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Genetics

Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

Usando un vector binario pBIBAC-GW hace generar plantas transgénicas con inserciones intactas de solo-copia, un proceso fácil. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector a través del proceso de generación de plantas transgénicas de Arabidopsis y prueba de las plantas para la integridad y copiar el número de los insertos.

Abstract

Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que la expresión estable de un transgen. Esto requiere una integración del transgén, sola, intacta como integraciones de copia múltiple a menudo son objeto de silenciamiento génico. El vector binario compatible con Gateway basado en cromosomas artificiales bacterianos (pBIBAC-GW), como otros derivados de pBIBAC, permite la inserción de los transgenes de la solo-copia con eficacia alta. Como una mejora a la original pBIBAC, un cassette de Gateway ha sido clonado en pBIBAC-GW, para que las secuencias de interés pueden ahora ser fácilmente incorporadas en la transferencia vector DNA (T-DNA) Gateway clonando. Comúnmente, la transformación con pBIBAC-GW resulta en un rendimiento de 0.2 – 0.5%, por el que la mitad de los transgénicos llevan una integración solo copia intacta del T-ADN. Los vectores pBIBAC-GW están disponibles con resistencia a glufosinato-amonio o DsRed fluorescencia en las capas de semilla para la selección de las plantas y con resistencia a la kanamicina como una selección de las bacterias. Aquí, se presenta una serie de protocolos que guían al lector por el proceso de generación de plantas transgénicas mediante pBIBAC-GW: a partir de la recombinación de las secuencias de interés en el vector de pBIBAC-GW de elección, a la planta de transformación con Agrobacterium, selección de los transgénicos y las pruebas de las plantas para la integridad y número de copia de los partes movibles utilizando ADN borrar. Se presta atención al diseño de una estrategia de Blot de DNA a reconocer solo y multi copy integraciones en loci únicos y múltiples.

Introduction

Durante la generación de plantas transgénicas, generalmente el objetivo es que el integrado transgene(s) estable expresado. Esto puede lograrse por integraciones copia intacta de un transgen. Integraciones múltiples pueden conducir a aumento de la expresión de un transgen, sino también al silenciamiento génico. Silenciamiento de transgenes es más probable si las secuencias insertadas están dispuestas en tándem o repeticiones invertidas1,2,3,4. Vectores binarios se utilizan como lanzaderas en Agrobacterium-mediada por experimentos de transformación a entregar las secuencias de interés en genomas de plantas. El número de integraciones en el genoma de una planta es dependiente en el número de copias del vector binario en Agrobacterium tumefaciens5,6. Muchos vectores binarios utilizados son vectores de alta copia y por lo tanto producir un número de copia del transgen promedio alto: 3.3 a 4.9 copias en Arabidopsis5.

El número de integraciones de T-DNA puede reducirse mediante el uso de vectores binarios que tienen un número de copia baja en a. tumefaciens, como BIBAC7o lanzando un T-DNA de a. tumefaciens cromosoma5. El número medio de integración del transgén en tales casos es inferior a 25,8,9,10. Debido a que solo copia en a. tumefaciens y también en Escherichia coli, derivados de la BIBAC pueden mantener y ofrecer construcciones tan grandes como 150 kb11.

GW-compatible BIBAC vectores10,12 permiten fácil introducción de los genes de interés en el vector mediante clonación de Gateway. El uso de la tecnología Gateway simplifica enormemente el procedimiento de clonación, pero también supera problemas comunes asociados con gran número de copias bajo vectores13,14, tales como un bajo rendimiento de ADN y una selección limitada de restricción única sitios disponibles para la clonación7,11. Los derivados pBIBAC-GW están disponibles con cualquier resistencia al glufosinato-amonio (pBIBAC-BAR-GW) o fluorescencia DsRed en las capas de semilla (pBIBAC-RFP-GW) para la selección de las plantas (figura 1)10,12. Para ambos vectores, se utiliza un gen de resistencia a kanamicina como el marcador de selección en las bacterias.

