحدة (2) سليمة في بﻻنتا بكفاءة عالية. العائد ناقلات غيغاواط ببيباك على التكامل المتوسط 1.7 في نبات مع ما يقرب من نصف النباتات المحورة وراثيا تحمل واحدة متكاملة تي-دنا10.
تعبير مستقر المتسلسلات شرطا لمعظم الوراثي التي تم إنشاؤها. تعبير مستقر التحوير يمكن أن تحققه التكاملات سليمة، ونسخة واحدة. بيد أن العمل مع النباتات المعدلة وراثيا تحمل التكاملات سليمة، ونسخة واحدة من أكثر أهمية إذا كان على سبيل المثال، يهدف إلى دراسة كفاءة العمليات المستندة إلى الكروماتين، مثل الطفرات وممارسو، أو إصلاح، والاعتماد على هذه العمليات في موقع جينومي وهيكل الكروماتين في موقع الإدراج. لمصلحتنا، لدراسة اعتماد الطفرات اليغنوكليوتيد الموجهة (ODM) في سياق الجينوم المحلية، كان مجموعة من خطوط مراسل مع التكاملات سليمة، ونسخة واحدة من الجين المراسل الطفرات التي تم إنشاؤها (الشكل 2)10. باستخدام هذه المجموعة من الخطوط، فقد ظهر أن كفاءة ODM يتراوح بين المكاني المعدلة وراثيا المتكاملة في مختلف المواقع الجينوم، على الرغم من مستويات التعبير التحوير بالأحرى مماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إدراج تسلسل الاهتمام متجه ثنائي
-
تعد "بوابة الدخول" وناقلات ثنائي.
- عزل ناقلات "إدخال العبارة" يحتوي على جزء من الحمض النووي أو الجينات من اهتمام باستخدام مجموعة أدوات الإعداد المصغر وفقا للاقتراحات المقدمة المورد.
ملاحظة: متجهات بيبك-GW تتطلب استخدام كاناميسين (كم) للتحديد في البكتيريا، ولذلك، استخدم متجه إدخال مع علامة مقاومة آخر بدلاً من كاناميسين. على سبيل المثال، ناقل بينتر-الآلية العالمية، تحمل جينات مقاومة جنتاميسين، هو اختيار جيد12. - تنتشر وعزل ناقل بيبك-غيغاواط من الفائدة. استخدام عبئا كولاي مقاومة لسمية الجينات ccdB موجودة داخل كاسيت العبارة. عزل بيبك-موجهات باستخدام بروتوكولات أو مجموعات مصممة خصيصا والبلازميدات كبيرة وفقا للاقتراحات المقدمة المورد.
- عزل ناقلات "إدخال العبارة" يحتوي على جزء من الحمض النووي أو الجينات من اهتمام باستخدام مجموعة أدوات الإعداد المصغر وفقا للاقتراحات المقدمة المورد.
-
القيام برد فعل على عبارة.
- إعداد رد فعل جزئ LR وفقا للاقتراحات المقدمة المورد. خلط المكونات التالية في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي في درجة حرارة الغرفة (RT): 100 – 300 نانوغرام دخول استنساخ (سوبيركويليد)، 300 نانوغرام ناقلات بيبك-غيغاواط، كلناز LR رد فعل المخزن المؤقت (التركيز النهائي: س 1). ضبط حجم الخليط إلى 16 ميليلتر مع الشركة المصرية للاتصالات (مم تريس، 1 مم يدتا، pH 8.0 من 10). أخيرا، إضافة 4 ميليلتر كلناز LR إنزيم المزيج، ومزيج من فورتيكسينج. احتضان هذا الخليط عند 25 درجة مئوية ح 1.
- إنهاء رد فعل LR بإضافة 2 ميليلتر لحل "ك البروتيناز" (2 ميكروغرام/ميليلتر) إلى خليط إعدادها في الخطوة 1.2.1. خلط واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
-
تحويل كولاي مع خليط رد فعل العبارة التي انهانسر.
- تحلية الخليط رد فعل LR قبل انهانسر.
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة بالنسبة لنجاح انهانسر. أدناه الغسيل الكلوي هو الأسلوب الأساليب الموصوفة، ولكن الأخرى مثل هطول الأمطار مع خلات الصوديوم ويمكن أيضا استخدام الإيثانول.- تحضير الإعداد لتصفية الغسيل الكلوي لرد فعل ل. ر. صب 20 مل مياه عالي النقاوة في طبق بتري معقم. ضع قرص تصفية الأغشية (حجم المسام = 0.025 ميكرومتر) على سطح الماء.
- "الماصة؛" رد فعل LR كامل بعناية على رأس الغشاء والسماح الخليط دياليزي على RT ح 1.
- إضافة 5 ميليلتر من مزيج LR ديسالتيد إلى خلايا DH10B الكهربائية المختصة في ومبومو انهانسر (0.1 سم). اليكتروبوراتي الخلايا (1.5 V/سم، Ω مقاومة 200، السعة 25 µF)، وفورا إضافة 1 مل قبل حرارة متوسطة القمع (شركة نفط الجنوب) "سوبر كاتابوليتي الأمثل" للخلايا، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية عن 45 دقيقة، و 180 لفة في الدقيقة. (شركة نفط الجنوب متوسطة، ز 20 l: 1 من بكتو تريبتوني، 5 غ خميرة استخراج، 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم، 2.5 مل 1 م بوكل، تصفية 20 مل م 1-تعقيم الجلوكوز).
ملاحظة: يمكن أن يكون محل DH10B الخلايا لخلايا أخرى كولاي التي تحتفظ ستابلي والبلازميدات كبيرة.
ملاحظة: شروط انهانسر المثلى التي تعتمد على الجهاز انهانسر المستخدمة. - بيليه البكتيريا بأقصى سرعة ممكنة ل 30 s استخدام ميكروسينتريفوجي، إزالة الزائدة شركة نفط الجنوب، وريسوسبيند بيليه في حوالي 50-100 ميليلتر من المتوسطة بيرتاني لوريا (رطل). تنتشر البكتيريا في لوحات كاناميسين رطل (كم رطل) (تركيز كم، 40 ميكروغرام/مل)، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. (رطل متوسطة، 1 l: 10 غ من بكتو تريبتوني، 5 غ خميرة استخراج، 10 غم من كلوريد الصوديوم. وبالنسبة المتوسطة الصلبة إضافة أجار، 15 غرام/لتر).
- تحلية الخليط رد فعل LR قبل انهانسر.
-
تحديد مشتقات بيبك-GW recombined وعزل بلازميد الحمض النووي.
- أن تكون قادرة على النمو على ألواح كم رطل، ينبغي أن تتضمن الخلايا كولاي بلازميد غيغاواط بيبك recombined التي يتم استبدال تسلسل ككدب مع إدراج المرجوة. استخدام مستعمرة Polymerase سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)15 للتحقق إذا مستعمرات البكتيريا في اللوحة تتضمن والبلازميدات الصحيح، وجود العمود الفقري بيبك-GW والإدراج للفائدة.
- لتحديد العمود الفقري ببيباك-بار-غيغاواط، أداء فعل15 PCR مع كبسولة تفجير DM1969 5 '-جكجاكجاجككاججاتاج-3' و DM1970 5 '-أتكاجتجكجكاجاكجتجاك-3'. مجموعة التمهيدي هذا يضاعف جزء bp 563 من الجينات بار .