Se combinan los vectores pBIBAC-GW: diseño (1) fácil y manipulación genética en e. coliy (2) intacto solo copia integraciones en planta con alta eficiencia. La producción de vectores pBIBAC-GW en integraciones promedio 1.7 en Arabidopsis con aproximadamente la mitad de las plantas transgénicas con un solo había integrado T-ADN10.

La expresión estable de transgenes es un requisito para la mayoría transgénicos generados. Expresión del transgén estable puede lograrse mediante integraciones intactos, solo copia. Sin embargo, trabajar con plantas transgénicas portadoras de integraciones intactos, solo copia es aún más importante si por ejemplo, el objetivo es estudiar la eficiencia de los procesos basados en la cromatina, como la mutagénesis, recombinación, o reparación y la dependencia de estos procesos en la localización genómica y la estructura de la cromatina en el sitio de inserción. Para nuestro interés, para estudiar la dependencia de mutagénesis de oligonucleótidos dirigidos (ODM) en el contexto genómico local, un conjunto de líneas de reportero con integraciones intactos, solo copia de un gen reportero de mutagénesis fue generado (figura 2)10. Mediante este conjunto de líneas, fue demostrado que la eficacia ODM varía entre loci transgénicos integrados en diversas localizaciones genómicas, a pesar de los niveles de expresión de transgenes siendo algo similar.

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Protocol

1. inserción de secuencias de interés en el Vector binario

  1. Preparar la entrada de la puerta de enlace y vectores binarios.
    1. Aislar el vector de entrada de la puerta de entrada que contiene un fragmento de ADN o un gen de interés mediante un kit de preparación mini-para el según las sugerencias de los proveedores.
      Nota: GW BIBAC vectores requieren el uso de kanamicina (Km) para la selección de bacterias, por lo tanto, utilizar un vector de entrada con otro marcador de resistencia en lugar de kanamicina. Por ejemplo, el vector pENTR-gm, lleva un gen de resistencia a gentamicina, es una buena opción12.
    2. Propagar y aislar el vector de la BIBAC GW de interés. Utilizar una cepa de e. coli que es resistente a la toxicidad del gen ccdB presente dentro de la cinta de entrada. Aislamiento BIBAC-vectores usando protocolos o kits específicamente diseñados para grandes plásmidos según las sugerencias de los proveedores.
  2. Llevar a cabo una reacción de Gateway.
    1. Preparar la reacción de recombinación LR según las sugerencias de los proveedores. Mezclar los siguientes componentes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a temperatura ambiente (RT): 100 – 300 ng clon de entrada (superenrollado), 300 ng del vector de la BIBAC-GW, LR Clonase buffer de reacción (concentración final: 1 x). Ajustar el volumen de la mezcla a 16 μl con TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0). Por último, añadir 4 μL de mezcla de enzima Clonase LR y mezclar con un vórtex. Incubar la mezcla a 25 ° C durante 1 hora.
    2. Terminar la reacción de LR por añadir 2 μl de solución de proteinasa K (2 μg/μl) a la mezcla preparada en el paso 1.2.1. Mezcla e incubar a 37 ° C durante 10 minutos.
  3. Transformar e. coli con la mezcla de reacción de la puerta de entrada por electroporación.
    1. Desalar la mezcla de reacción de LR antes de la electroporación.
      Nota: Este paso es vital para la exitosa electroporación. A continuación una diálisis método es descritos, pero otros métodos como la precipitación con acetato de sodio y etanol también puede ser utilizado.
      1. Preparar la instalación para la diálisis de filtro de la reacción de LR. Vierta 20 mL de agua desionizada ultrapura en una placa Petri estéril. Coloque un disco de filtro de membrana (tamaño de poro = 0.025 μm) en la superficie del agua.
      2. Pipetear la reacción entera de LR con cuidado encima de la membrana y deje que la mezcla se dializan a temperatura ambiente durante 1 hora.
    2. Añadir 5 μl de la mezcla LR desalada a células DH10B electro-competentes en una cubeta de electroporación (0,1 cm). Electroporate las células (1,5 V/cm, resistencia 200 Ω, capacitancia de 25 μF) y añada inmediatamente 1 mL precalentado catabolito óptimo Super represión (SOC) medio a las células, seguidas de incubación a 37 ° C por 45 min, 180 rpm. (Medio SOC, extracto de 1 L: 20 g de Bacto triptona, 5 g de levadura, 0.5 g de NaCl, 2,5 mL de 1M de KCl, 20 mL de 1 M filtro esterilizado glucosa).
      Nota: Las células DH10B pueden sustituirse por otras células de e. coli que mantiene estable plásmidos grandes.
      Nota: Las condiciones óptimas de electroporación son dependientes en el aparato de electroporación utilizado.
    3. Pellet de bacterias a la máxima velocidad durante 30 s utilizando una microcentrífuga, quitar exceso SOC y resuspender el pellet en aproximadamente 50-100 μl de medio Luria-Bertani (LB). Trasmitir las bacterias en placas de LB de kanamicina (Km-LB) (concentración Km, 40 μg/mL) e Incube las placas a 37 ° C durante la noche. (Medio LB, extracto de 1 L: 10 g de Bacto triptona, 5 g de levadura, 10 g de NaCl. Para medio sólido añadir agar, 15 g/L).
  4. Identificar los derivados BIBAC GW recombinados y aislar ADN de plásmido.
    1. Para ser capaces de crecer en placas de LB Km, las células de e. coli deben contener el plásmido recombinado de BIBAC GW en el que se sustituye la secuencia ccdB con el relleno deseado. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Colonia15 para comprobar si las colonias de bacterias de la placa contienen la plásmidos correcto, teniendo la columna vertebral de la BIBAC-GW y el inserto de interés.
      1. Para identificar la columna vertebral de pBIBAC-BAR-GW, realizar una reacción de15 PCR con los primers DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'y DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Este primer conjunto amplifica un fragmento 563 de bp del gen bar .
      2. Para comprobar la presencia de la columna vertebral de la BIBAC-RFP-GW, realizar una reacción de15 PCR, utilizando primers M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'y M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Esta combinación de cartilla amplifica un fragmento de bp 791 superpuestas la cruciferin promotor y rfp secuencia.
      3. Realizar reacciones de15 PCR usando las cartillas gene-específico para verificar la presencia del inserto de interés.
    2. Inocular una colonia positiva solo en 2 – 5 mL de medio LB con kanamicina (40 μg/mL) para aislamiento de DNA16. Incubar a 37 ° C en un agitador orbital a 180 rpm, durante la noche.
    3. Aislar el ADN del plásmido (ver paso 1.1.2).

2. preparación de a. tumefaciens para mojar flores de Arabidopsis

  1. Transformación derivados de la BIBAC-GW para a. tumefaciens.
    1. Preparar células electro-competentes de ayudante de cepa C58C1 llevan el pCH32 de a. tumefaciens plásmido7. Crecen las bacterias en presencia de tetraciclina (5 μg/mL) y rifampicina (100 μg/mL) para seleccionar para pCH32 y lograr un crecimiento de sólo células de Agrobacterium .
    2. Añadir 0,25 – 0,5 μg de ADN de un derivado pBIBAC-GW, previamente disueltos en 10-20 μl ultrapura desionizada agua estéril, a células de Agrobacterium competentes de 20 μl en cubetas de electroporación (0,1 cm). Mantener las células en hielo.
    3. Electroporate las células (1,5 V/cm, resistencia 400 Ω, capacitancia de 25 μF). Inmediatamente después de la electroporación, añada 1 mL precalentado (28 ° C) SOC medio a las bacterias e incubar las células a 28 ° C durante 60-90 minutos.
    4. Extensión 100 μl y el resto de las bacterias en placas LB separadas que contiene rifampicina (100 μg/mL), tetraciclina (5 μg/mL) y kanamicina (40 μg/mL) e incubar en la oscuridad a 28 ° C durante 1-2 días.
  2. Preparar la suspensión de Agrobacterium .
    1. PCR para comprobar un par de las colonias de a. tumefaciens de la placa preparada en el paso 2.1.4, la presencia del vector correcto (ver paso 1.4.1).
    2. Racha de una sola Colonia confirmada para contener el vector binario con el inserto apropiado en una placa LB que contengan antibióticos (ver paso 2.1.4). Crecimiento a 28 ° C durante la noche.
    3. Repetir las rayas con una sola Colonia obtenida en el paso 2.2.2.
    4. Inocular una colonia solo en 2,5 mL de LC medio suplementado con antibióticos (ver paso 2.1.4) para planas. Incubar a 28 ° C durante al menos 8 horas o durante la noche, a 180 rpm. (Medio de LC, 1 L: 10 g de Bacto triptona, 5 g de levadura extracto, 0.5 g de NaCl, 2.5 g de MgSO4 · 7 H2O, 2 g de maltosa).
    5. Añadir las planas de paso 2.2.4. a 250 mL LC suplementado con antibióticos (ver paso 2.1.4) y crecer a 28 ° C, a 180 rpm, durante la noche.
    6. Pellets la cultura por giro a 5.500 x g durante 12 minutos vuelva a suspender el sedimento en 100 mL de solución contiene 5% de sacarosa, 0.05% Silwet L-77, 0.5 x MS. Vierta la suspensión en un recipiente estéril para la inmersión floral de las plantas.