- للتحقق من وجود العمود الفقري بيبك-RFP-غيغاواط، أداء فعل15 بكر، استخدام أجهزة الإشعال M737 5 '-كجتجتااااجكتاجاكتج-3' و M892 5 '-آكاجاتجتجكجتككك-3'. يضاعف هذا المزيج التمهيدي جزء bp 791 تداخل التسلسل كروسيفيرين مروج و طلب تقديم العروض .
- إجراء PCR15 ردود فعل استخدام كبسولة تفجير الجينات على حدة للتحقق من وجود تدخل للفائدة.
- تطعيم مستعمرة إيجابية واحدة في 2 – 5 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على كاناميسين (40 ميكروغرام/مل) ل عزل الحمض النووي16. احتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري 180 لفة في الدقيقة، بين عشية وضحاها.
- عزل بلازميد الحمض النووي (راجع الخطوة 1.1.2).
- أن تكون قادرة على النمو على ألواح كم رطل، ينبغي أن تتضمن الخلايا كولاي بلازميد غيغاواط بيبك recombined التي يتم استبدال تسلسل ككدب مع إدراج المرجوة. استخدام مستعمرة Polymerase سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)15 للتحقق إذا مستعمرات البكتيريا في اللوحة تتضمن والبلازميدات الصحيح، وجود العمود الفقري بيبك-GW والإدراج للفائدة.
2-إعداد A. tumefaciens "غمس الأزهار" من نبات
-
تحويل مشتقات بيبك-غيغاواط إلى توميفاسينس أ.
- إعداد الخلايا الكهربائية المختصة من A. tumefaciens سلالة C58C1 تحمل pCH32 مساعد بلازميد7. تنمو البكتيريا حضور التتراسيكلين (5 ميكروغرام/مل) والريفامبيسين (100 ميكروغرام/مل) تحديد pCH32 وضمان نمو الخلايا المتبعة فقط.
- إضافة 0.25 – 0.5 ميكروغرام الحمض النووي لمشتق ببيباك غيغاواط، قبل حله في 10 – 20 ميليلتر عالي النقاوة منزوع الماء المعقم، إلى 20 ميليلتر المختصة الخلايا المتبعة في الترعة انهانسر (0.1 سم). تبقى الخلايا على الجليد.
- اليكتروبوراتي الخلايا (1.5 V/سم، Ω مقاومة 400، µF السعة 25). فور انهانسر، أضف 1 مل المعالجون مسبقاً (28 درجة مئوية) شركة نفط الجنوب متوسطة للبكتيريا واحتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 60-90 دقيقة.
- انتشر 100 ميليلتر وبقية هذه البكتيريا في لوحات رطل منفصلة تحتوي على الريفامبيسين (100 ميكروغرام/مل) والتتراسيكلين (5 ميكروغرام/مل) كاناميسين (40 ميكروغرام/مل)، واحتضان في الظلام في 28 درجة مئوية لمدة 1-2 يوما.
-
إعداد تعليق المتبعة .
- تحقق من PCR زوجين من المستعمرات توميفاسينس ألف من لوحة إعدادها في الخطوة 2.1.4، لوجود ناقلات الصحيح (راجع الخطوة 1.4.1).
- الانتصارات وأكد مستعمرة واحدة تحتوي على ناقل ثنائي مع إدراج المناسبة على صفيحة رطل المحتوية على المضادات الحيوية (راجع الخطوة 2.1.4). تنمو عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- كرر streaking مع مستعمرة واحدة تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.2.
- تطعيم مستعمرة واحدة في 2.5 مل من LC المتوسطة وتستكمل مع المضادات الحيوية (راجع الخطوة 2.1.4) من أجل بريكولتوري. تبني في 28 درجة مئوية على الأقل 8 ح أو بين ليلة وضحاها، 180 لفة في الدقيقة. (LC المتوسطة، 1 l: 10 غ من بكتو تريبتوني، 5 غ خميرة استخراج، 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم، 2.5 g مجسو4 · 7 ح2س، ز 2 من مالتوس).
- إضافة بريكولتوري من الخطوة 2.2.4. 250 مل LC تستكمل مع المضادات الحيوية (راجع الخطوة 2.1.4) وينمو بمعدل 28 درجة مئوية، 180 لفة في الدقيقة، بين عشية وضحاها.
- بيليه ثقافة بالغزل في 5,500 س ز للحد الأدنى 12 تعليق إعادة بيليه في 100 مل محلول يحتوي على السكروز 5%, 0.05% L-77 سلفيت، 0.5 x السيدة من أجل التعليق في حاوية معقمة غمس الزهور من النباتات.
3-نبات التحول
-
تعد النباتات نبات للتحول.
- تنمو النباتات نبات في غرفة الدفيئة أو المناخ لنمو التي تسيطر عليها حتى أنها هي المزهرة (12 الأواني مع 9 محطات غمس).
- مقطع البراغي الأولى للسماح لأكثر مسامير الثانوية في الظهور. محطات مستعدون غمس 4 – 6 أيام بعد القطع، عندما يكون المعامل العديد من رؤساء زهرة غير ناضجة، وليس الكثير من المخصبة سيليكويس.
-
غمس الزهور
- تراجع inflorescences ل s 5 – 10 في تعليق المتبعة إعدادها في الخطوة 2.2.6. استخدام الانفعالات لطيف.
- التفاف في أجزاء فوق سطح الأرض من النباتات في الفيلم تتشبث الاحتفاظ بالرطوبة العالية، وتغطية أوعية النباتات مع مربع للحفاظ النباتات في الظلام. احتضان النباتات لمدة يومين في غرفة الدفيئة/نمو.
- إزالة المربع والفيلم تتشبث وتنمو النباتات إلى مرحلة النضج في غرفة الدفيئة/نمو.
ملاحظة: لزيادة كفاءة التحويل، يمكن أن النباتات نفسها انخفضت إعادة 7 أيام بعد غمس الأولى. - حصاد البذور. تجميع وتحليل البذور (T1) من النباتات، وحولت مع بناء نفسها، كمجموعة واحدة.
-
الشاشة للنباتات المعدلة وراثيا.
- على الشاشة للنباتات المعدلة وراثيا تحول مع مشتق ببيباك-RFP-غيغاواط، تحليل البذور باستخدام مجهر الأسفار. من أجل الكشف عن التعبير دسريد في البذور المعاطف، صورة البذور في إثارة 560 نيوتن متر، والانبعاثات من 600 – 650 نانومتر. فصل البذور الفلورسنت من نظرائهم غير الفلورية استخدام الملقط.
- على الشاشة للنباتات المعدلة وراثيا تحول مع مشتق ببيباك-بار-غيغاواط، زرع البذور في الصواني مليئة بالتربة (~ 2,500 البذور/0.1 م2). لضمان نشر حتى من البذور على علب، تعليق البذور في أجار 0.1% في 0.5 x Murashige سكوغ المتوسطة (مللي ثانية)، وتنتشر البذور باستخدام ماصة 1 مل.
ملاحظة: لتحفيز البذور على الإنبات بشكل متزامن، احتضان البذور لمدة يومين على الأقل في 4 درجات مئوية. يمكن أن يتم ذلك قبل أو بعد بذر البذور.- رش الشتلات مع الحل جلوفوسيناتي الأمونيوم 0.5% 2 أسابيع و 3 أسابيع بعد بذر البذور في الصواني. استخدام 500 مل من محلول جلوفوسيناتي الأمونيوم كل 1 م2.
- نقل الشتلات الباقين على قيد الحياة للأواني الفردية. وترد صورة نموذجية لصينية مع الشتلات قبل وبعد العلاج جلوفوسيناتي الأمونيوم (الثانية) في الشكل 3.