3. transformación de Arabidopsis

  1. Preparar las plantas Arabidopsis para la transformación.
    1. Crecen plantas de Arabidopsis en una cámara de crecimiento controlado invernadero o clima hasta que florecen (macetas de 12 con 9 plantas por inmersión).
    2. Clip los pernos primeros para permitir más pernos secundarios a emerger. Las plantas están listas para sumergir 4 – 6 días después del recorte, cuando las plantas tienen muchas cabezas de flores inmaduras y no muchos fecundados silicuas.
  2. Inmersión floral
    1. Inflorescencias de 5-10 s en Agrobacterium suspensión preparada en el paso 2.2.6 de la inmersión. Uso de agitación suave.
    2. Envuelva las partes de las plantas en film transparente para mantener la humedad alta y cubrir las macetas con una caja para mantener las plantas en la oscuridad. Incube las plantas por 2 días en una cámara de crecimiento efecto invernadero.
    3. Quite la caja y la película se aferran y crecen las plantas a la madurez en una cámara de crecimiento efecto invernadero.
      Nota: Para aumentar la eficiencia de transformación, las mismas plantas pueden volver a sumergido 7 días después de la primera inmersión.
    4. Las semillas de la cosecha. Piscina y analizar las semillas (T1) de las plantas, transformadas con la construcción misma, como un conjunto único.
  3. Pantalla para plantas transgénicas.
    1. Para pantalla para plantas transgénicas transformadas con un derivado de pBIBAC-RFP-GW, analizar las semillas utilizando microscopía de fluorescencia. Para detectar expresión DsRed en Testa, imagen de las semillas en una excitación de 560 nm y la emisión de 600-650 nm. Separar las semillas fluorescentes fluorescentes no homólogos con unas pinzas.
    2. Para pantalla para plantas transgénicas transformadas con un derivado de pBIBAC-BAR-GW, sembrar las semillas en bandejas con suelo (~ 2.500 semillas/0.1 m2). Para asegurar una dispersión incluso de semillas en bandejas, suspender las semillas en agar al 0,1% en 0.5 x medio de Murashige Skoog (MS) y extender las semillas utilizando una pipeta de 1 mL.
      Nota: Para estimular las semillas a germinar de manera sincrónica, Incube las semillas durante al menos 2 días a 4 ° C. Esto puede hacerse antes o después de la siembra de las semillas.
      1. Rocíe las plantas de semillero con 0.5% al glufosinato-amonio solución 2 semanas y 3 semanas después de la siembra en bandejas. Utilice 500 mL de solución de glufosinato-amonio por 1 m2.
      2. Transferencia sobreviven plantas de semillero a macetas individuales. Una imagen típica de una bandeja con plántulas antes y después del tratamiento de glufosinato-amonio (segundo) se muestran en la figura 3.
      3. Analizar las plantas resistentes al glufosinato-amonio por PCR la presencia del constructo de interés (consulte el paso 1.4.1. para imprimaciones).
        1. Aislar la DNA de genomic de la planta de polimerización en cadena usando el método descrito por Edwards et al. 17