- تحليل النباتات جلوفوسيناتي الأمونيوم-مقاومة من بكر لوجود بنية للفائدة (راجع الخطوة 1.4.1. للإشعال).
- عزل الحمض النووي النبات الجينومي للاسترداد باستخدام الطريقة الموصوفة إدواردز et al. 17
4-تميز نظراً لعدد وسلامتها من التكاملات تي-دنا
- استراتيجية لتقييد ديجيسشنز
ملاحظة: تحديد عدد تي-دنا التكاملات وسلامتها من النشاف الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد. هذا الأسلوب يسمح بتحديد واحد، ولكن أيضا متكررة التكاملات في المكان نفسه أو مختلفة في الجينوم.- استخدام سلسلة من القيود ديجيسشنز لتحديد أنماط التكامل المختلفة الممكنة:
- حدد إنزيم أن التخفيضات مرة واحدة في منتصف تي-الحمض النووي، ليتمكن من التحقيق بشكل مستقل في تسلسل المنبع والمصب الموقع التقييد (4A الشكل و الشكل 7 أ-ج). انظر الشكل 4 أ، والشكل وسيلة إيضاح النتائج المتوقعة وتفسير.
- حدد إنزيم أو تركيبة من الإنزيمات الاستغناء عن تسلسل بأكمله من الفائدة في وقت واحد (الشكل 4 باء ، و الرقم 7 ألف-د). أي انحراف عن طول معروف يشير إلى اقتطاع كاسيت المتكاملة.
ملاحظة: الحرص على إلا تستخدم إنزيمات التقييد غير حساسة مثلايشن السيتوزين.
- استخدام سلسلة من القيود ديجيسشنز لتحديد أنماط التكامل المختلفة الممكنة:
- إعداد عينات الحمض النووي الجينوم.
- عزل الحمض النووي الجينومي من النباتات التي تحمل في البناء لمصلحة. يمكن استخدام أسلوب مينيبريب "كتاب الحمض النووي" ل عزل الحمض النووي18. للحمض النووي لطخة تحليل نبات الحمض النووي، وهناك حاجة 2 – 2.5 ميكروغرام للحمض النووي. يحل الحمض النووي في 50 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات.
- التحقق من سلامة الحمض النووي من جل التفريد16. وترحيل سلامة الحمض النووي كفرقة واحدة منفصلة في الجزء العلوي من الجل. يمكن التعرف على تدهور الحمض النووي كوجود مسحه. لتجنب إتلاف الحمض النووي بسبب ذوبان تجميد المتكررة، يتم الاحتفاظ بعينات الحمض النووي الجينومي في 4 درجات مئوية.
- هضم المجينية الحمض النووي (2 – 2.5 ميكروغرام في حالة نبات الحمض النووي) في إجمالي حجم 50 ميليلتر، بين عشية وضحاها، استخدام شروط المخزن المؤقت اقترحتها الموردين الإنزيم.
- في أنبوب اختبار، مزيج من 2 – 2.5 ميكروغرام من نبات الحمض النووي وتقييد المخزن المؤقت 10 x ميليلتر 5 5 إنزيم التقييد يو ما مجموعة 50 ميليلتر عالي النقاوة المياه..
- إضافة تحميل صبغ (1 × التركيز النهائي) إلى تقييد العينات قبل التحميل على جل. لتتبع بصرية جيدة، استخدم أحد الإجراءات التالية: كوميجراتينج بشظايا صغيرة (بروموفينول الأزرق، 350 – 400 شركة بريتيش بتروليوم)، أو كوميجراتينج مع أجزاء أكبر (زايلين سيلين، kbp 3 – 4).
- تشغيل هلام الحمض النووي.
- إعداد طويل (20 سم) 0.5 x TBE [اغروس] هلام19. النسبة المئوية من [اغروس] في الهلام يعتمد على أحجام جزء من المتوقع. 0.8-1% على النحو الأمثل يفصل أجزاء > 1 كيلو بايت في الحجم. استخدم 1 – 1.5% [اغروس] للشظايا < 1 كيلو بايت. لا تقم بإضافة اثيديوم بروميد إلى الهلام. (5 س TBE، 1 ز l: 54 من تريزما قاعدة، 27.5 غ من الماء المقطر g 3.75 يدتا).
ملاحظة: لمنع التلوث بالحمض النووي، استخدام هلام الصواني التي لا يتم استخدامها يجزئ بلازميد وبكر تضخيم الحمض النووي. - تحميل العينات في جل19.
- إضافة علامات الحمض النووي لجل أن يتراوح حجم الشظايا المتوقعة. تحميل حوالي 1 ميكروغرام من علامة (50-250 نانوغرام الأجزاء المختلفة في الحجم) في جل للسماح للتصوير بالأشعة فوق البنفسجية.
- حجم-يجزئ الحمض النووي في جهد منخفض (40 – 50 mA V/500) بين عشية وضحاها.
- إعداد طويل (20 سم) 0.5 x TBE [اغروس] هلام19. النسبة المئوية من [اغروس] في الهلام يعتمد على أحجام جزء من المتوقع. 0.8-1% على النحو الأمثل يفصل أجزاء > 1 كيلو بايت في الحجم. استخدم 1 – 1.5% [اغروس] للشظايا < 1 كيلو بايت. لا تقم بإضافة اثيديوم بروميد إلى الهلام. (5 س TBE، 1 ز l: 54 من تريزما قاعدة، 27.5 غ من الماء المقطر g 3.75 يدتا).
- التحضير لنقل الحمض النووي من [اغروس] هلام للغشاء النايلون.
- نقل الجل إلى علبة منفصلة، ووصمة عار عليه لمدة 20-25 دقيقة في 0.5 x TBE التي تحتوي على اثيديوم بروميد (5 ميكروغرام/مل) عن طريق تناوب لفة في الدقيقة 40 على شاكر مداري.
- تصور الهلام في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية. تحقق من حجم فصل المجينية الحمض النووي، بما في ذلك بروز عصابات فضائية منفصلة (الشكل 5A). تشويه نحو انخفاض الوزن الجزيئي أحجام يشير إلى تدهور الحمض النووي.
- ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية، إرساء شفافية على الهلام، ووضع علامة على موضع الفتحات وعصابات علامة بقلم ماركر (الشكل 5 (ب)). وهذا سيسهل تحديد حجم الشظايا المهجن لاحقاً في حال لم هجن تسلسل علامة على وجه التحديد مع مسبار الحمض النووي. بالإشارة إلى شظايا ماركر في هذه الخطوة، فمن الممكن لتعقب حجم الشظايا هيبريديزينج.
- ضع الجل مرة أخرى إلى علبة الورق والشطف بماء منزوع عالي النقاوة وتغرق في 0.25 M HCl لمدة 15 دقيقة فراجمينتيزي في الحمض النووي داخل الجل. تغسل بماء منزوع عالي النقاوة. استخدام HCl ومياه كافية لتغطية الجل في العلبة، وتدوير العلبة مع هلام المغمورة لفة في الدقيقة 40 على شاكر مداري.
- احتضان الجل في تمسخ المخزن المؤقت ل 30 دقيقة يغسل بماء منزوع عالي النقاوة. استخدام المخزن المؤقت ومياه كافية لتغطية الجل في العلبة، وتدوير العلبة مع هلام المغمورة لفة في الدقيقة 40 على شاكر مداري. (تمسخ المخزن المؤقت: 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم، وكلوريد الصوديوم م 1.5).
- احتضان الجل في تحييد المخزن المؤقت ل 30 دقيقة يغسل بماء منزوع عالي النقاوة. استخدام المخزن المؤقت ومياه كافية لتغطية الجل في العلبة، وتدوير العلبة مع هلام المغمورة لفة في الدقيقة 40 على شاكر مداري. (تحييد المخزن المؤقت: 0.5 م تريس، 1.5 م كلوريد الصوديوم، 220 مم HCl، درجة الحموضة 7.6).
- نقل الحمض النووي لغشاء نايلون.
- تحضير الإعداد لنقل الشعرية الحمض النووي. وضع صفيحة بلاستيكية (تقريبا حجم الهلام أو أكبر) أكثر من علبة مليئة 20 x سترات الصوديوم المالحة (SSC). طي قطعة من ورق الترشيح سميكة على الدرج، حيث أن كلا من غاياتها هي معلقة في محكمة أمن الدولة. خفض الحجم هلام قطعة من النايلون إيجابيا يحمل غشاء هيبوند ن +، و 2 قطعة من ورق الترشيح سميكة. (SSC 20 x: م 3 كلوريد الصوديوم، وسترات الصوديوم 0.3 M).
- إعداد الإعداد بلوتينج (الشكل 6) عن طريق وضع الهلام، فتحات أسفل أعلى الورقة عامل التصفية على لوحة بلاستيكية. ضع غشاء "هيبوند ن +" في الأعلى، تليها 2 طبقات من ورق الترشيح. قبل الرطب كل طبقة في 20 x SSC قبل إضافتها إلى الجمعية العامة. تأكد من إزالة أي فقاعات الهواء بين الطبقات كهذه تعوق نقل الحمض النووي.
- وتغطي الجمعية مع طبقة سميكة من المناديل الورقية. وضع صفيحة بلاستيكية ذات وزن، مثل زجاجة صغيرة، في الأعلى. تأكد من الضغط الذي انقسمت بالتساوي عبر الهلام. وسيكفل هذا النقل المناسب للحمض النووي.
ملاحظة: يجب أن يكون الوزن حوالي 200-300 جرام؛ الأوزان الثقيلة تعوق نقل الحمض النووي. - وتغطي المنطقة المحيطة بالجمعية العامة، بما في ذلك ورقة تصفية المكشوفة، مع الفيلم تتشبث (الشكل 6) لتجنب التبخر 20 x SSC المخزن والمستهدفة شعري قوي نحو الغشاء النايلون. لطخة بين عشية وضحاها.
- وضع علامة على موضع فتحات، الاسم، و/أو تاريخ أعلى الغشاء مع قلم رصاص، وإزالة الغشاء من الجمعية العامة. علما أن الجانب السفلي التي كانت على اتصال بالجل، يحمل الحمض النووي.
- فورا إصلاح الحمض النووي للغشاء باشعاع الأشعة فوق البنفسجية (2,400 µJ/م2) استخدام كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: شروط Crosslinking تعتمد على نوع الأغشية المستخدمة.
ملاحظة: عند هذه النقطة الغشاء يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية وتستخدم التهجين مع تحقيق في وقت لاحق. شطف الغشاء كروسلينكيد في 2 × التعاون بين بلدان الجنوب، وختم أنه في مرحلة ما قبل مطوية أنابيب البولي إثيلين الحراري قبل وضعه في-20 درجة مئوية.
- يعد المسبار التهجين.
- تضخيم التسلسل لاستخدامها كالمسبار للحمض النووي النشاف بكر20. 50-100 نانوغرام من جزء بكر 250 بي بي-2 kbp كتحقيق. تحقيقات منفصلة اثنين، واحد التهجين إلى منطقة الحدود اليمنى الدانية، والأخرى إلى منطقة الدانية الحد الأيسر من T-الحمض النووي، يمكن استخدامها لتقييم وجود أسرة تي-الحمض النووي (4A الشكل و الشكل 7).
- تمييع 50-100 نانوغرام من منتج PCR في 24 ميليلتر من المياه عالي النقاوة في أنبوب اختبار.
- تؤذي المنتج بكر المخفف بالغليان فإنه لمدة 5 دقائق في كوب من الماء أو الحرارة كتلة، ثم تبرد مباشرة على الجليد.
- ذوبان الجليد premade بنا-ميكس على الجليد. (بنا-ميكس: دجتب، دكتب، دتتب (جميع 0.5 مم)، هيكساميرس عشوائي 43.2 نانوغرام/ميليلتر، جيش صرب البوسنة أسيتيلاتيد 1.33 mg/mL، 33 ملم من β-mercaptoethanol، 0.67 "م حبيس"، 0.17 ملم تريس الأس الهيدروجيني 6.8، 17 ملم مجكل).
- إضافة ميليلتر 21 من بنا--المزيج و 2 "يو كلينوو" جزء للمنتج PCR.
- إضافة 2 ميليلتر من ATP [32ف] إلى هذا المزيج، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
تنبيه: جميع الخطوات التي تنطوي على ATP [32ف] بحاجة إلى الاضطلاع بها في بيئة مخصصة للعمل المشعة أثناء استخدام الحماية المناسبة.
ملاحظة: تأكد من ATP [32ف] جديدة (لا تزيد عن 1 نصف الوقت مر). - إعداد العمود (الخشنة أو المتوسطة)21 G-50 سيفاديكس لتنقية المجس المسمى من النيوكليوتيدات (المشعة) غير مدمج. تأخذ حقنه 2 مل، وتغطية المنفذ مع دائرة صغيرة من ورق سميك عامل التصفية. إضافة 2 مل من G-50 سيفاديكس حله في الشركة المصرية للاتصالات في المحاقن، وإزالة جميع السائل من العمود بالغزل.
- وضع العمود في أنبوب بلاستيك 15 مل، وتحميل المجس المسمى في العمود، وتدور في درجة حرارة الغرفة (تعيين أجهزة الطرد المركزي في 750 x ز والسماح لدورة في الدقيقة لزيادة حتى يتم التوصل إلى 750 س ز، ثم وقف النابذة وتسمح التناوب ينخفض إلى 0 x ز) الوتي التحقيق. إضافة 200 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات إلى العمود وتدور الوت المسبار المتبقية؛ كرر مرة واحدة. في ظل هذه الظروف، مستبعدة من المصفوفة Sephadex المسمى شظايا من الحمض النووي والوت، بينما تظل النيوكليوتيدات مجاناً في العمود.
- استخدام 300 ميليلتر المسبار المسمى كل أنبوب التهجين. يبقى التحقيق المسمى المتبقية في-20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. ومع ذلك، الحفاظ على الوقت النصف من ATP [32ف] في العقل.
- هجن وصمة عار الحمض النووي.
- X SSC الحرارة 2 والتهجين المخزن المؤقت (15 مل في أنبوب التهجين، الحد الأقصى من البقع 2 كل أنبوب) إلى 65 درجة مئوية. (المخزن المؤقت التهجين: سلفات ديكستران 10%، 1% الحزب الديمقراطي الصربي، وكلوريد الصوديوم م 1، 50 مم تريس درجة الحموضة 7.5، يذوب عند 65 درجة مئوية، وتبقى مختبرين في-20 درجة مئوية).
- قبل حرارة الفرن التهجين إلى 65 درجة مئوية.
- وضع شبكة نايلون في صينية مع قليل من مياه دافئة (65 درجة مئوية) 2 x SSC لتغطية الدرج. ضع الحمض النووي وصمة عار على رأس الشبكة، مع الجانب الحمض النووي أعلى. لفة وصمة عار جنبا إلى جنب مع الشبكة وإدراج الأسماء في أنبوب تهجين. من أجل إيقاف 2 الزائدة x SSC.