4. Caracterización de transgénicos para el número y la integridad del T-ADN integraciones

  1. Estrategia de digestiones de restricción
    Nota: Determinar el número de integraciones de T-DNA y su integridad frotando ADN mediante enzimas de restricción. Este método permite para identificar solo, pero también repite integraciones en el mismos o diferentes loci en el genoma.
    1. Utilizar una serie de digestiones de restricción para identificar los patrones de integración diferentes posibles:
      1. Seleccione una enzima que corta una vez en el medio del T-ADN, poder sonda independientemente secuencias aguas arriba y aguas abajo del sitio de restricción (Figura 4A y Figura 7A-C). Ver Figura 4Ay la leyenda de la figura para los resultados esperados y la interpretación.
      2. Seleccione una enzima o una combinación de enzimas cortando toda la secuencia de interés a la vez (Figura 4B y Figura 7A-D). Cualquier desviación de la longitud conocida indica truncamiento del cassette integrado.
        Nota: tenga cuidado de utilizar sólo las enzimas de restricción que no son sensibles a la metilación de la citosina.
  2. Preparar las muestras de ADN genómicas.
    1. Aislar el ADN genómico de plantas portadoras del constructo de interés. Un método de CTAB DNA miniprep puede utilizarse para aislamiento de DNA18. Para ADN blot análisis de la DNA de Arabidopsis , se necesita 2 – 2,5 μg de ADN genómico. Disolver el ADN en 50 μl de TE.
    2. Comprobar la integridad del ADN por electroforesis de gel de16. ADN genómico intacto migra como una banda discreta en la parte superior del gel. Degradación del ADN puede ser reconocida como la presencia de un frotis. Para evitar daños en el ADN debido a la congelación-descongelación repetido, muestras de ADN genómicas se mantienen a 4 ° C.
    3. Digestión del ADN genómico (2 – 2,5 μg en el caso de ADN genómico de Arabidopsis ) en un volumen total de 50 μL, durante la noche, usando condiciones de búfer sugeridas por el proveedor de enzima.
      1. En un tubo de ensayo, mezcla de 2 – 2,5 μg de ADN genómico de Arabidopsis y 5 μl de tampón de restricción 10 x enzima de restricción U 5 en un total de 50 μl de agua desionizada ultrapura.
    4. Agregar colorante de carga (1 x concentración final) a las muestras de la restricción antes de cargar en un gel. Para el buen seguimiento visual, utilice uno de los siguientes: comigrating con pequeños fragmentos (azul de bromofenol, 350 – 400 bp), o comigrating con grandes fragmentos (Cylene cyanol, kbp de 3 – 4).
  3. Correr el gel de DNA.
    1. Preparar un largo (20 cm) 0,5 x TBE agarose gel19. El porcentaje de agarosa en el gel depende de los tamaños del fragmento esperados. 0,8 – 1% óptimo separa fragmentos > 1 kb de tamaño. Uso de 1 – 1,5% agarosa para fragmentos < 1 kb. No añadir bromuro de etidio el gel. (5 x TBE, 1 L: 54 g de Trizma base, 27,5 g de ácido bórico, 3.75 g de EDTA).
      Nota: Para evitar la contaminación del ADN, bandejas de gel de uso que no se utilizan para fraccionar plásmido y PCR amplifican la DNA.
    2. Cargar las muestras en gel19.
    3. Añadir marcadores de ADN para el gel que se encuentran en el rango de tamaño de los fragmentos esperados. Carga de aproximadamente 1 μg de marcador (50-250 ng de fragmento de tamaño diferente) sobre el gel para permitir una visualización por la luz UV.
    4. Tamaño-fraccionar el ADN a una tensión baja (40-50 V/500 mA) durante la noche.
  4. Preparar para la transferencia del ADN desde el gel de agarosa a la membrana de nylon.
    1. Transferir el gel a una bandeja aparte y mancha para 20 – 25 min en 0,5 x TBE que contienen bromuro de etidio (5 μg/mL) girando a 40 rpm en un agitador orbital.
    2. Visualizar el gel en un transiluminador UV. Verificar la separación del tamaño de la DNA genomic, incluyendo visibilidad de bandas discretas satélite (figura 5A). Un borrón de transferencia hacia tamaños de peso molecular inferiores indica degradación del ADN.
    3. En el transiluminador UV, pone una transparencia sobre el gel y marque la posición de las ranuras y las bandas del marcador con un rotulador (figura 5B). Esto facilitará la determinación del tamaño de los fragmentos hibridizados más adelante en el caso de las secuencias de marcador no hibridan específicamente con la sonda de ADN. Indicando los fragmentos del marcador en este paso, es posible que el tamaño de los fragmentos de cruzamiento por hibridación de la pista.
    4. Coloque el gel en la bandeja, enjuague con agua desionizada ultrapura y sumérjalo en 0.25 M en HCl durante 15 min a fragmentan el ADN en el gel. Lavar con agua desionizada ultrapura. Utilice suficiente ácido clorhídrico y agua para cubrir el gel en la bandeja y gire la charola con el gel sumergido a 40 rpm en un agitador orbital.
    5. Incubar el gel en tampón de desnaturalización durante 30 minutos lavar con agua desionizada ultrapura. Use suficiente buffer y agua para cubrir el gel en la bandeja y gire la charola con el gel sumergido a 40 rpm en un agitador orbital. (Tampón de desnaturalización: 0.5 M NaOH, 1,5 M de NaCl).
    6. Incubar el gel en tampón de neutralización de 30 minutos lavar con agua desionizada ultrapura. Utilice suficiente agua y tampón para el gel en la bandeja de la cubierta, gire la charola con el gel sumergido a 40 rpm en un agitador orbital. (Tampón de neutralización: 0.5 M Tris, 1,5 M de NaCl, HCl, de 220 mM, pH 7.6).
  5. Transferir el ADN a una membrana de nylon.
    1. Preparar la configuración para la transferencia capilar de la DNA genomic. Coloque una placa de plástico (aproximadamente del tamaño del gel o más grande) sobre una bandeja llenada con 20 x citrato salino-sódico (SSC). Doble un pedazo de papel de filtro grueso sobre la bandeja, para que ambos de sus extremos se cuelgan en el SSC. Cortar un trozo de gel de tamaño de la membrana de nylon cargada positivamente Hybond N + y 2 piezas de papel filtro grueso. (20 x SSC: NaCl de 3 M, citrato de sodio de 0.3 M).
    2. Prepare la instalación Blot (figura 6) colocando el gel, las ranuras hacia abajo en la parte superior el papel de filtro en la placa de plástico. Colocar una membrana Hybond N+ en la parte superior, seguido de 2 capas de papel de filtro. Humedezca previamente cada capa de 20 x SSC antes de añadirlos a la Asamblea. Asegúrese de eliminar cualquier burbuja de aire entre capas como estas impiden a la transferencia de ADN.
    3. Cubrir el conjunto con una capa gruesa de papel de seda. Coloque una placa de plástico con un peso, como una botella pequeña, en la parte superior. Asegúrese de que la presión se divide igualmente en el gel. Esto asegurará a la transferencia correcta de la DNA.
      Nota: El peso debe ser aproximadamente 200 – 300 g; pesos pesados dificultan a la transferencia de ADN.
    4. Cubra el área que rodea el conjunto, incluyendo el papel filtro expuesto, con film transparente (figura 6) para evitar la evaporación de la 20 x SSC buffer y objetivo que las fuerzas de los capilares hacia la membrana de nylon. Secar durante la noche.
    5. Marque la posición de las ranuras, el nombre o la fecha encima de la membrana con lápiz y quitar la membrana de la Asamblea. Tenga en cuenta que la parte que ha estado en contacto con el gel, lleva el ADN.
    6. Inmediatamente fijar el ADN a la membrana por la irradiación UV (2.400 μj/m2) usando un Crosslinker UV.