- في أنبوب ميكروسينتريفوجي، يغلي 150 ميليلتر من "سمك السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي" (تركيز 10 ملغ/مل) كل أنبوب التهجين لمدة 5 دقائق (انظر أيضا خطوة 4.6.3). بارد فورا على الجليد، وإضافة إلى المخزن المؤقت التهجين قبل ساخنة.
- إضافة حل الحيوانات المنوية المخزن المؤقت-سمك السلمون التهجين إلى الأنبوب مع وصمة عار. قبل هجن على 65 درجة مئوية على الأقل 1 ح في عجلة دوارة، 12 لفة في الدقيقة.
- عندما الحضانة قبل في الخطوة 4.7.5. انتهى تقريبا، ميليلتر غلى 300 لمسبار المسمى لمدة 5 دقائق (انظر أيضا خطوة 4.6.3) وتضاف فورا إلى وصمة عار بعد الحضانة.
- هجن بين عشية وضحاها في عجلة الدورية عند 63 درجة مئوية، 12 دورة في الدقيقة. لا "الماصة؛" التحقيق مباشرة على وصمة عار، ولكن في حل الحيوانات المنوية المخزن المؤقت-سمك السلمون التهجين.
- غسل وصمة عار.
- يسخن الحلول الغسيل (1 × الالتهاب، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.1 x SSPE، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1 ٪) إلى 65 درجة مئوية. (20 x SSPE: 3 م كلوريد الصوديوم، 230 ملم نة2بو4، 20 مم يدتا، درجة الحموضة 7.0).
- التصرف في حل التهجين وإضافة حوالي 100-150 مل 1 x SSPE، حل الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% إلى أنبوب التهجين، إغلاق الأنبوب، وتدوير باليد. من أجل التهجين والغسيل الحل في النفايات المشعة السائلة المناسبة.
- إضافة حوالي 100-150 مل 1 x SSPE، حل الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% للأنبوب، إغلاق، واحتضان الأنبوب لمدة 15 دقيقة في 63 درجة مئوية في عجلة الدورية، 12 دورة في الدقيقة. تجاهل الحل الغسيل على نحو ملائم.
- إضافة حوالي 100-150 مل 0.1 x SSPE، حل الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% إلى أنبوب التهجين، إغلاق، وتدوير الأنبوب لمدة 5 دقائق في 63 درجة مئوية، 12 دورة في الدقيقة. تجاهل الحل الغسيل على نحو ملائم.
- تأخذ وصمة عار من الأنبوب ثم ضعه في علبة تحتوي على 0.1 مسخن الكافي × الالتهاب، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، ويهز لمدة 3 دقائق في حمام مائي تهتز عند 65 درجة مئوية. وفي الوقت نفسه، شطف الشبكة في علبة مليئة بالمياه.
- إخراج وصمة عار ووضعه بين مسبقاً مطوية البلاستيكية (أنابيب البولي إثيلين)، بعناية تمحو السائل الزائد وترك وصمة عار الجاف لفترة وجيزة. علما بأن السائل سوف تدمر الشاشة فوسفوريماجير.
- ختم وصمة عار في البلاستيك على الأطراف الثلاثة. إزالة جميع السائل الزائدة المحيطة بوصمة عار وإغلاق أنبوب بلاستيكي بختم الجانب الرابع. قطع فائض البلاستيك. تأكد من اسطوانة مختومة لا يتسرب وأن البلاستيك الجافة في الخارج.
- تعرض الشاشة فوسفوريماجير.
- وضع اسطوانة مختومة في كاسيت فوسفوريماجير، مع شاشة فوسفوريماجير تواجه الجانب الحمض النووي من وصمة عار. إغلاق الكاسيت وترك ل ± 2 – 4 أيام، اعتماداً على قوة العلامات المشعة وحساسية فوسفوريماجير.
- مسح الشاشة فوسفوريماجير باستخدام فوسفوريماجير. رعاية لفضح الشاشة أقل قدر ممكن للضوء قبل إجراء المسح الضوئي. حفظ الصورة. مسح الشاشة من الإشارات التي يعرضها للضوء الساطع.
- تحليل وصمة عار.
- التحليل يعتمد على تقييد الاستراتيجية المستخدمة في الخطوة 4، 1. عند تحليل لطخة المعدة وفقا لهذه الاستراتيجية هو موضح في الخطوة 4.1.1.1 (الشكل 4A)، عد عدد الأجزاء تم الكشف عن. في هذه الاستراتيجية، عدد الأجزاء المهجن يشير إلى عدد التكاملات تي-الحمض النووي.
- قارن عدد الأجزاء من الكشف، بتحقيق لليسار (الشكل 7) والجزء الأيمن (الشكل 7) من تي-الحمض النووي.
ملاحظة: إذا كان عدد مختلف من شظايا التهجين هو الكشف عن، ثم أما ط) T-الحمض النووي نسخ متعددة (أما في اتجاه معكوس أو المباشر) أو الثاني) غير كامل متكامل يوجد تي-السلطات الوطنية المعينة. - تقدير أحجام شظايا المهجن على وصمة عار استناداً إلى حجم النطاقات ماركر، ومقارنة أحجام شظايا المهجن مع جزء المتوقعة على حساب أحجام استناداً إلى استراتيجية تقييد الملاحق جنبا إلى جنب (الشكل 4 أ) تحديد ترتيب ممكن جنبا إلى جنب تي-السلطات الوطنية المعينة. استخدم الشكل 4A كدليل لحساب حجم الشظايا المتوقعة.
ملاحظة: إذا كان حجم الشظايا المهجن لا تتفق مع تلك المحسوبة، ثم الأكثر احتمالاً من التكاملات الحالية ليست كاملة.
- قارن عدد الأجزاء من الكشف، بتحقيق لليسار (الشكل 7) والجزء الأيمن (الشكل 7) من تي-الحمض النووي.
- عند تحليل لطخة أعدت وفقا للاستراتيجية هو موضح في الخطوة 4.1.1.2 (الشكل 4 باء)، تقدير حجم الجزء هيبريديزينج على وصمة عار استناداً إلى حجم علامة العصابات، وذلك مقارنة مع الحجم المتوقع. إدراج سليمة غلة جزء واحد مع طول محدد. أي انحراف للطول المتوقع يشير إلى التكامل غير مكتملة (الشكل 7).
- التحليل يعتمد على تقييد الاستراتيجية المستخدمة في الخطوة 4، 1. عند تحليل لطخة المعدة وفقا لهذه الاستراتيجية هو موضح في الخطوة 4.1.1.1 (الشكل 4A)، عد عدد الأجزاء تم الكشف عن. في هذه الاستراتيجية، عدد الأجزاء المهجن يشير إلى عدد التكاملات تي-الحمض النووي.
- قطاع وصمة عار لإعادة التهجين (اختياري).
ملاحظة: وصمة عار نفسه يمكن أن يكون تهجين التتالي مع تحقيقات مختلفة. قبل متابعة تحقيق جديد، قطاع تحقيق المهجن سابقة من وصمة عار.- لإزالة المسبار من وصمة عار، ضع وصمة عار في علبة مع جانبها الحمض النووي إلى الأسفل. صب فائض مخزونات النشر الاستراتيجي 0.5% في الدرج. يغلي الغشاء لمدة 2-5 دقائق. مدة العلاج يعتمد على حجم ومحتوى GC المسبار المستخدمة. المسابر أطول وأكثر ثراء GC في حاجة إلى علاج أطول.
- بعد تجريد، هجن وصمة عار مع مسبار آخر، أو ختم وتخزينها في-20 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام نظام بيبك-غيغاواط، مراسل بنيات لدراسة تصنيع التصميم الشخصي في مصانع كانت ولدت10. بنيات صممت في "بوابة دخول" ناقلات بينتر-جنرال موتورز12 وإدراجها في ببيباك--بار-غيغاواط (الشكل 1) استخدام رد فعل جزئ LR العبارة.
تم تحويل نبات مع pDM19، بلازميد بيبك-بار-GW مع مراسل متورقويسي-ايفب تحمل كودون وقف متعدية الجنسيات في إطار القراءة ايفب في موقف 120 (mTurquoise2-ايفب * 40) (الشكل 2)10. وفي المجموع، كانت 126 نبات نباتات محولة (9 محطات لكل وعاء، والأواني 14). بذور هذه النباتات المجمعة، وتزرع في صواني مع التربة، وسمح لتنمو لمدة أسبوعين قبل العلاج بمحلول جلوفوسيناتي الأمونيوم. الشتلات فقط التعبير عن الجين بار (موجودة في بيبك-بار-GW) البقاء على قيد الحياة جلوفوسيناتي الأمونيوم العلاج (الشكل 3). في المجموع، حددت 11 الوراثي تحول مع pDM19، المقابلة إلى كفاءة تحويل 0.02 في المائة من البذور تم تحليلها.
الوراثي 11 معزولة، استخدمت النشاف الحمض النووي لتحديد العدد التكاملات تي-الحمض النووي. لهذا الغرض، انقطعت الحمض النووي مع Bglالثاني أو الهيئةأنا (الاستراتيجية كوضعها على الشكل 4A). كل من هذه الإنزيمات تقييد قطع مرة واحدة فقط في تسلسل الحمض النووي تي (الشكل 7 أ). التهجين مع تحقيقات اعترافاً بشريط وايفب ترميز المناطق يسمح بالكشف عن عدد من شظايا من الحمض النووي الخاصة بكل منها.
عدد الحمض النووي الفردية شظايا في البقع تسمح بتقدير عدد الإدراجات تي-دنا في خطوط مراسل (الجدول 1). واحد أجزاء التهجين مع التحقيق سواء بشريط وايفب يدل على وجود تكامل تي-دنا مفرد. من الوراثي 11 التي تم تحليلها، قام ستة التكاملات واحد. وكان متوسط عدد عمليات تكامل 1.2.
6 خطوط تحمل على تكامل تي-دنا واحد، تم اختبار سلامة بناء المدرج مراسل استخدام الحمض النووي النشاف (الاستراتيجية كوضعها على الشكل 4B). تم قطع الحمض النووي مع Bglالثاني و المشروعالأول للإفراج عن جزء من 5.5 كيلو بايت الذي يحتوي على متورقويسي-ايفب وشريط الجينات الانصهار (الشكل 7 أ). وكان استخدام مجس ضد ايفب للكشف عن الجزء المتوقع. تقوم جميع محطات اختبار جزء بلغة سليمة. علما بأن دراسة الجزء باستثناء اليسار والحدود حق تي-دنا، ودراسة ولذلك عدم سلامة كامل تي-الحمض النووي، لكن فقط الجزء المتضمن المتسلسلات ذات الاهتمام.
تم تحديد التعبير عن الجينات مراسل الفلورسنت في نسخة واحدة مستقلة خطوط المعدلة وراثيا متباينة إلا عن طريق موقع جينومي تي-الحمض النووي. قيست مستويات نسخة النسبي المراسل يحركها مروج متورقويسي-ايفب كامب-35S من الرايت قبكر في أربعة أسطر مراسل DM19 تحمل التكاملات سليمة، ونسخة واحدة منها موقف الجينوم هو العزم10. التباين في مستويات التعبير الجيني مراسل بين السطور كانت طفيفة: الحد الأقصى للفرق في مستويات الحمض النووي الريبي متورقويسي-ايفب كان إضعاف (الشكل 8 أ).
المقبل، أجرى في هذه الأسطر مراسل تصنيع التصميم الشخصي. ثلاثة من أصل أربعة خطوط مراسل مستقل أظهر كفاءات ODM مشابهة بدلاً من ذلك (8B الشكل). ومع ذلك، سطر واحد، DM19 [4] 1، تحقق من كفاءة ODM منخفضة جداً مقارنة بالخطوط الأخرى. تشير هذه النتائج إلى أن تصنيع التصميم الشخصي يتأثر بالسياق المحلي الجينوم. ما هي طريقة سياق الجينوم المحلية لإدماج تي-دنا في DM19 [4] 1 يختلف عن ذلك في بنود أخرى ما زال يتعين تحديد. تحليل مجموعات البيانات المتاحة عن علامات الكروماتين النشطة وغير النشطة في مواقع التكامل تي-دنا الجينومي في النباتات غير المعدلة وراثيا ولم تقدم جواب10.
رقم 1: الخرائط الوظيفية لناقلات غيغاواط ببيباك. مشتقات ببيباك-GW متوفرة مع المقاومة أما إلى جلوفوسيناتي (بار) أو دسريد fluorescence في المعاطف البذور (دسريد) كعلامة اختيار في النباتات. لناقلات الأمراض على حد سواء، هو أحد جينات مقاومة كاناميسين علامة اختيار في البكتيريا. مواقع بوابة كاسيت ccdB يرد بين رؤوس الأسهم الخضراء تمثل جزئ توريR1 و R2 من المتفرجين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: بناء مراسل الطفرات. الجينات مراسل متورقويسي-ايفب تدفعها إلى مروج 35S-كامب. متورقويسي ترميز المنطقة هو تنصهر فيها ايفب ترميز المنطقة تحمل طفرة ج-أ في موقف النوكليوتيدات 120، مما أدى إلى توقف متعدية سابق لأوانه كودون ﻷعمالهم، والإنهاء السابق لأوانه لترجمة البروتين الانصهار. 3 إشارة بوليادينيليشن نوبالين Synthase (3 ' غ) يستخدم لإنهاء النسخ ل بناء22. تعريب النووي إشارة (NLS) يستخدم لاستهداف البروتينات المترجمة إلى النواة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: علبة مملوءة ببذور نبات قبل وبعد العلاج جلوفوسيناتي الأمونيوم. الشتلات عدم التعبير عن الجين شريط موجود في تي ببيباك--بار-GW-يموت الحمض النووي بعد يتم رشها بمحلول جلوفوسيناتي الأمونيوم. تظهر الصور علبة نفس شتلات (A) قبل الرش مع جلوفوسيناتي-الأمونيوم، 14 يوما بعد البذر، و (ب) عشرة أيام في وقت لاحق، بعد أن رش مرتين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: إدراج استراتيجية تقييد العام الحمض النووي لتحديد عدد وإينتاكتنيس من تي-السلطات الوطنية المعينة- (أ) واحد قيد الموقع (R) في وسط تي-الحمض النووي يسمح التدقيق المستقل من اليسار (الأحمر L) والجزء الأيمن من T-الحمض النووي (R الخضراء). الرسوم الكاريكاتورية في الحق تبين أن اعتماداً على اندماجات واحد-أو متعددة-كوبي تي-دنا، يتم الحصول على أنماط النطاقات المختلفة مع النشاف الحمض النووي. العصابات التي تحمل * لها طول محدد، بينما يعتمد طول غيرها من العصابات في أقرب موقع التقييد في الحمض النووي ترافقه. إدراج واحد: L و R التحقيق كلا إعطاء جزء مستقل واحد. يمكن حساب حجم جزء متوسط المتوقعة بناء على تواتر الموقع التقييد في الجينوم. حجم الحد الأدنى هو المسافة من موقع التقييد إلى اليسار الحدود (رطل) أو الحق في الحدود (الميزانية