      Nota: Condiciones de reticulación dependen del tipo de membrana utilizado.
      Nota: en este punto la membrana puede ser almacenada a-20 ° C y utilizada por hibridación con una sonda más adelante. Enjuagar la membrana reticular en 2 x SSC y un sello en la dobló la tubería del polietileno termosoldables antes de colocar a-20 ° C.
  6. Preparar la sonda de hibridación.
    1. Amplificar la secuencia como sonda para la transferencia de ADN por PCR20. 50-100 ng de un fragmento PCR 250 kbp de bp-2 se utiliza como sonda. Dos sondas separadas, uno cruza por hibridación a la región proximal del borde derecho y el otro a la región proximal del borde izquierdo del T-DNA, pueden utilizarse para evaluar la presencia de todo T-DNA (Figura 4A y figura 7).
    2. Diluir 50-100 ng del producto de PCR en 24 μl de agua desionizada ultrapura en un tubo de ensayo.
    3. Desnaturalizar el producto PCR diluido hirviendo durante 5 minutos en un vaso de agua o el calor, luego enfríe en hielo.
    4. Descongele la premade GCT-mix en el hielo. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (todos 0,5 mM), random hexamers 43.2 ng/μl, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM de β-mercaptoetanol, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6.8, 17 mM MgCl).
    5. Añadir 21 μl de la mezcla de GCT y 2 U de Klenow fragmento del producto de PCR.
    6. Añadir 2 μl de [32P] ATP a la mezcla e incubar a 37 ° C durante 1 h.
      PRECAUCIÓN: Todos los pasos que involucra ATP [32P] deban llevarse a cabo en un ambiente designado para trabajo radiactivo durante el uso de la protección adecuada.
      Nota: Asegúrese de que el ATP [32P] es fresco (no más de 1 tiempo transcurrido).
    7. Preparar un Sephadex G-50 (grueso o medio) de la columna21 para purificar la sonda marcada de unincorporated nucleótidos (radiactivos). Tomar una jeringa de 2 mL y tapa la salida con un pequeño círculo de papel filtro grueso. Añadir 2 mL de Sephadex G-50 disuelta en TE en la jeringa y extraer todo el líquido de la columna spinning.
    8. Coloque la columna en un tubo de plástico de 15 mL, carga la sonda marcada en la columna y centrifugado a temperatura ambiente (establece la centrifugadora a x 750 g, permiten el rpm aumentar hasta llega a 750 g x, entonces parar la centrífuga y permitir la rotación bajando a 0 x g) a fin de eluir la sonda. Añadir 200 μL de TE a la columna y vuelta a fin de eluir la sonda restantes; repetir una vez. En estas condiciones, fragmentos de ADN marcados quedan excluidos de la matriz de Sephadex y procederá a la elución, mientras que nucleotides libres permanecen en la columna.
    9. Utilizar 300 μL de la sonda marcada por el tubo de hibridación. Mantenga la sonda marcada restantes a-20 ° C para uso posterior. Sin embargo, tener presente el tiempo medio de ATP [32P].
  7. Hibridar lo blot de DNA.
    1. Calor 2 x SSC y tampón de hibridación (15 mL por tubo de hibridación, máximo de 2 manchas blancas por el tubo) a 65 ° C. (Tampón de hibridación: sulfato de dextran 10%, 1% SDS, 1 M NaCl, 50 mM de Tris pH 7,5, disolver a 65 ° C, mantener alícuotas a-20 ° C).
    2. Precalentar el horno de hibridación a 65 ° C.
    3. Colocar malla de nylon en una bandeja con un poco de caliente (65 ° C) 2 x SSC para cubrir la bandeja. Coloque el blot de DNA sobre la malla con el lado de ADN hacia arriba. Rollo de la mancha junto con la malla y coloque el rollo en un tubo de hibridación. Retirar el exceso 2 x SSC.
    4. En un tubo de microcentrífuga, hervir 150 μL de ADN de esperma de salmón (concentración 10 mg/mL) por el tubo de hibridación durante 5 minutos (véase también paso 4.6.3). Enfriar inmediatamente en hielo y añadir el tampón de hibridación precalentado.