العادية)، تبعاً ليتم يجري التحقيق فيها نهاية للتكامل، وإذا كان T-الحمض النووي غير سليمة. تكرار جنبا إلى جنب: التحقيقات للأم وصاد تعطي كلا من الشظايا اثنين؛ لتحقيق كل واحد من الشظايا ويشمل المرافقة الحمض النووي، الجزء الثاني حجم المتوقع وتم تعريفها بواسطة المسابير على حد سواء. تكرار مقلوب: تبعاً لاتجاه الذي يتم الكاسيت المتكاملة، يمكن تحديد أما من لتر واحد واثنين R الشظايا، أو اثنين L و R واحد. الفردية الملاحق واحد: والنتيجة عدد من الأجزاء المستقلة، وعدد الأجزاء يتوافق مع عدد التكاملات. (ب) تقييد تسمح مواقع على الحدود القصوى من T-الحمض النووي تحديد سلامة الجزء بين مواقع التقييد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: [اغروس] هلام مع نمط التقييد وشفافية مطابقة. (أ) على [اغروس] هلام، هضم الحمض النووي مع عكرأنا يرد. ويتضح الهضم السليم من الحمض النووي بوجود العصابات الفضائية المنفصلة. (ب) وضع علامات موقف فتحات وشرائط علامة على شفافية يجعل من الممكن في وقت لاحق بسهولة حساب حجم التهجين الشظايا. هنا، يتم استخدام علامات هولندا MRC (الأزرق والأحمر)، أشارت إلى جانب م. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الإعداد النشاف الشعرية. في شعري النشاف الإعداد، يتم وضع ورق الترشيح على طبق من بلاستيك مع نهايات الورقة معلقة في المخزن المؤقت x SSC 20. هذه الورقة ترطب مع 20 x SSC، و [اغروس] هلام توضع في الأعلى، تليها غشاء نايلون وأوراق الترشيح، وكومة من الأنسجة. ويوضع على رأس خفيفة وزن. هو الحرص على إزالة فقاعات الهواء بين جل والورق والغشاء. يستخدم الفيلم تتشبث تجنب تجفيف الخروج من برنامج الإعداد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: مثال للحمض النووي النشاف الاستراتيجية والنتائج التجريبية. (أ) الدنا النشاف استراتيجية لتحديد عدد وإينتاكتنيس من التكاملات تي-الحمض النووي. يتم الإشارة إلى مواقع قطع إنزيمات التقييد المحدد داخل تي-الحمض النووي مع أشرطة عمودية. المسابر ايفب و شريط المستخدمة التهجين مع هضم الحمض النووي يتم الإشارة إلى استخدام خط مع النقطة الطرفية أدناه تي-الحمض النووي. (ب–د) اسطوانات يقوم "المثال الحمض النووي". وكان قطع الحمض النووي مع هيئة السلع التموينيةووصمة عار سبر مع التحقيق كلا من بار و ايفب (ب وج). وكان قطع مع Bglالثاني و Pciأنا الحمض النووي وسبر مع تحقيق شريط . هي أجزاء سليمة kbp 5.5 في الحجم (د). علما بأن مجموعة العينات في د يختلف عن تلك المعروضة في باء وجيم * يشير إلى حجم جزء المتوقعة؛ M، علامة. يتم استخدام نفس حجم علامة في ب وج ود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
8 الرقم: متورقويسي-ايفب مستويات التعبير والكفاءة ODM في خطوط مراسل مستقل متورقويسي-ايفب. (أ) مستويات نسخة ايفب متورقويسي النسبية تقاس RT-قبكر في DM19 مراسل خطوط. واستخدمت لتطبيع مستويات نسخة من أكتين. قياس الكفاءة (ب) تصنيع التصميم الشخصي في خطوط مراسل DM19. لأشرطة A و B، تشير إلى متوسط replicates البيولوجي خمسة على الأقل. أشرطة الخطأ تشير إلى sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| نوع محور T-الحمض النووي | تقرير وطني تكاملات تي-دنا | مراسل الخط | عدد الأجزاء التي تم الكشف عنها | سلامة | |||
| هيئة الأوراق المالية أنا | Bgl ثانيا | Bgl ثانيا/بسيي | |||||
| بار | ايفب | بار | ايفب | ايفب | |||
| تكاملات محور واحد | 1 | 19 [2]-2 | 1 | 1 | 1 | 1 | + |
| 1 | 19 [2]-5 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | [2] 19-9 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | [2] 19-11 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | 19 [4]-1 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | 19 [4]-2 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| كرر 2، مقلوب | 19 [2]-10 | 2 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 2، التكامل غير مكتملة | 19 [2]-3 | 1 | 2 | 1 | 1 | وفيات المواليد | |
| متعددة محور التكاملات | 2 | 19 [2]-6 | 2 | 2 | 2 | وفيات المواليد | |
| 2 | 19 [2]-7 | 2 | 2 | 2 | 2 | وفيات المواليد | |
| 3/4 | 19 [2]-1 | 4 | 3 | 3 | 3 | وفيات المواليد | |
| الثانية – لم تحدد. | |||||||
الجدول 1: موجزة من الحمض النووي النشاف البيانات الوراثي معزولة بعد التحول مع pDM19-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحاسمة لتوليد الوراثي مع التكاملات واحد، سليمة من التحوير هو خيار ناقل ثنائي المستخدمة. وقد استخدمت ناقلات الأسرة بيبك تسليم متواليات المصالح إلى العديد من النباتات الأنواع23،24،،من2526،،من2728. بيبك ناقلات الأمراض، بما في ذلك بيبك-غيغاواط، تسفر عن التكاملات نسخة واحدة بكفاءة عالية: متوسط عدد الإدراجات كل سطر هو 1.5 إلى 2، مقارنة مع 3 أو أعلى للثنائي الأكثر استخداماً متجهات95،، 29-تحسنا كبيرا مقارنة بالأخرى الناقلة بيبك، مع ناقلات بيبك-غيغاواط، التسلسل الفائدة يمكن بسهولة إدراج استخدام بوابة جزئ المواقع12. متجهات معدلة التغلب على المشاكل العامة لناقلات بيبك عند استخدامها في الاستراتيجيات التقليدية الاستنساخ: ط) عدد محدود جداً من مواقع قيود فريدة من نوعها والثاني) من الحمض النووي منخفضة العائد. جعل المواقع جزئ بوابة بيبك-GW ناقلات بديلاً جذاباً لناقلات أخرى ثنائي لتوليد النباتات المعدلة وراثيا.
ويرد هنا سلسلة من البروتوكولات، من توليد بيباك-GW المشتقات التي تحتوي على تسلسلات فائدة، لزرع التحول، والحمض النووي لطخة تحليل عدد وإينتاكتنيس من التسلسلات المعدلة وراثيا. وأفاد عدد من البروتوكولات في هذه الورقة، بوابة الاستنساخ، انهانسر من البكتيريا، وتحول النبات، هي ممارسة شائعة في العديد من المختبرات ويمكن أيضا القيام بتعديلات طفيفة. من المهم أن نعرف أن بيبك-GW ناقل واحد-نسخة في كولاي وفي توميفاسينس أ. ولذلك، عندما عزل الحمض النووي، العائد منخفض؛ من المستحسن للارتقاء بإجراءات العزل.
في الوراثي تحمل متعددة تي-دنا التكامل، المتسلسلات أدخلت كثيرا ما تتعرض للجينات إسكات1،،من24،30، وذا لمعظم تطبيقات ينبغي تجنب. لتحديد النباتات المعدلة وراثيا التكاملات واحد، سليمة، من المستحسن استخدام تحليل الحمض النووي وصمة عار. بينما أساليب خلاف الحمض النووي النشاف يمكن استخدامها لتحديد عدد نسخ الحمض النووي تي وسلامة تي-السلطات الوطنية المعينة في خطوط محوره وراثيا (تحليل العزل والذيل-بكر، بكر (qPCR) الكمية والرقمية الحبرية PCR)، على الرغم من أن حزب العمل المكثف، النشاف الحمض النووي في كثير من الأحيان أسلوب الاختيار. تحليل العزل غير قادرة على التمييز بين متعددة والتكاملات تي-دنا في المكاني واحدة واحدة. ذيل-PCR غالباً من الأطفال دون سن الخامسة تقديرات عدد النسخة، خاصة إذا كان أكثر من تي-دنا التكامل الحالي31، ويحتاج qPCR التحسين مفصلة لنتائج موثوقة31،32. التجميعية الرقمية PCR طريقة بدلاً من دقيقة للكشف عن عدد النسخ إذا كانت المعدات اللازمة المتاحة31. فائدة إضافية من النشاف الحمض النووي هو الكشف عن السطحية مبتوراً تي-السلطات الوطنية المعينة، اضاعتها بسهولة في جميع التقنيات المستندة إلى PCR.
مع تحليل الحمض النووي وصمة عار، تحتاج الشظايا هيبريديزينج على وصمة عار أن تكون محددة تحديداً واضحا في الحجم والإشارات. هناك عدة عوامل معروفة ليؤثر في نتيجة الحمض النووي النشاف. بالإضافة إلى مجموعة مناسبة من إنزيمات التقييد (الاستراتيجية المبينة في الشكل 4) وحجم علامات، مطلوب الحمض النووي كافية ذات نوعية جيدة. أقل من 2 ميكروغرام للجينوم نبات الحمض النووي لن تخضع أجزاء تحديداً واضحا. عند التعامل مع الجينوم أكبر، مطلوب مزيد من الحمض النووي. للحصول على كميات كافية من نبات الحمض النووي، يمكن استخدام أنسجة نباتية أو الشتلات 1-الأسبوع القديمة. دفعة شتلات المزروعة في طبق بتري واحد غلة 2-8 ميكروغرام للحمض النووي. لتفادي تدهور الحمض النووي أثناء العزلة، ينبغي الحرص على معالجة المواد النباتية بسرعة. وعلاوة على ذلك، ينبغي حراكه في تريس-أدتا الحد من التدهور بواسطة nucleases الحمض النووي، وتخزينها في 4 درجات مئوية بدلاً من-20 درجة مئوية لمنع نيكينج الحمض النووي نظراً لتكرار دورات ذوبان التجميد. إذا كان غير متأكد من أن جميع عينات الحمض النووي يتم هضمها تماما، اقترح ريهيبريديزي وصمة عار الحمض النووي مع تحقيق الاعتراف بمنطقة الجينوم الذاتية، فريدة من نوعها. عند تحديد تسلسل التحقيق لتحديد تسلسل المحورة وراثيا أو الذاتية، من الأهمية بمكان تحديد تسلسل فريدة فقط. لتكون قادراً على تحديد دقة حجم الشظايا المهجن، جل مواقف الحمض النووي فتحات وعصابات ماركر الحمض النووي يجب وضع علامة على شفافية (الشكل 5B) عندما تصور جل اثيديوم بروميد الملون (الشكل 5A) في الأشعة فوق البنفسجية ترانسيلوميناتور. في حالة تسلسل علامة لا هجن مع مسبار الحمض النووي، أو التهجين الجزئية، هو السبيل الوحيد لتعقب حجم التهجين الشظايا.
مرة واحدة هو الحرص على تحقيق إشارة جيدة التهجين وتقدير لحجم الشظايا، تفسير نتائج blotting مباشرة. عند استخدام واحد فقط إنزيم التقييد، والتهجين مع مختلف تحقيقات كشف أما الجزء الأيمن أو الأيسر من T-الحمض النووي، يعكس عدد الأجزاء المكتشفة عدد الإدراجات تي-الحمض النووي. على سبيل المثال، يبين الشكل 7 باء، جيم وصمة عار الحمض النووي ذاته، تهجين مع تحقيقات مختلفة، بار (الشكل 7) وتعزيز "نيون أصفر البروتين" (ايفب) (الشكل 7)، استخدام هذه الاستراتيجية هو موضح في الشكل 7 ألف. إظهار جميع الممرات، ما عدا 4، على عدد متساو من الشظايا في كل البقع: الشظايا اثنين لخط 6 وجزء واحد لكافة البنود الأخرى. هذا العدد من الشظايا التي تم الكشف عنها هو عدد الإدراجات تي-الحمض النووي.
عند اكتشاف عدد الأجزاء مع تحقيقات ملزمة أما اليسار أو يختلف الجزء الأيمن من T-الحمض النووي (أما بالنسبة الشكل 7، ج، السطر 4)، أما الملاحق غير مكتملة موجودة، أو تي-السلطات الوطنية المعينة قد أدرجت في الترتيب جنبا إلى جنب. الملاحق جنبا إلى جنب عرض جزء غير عشوائية لطول أحد الأجزاء T-الحمض النووي (الشكل 4A، اللوحة اليمنى)، ويمكن تعريفه بواسطة مقارنة حجم جزء المهجن مع ما هو متوقع استناداً إلى الاستراتيجية التقييد. استراتيجية blotting إضافية قد تكون مطلوبة لتأكيد ترتيب الملاحق تي-دنا جنبا إلى جنب. يتم ترتيب الملاحق اثنين في العينة على سطر 4 (الشكل 7، ج)، في اتجاه تكرار مقلوب.
عند تقدير إينتاكتنيس تي-الحمض النووي، أو جزء منه، طول الجزء هيبريديزينج يمكن حساب يستند إلى استراتيجية التقييد. أي انحراف عن الحجم المتوقع يدل على وجود الإدراج غير مكتملة. على سبيل المثال، في الشكل 7، في حارة 4، جزء هيبريديزينج وترحيل في kbp 8، (بدلاً من kbp 5.5 المتوقعة) مما يدل على حجم جزء زيادة نظراً لعدم وجود أحد مواقع التقييد.
بيبك-GW الناقلة أدوات ممتازة لتوليد نسخة واحدة سليمة اندماجات في عدد من الأنواع النباتية. ينص البروتوكول على ذكر هنا إجراء موثوق بها لتحديد النباتات مع التكاملات واحد، سليمة من التحوير للفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يدعم هذا البحث الهولندية التكنولوجيا مؤسسة STW (12385)، الذي يشكل جزءا من "منظمة هولندا" للبحث العلمي (NWO)، والذي يمول جزئيا من وزارة "الشؤون الاقتصادية" (مكتب المدعي العام منحة 12385 لمرض التصلب العصبي المتعدد). ونحن نشكر كارول م. هاملتون (جامعة كورنيل، الولايات المتحدة) لتوفير pCH20، العمود الفقري لناقلات بيبك-غيغاواط.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific - Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific - Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific - Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific - Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
References
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S.
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al.
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