    5. Añadir la solución de esperma salmón tampón de hibridación al tubo con el blot. Pre-hibridar a 65 ° C durante al menos 1 h en un disco giratorio, a 12 rpm.
    6. Cuando la previa incubación en el paso 4.7.5. está casi terminado, hervir 300 μL de la sonda marcada por 5 min (véase también paso 4.6.3) y añadir inmediatamente a la mancha después de la incubación.
    7. Hibridar durante la noche en la rueda giratoria a 63 ° C, 12 rpm. No pipetear la sonda directamente sobre la mancha, pero en la solución de esperma salmón tampón de hibridación.
  8. Lave la mancha.
    1. Precalentar las soluciones de lavado (1 x SSPE, SDS 0.1% y 0.1 x SSPE, 0.1% SDS) a 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7.0).
    2. Deseche la solución de hibridación y añadir unos 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solución al 0.1% SDS al tubo de hibridación, cierre el tubo y girar a mano. Vierta la hibridación y lavado solución en los residuos radiactivos líquidos apropiados.
    3. Añadir unos 100 – 150 mL de 1 x SSPE, solución al 0.1% SDS al tubo, cierre e incubar los tubos durante 15 minutos a 63 ° C en la rueda giratoria, 12 rpm. Deseche la solución de lavado adecuadamente.
    4. Añadir unos 100 – 150 mL de 0.1 x SSPE, solución al 0.1% SDS al tubo de hibridación, cierre y girar el tubo durante 5 minutos a 63 ° C, 12 rpm. Deseche la solución de lavado adecuadamente.
    5. Tome la mancha blanca /negra del tubo y colóquelo en una bandeja que contiene suficiente precalentado 0.1 x SSPE, 0.1% SDS y agitar durante 3 minutos en un baño a 65 ° C. Mientras tanto, lavar la malla en una bandeja llenada de agua.
    6. Sacar la mancha, coloque entre plástico previamente doblado (tubería de polietileno), cuidadosamente Limpie el exceso de líquido y dejar que la mancha se seque brevemente. Tenga en cuenta que el líquido se arruinará la pantalla phosphorimager.
    7. Sello de la mancha de plástico en los tres lados. Retire todo exceso de líquido que rodea lo blot y cerrar el tubo de plástico de sellado el cuarto lado. Corte el exceso de plástico. Asegúrese de que la mancha sellado no tiene fugas y que el plástico es seco en el exterior.
  9. Exponer la pantalla phosphorimager.
    1. Lugar el blot sellada en un cassette phosphorimager, con la pantalla phosphorimager hacia el lado de ADN de la mancha. Cerrar el cassette y dejar ± 2 a 4 días, dependiendo de la fuerza del etiquetado radiactivo y la sensibilidad de la phosphorimager.
    2. Escanear la pantalla phosphorimager usando un phosphorimager. Tenga cuidado al exponer la pantalla lo menos posible a la luz antes de la exploración. Guarda la imagen. Borrar la pantalla de la señal, exponiéndolo a la luz.
  10. Analizar el blot.
    1. El análisis depende de la estrategia de restricción utilizada en el paso 4.1. Al analizar la mancha preparado según la estrategia que se muestra en el paso 4.1.1.1 (Figura 4A), contar el número de los fragmentos detectados. En esta estrategia, el número de fragmentos hibridadas se refiere al número de integraciones de T-DNA.
      1. Comparar el número de los fragmentos detectados con una sonda para la izquierda (figura 7B) y la parte derecha (figura 7) del T-ADN.
        Nota: Si un número diferente de cruzamiento por hibridación de fragmentos es detectado, entonces cualquiera de los dos i) T-DNA copias múltiples (ya sea en orientación directa o invertida) o ii) incompleto integrado T-DNAs están presentes.
      2. Estimar los tamaños de fragmentos hibridadas en el blot basan en el tamaño de las bandas del marcador y comparar los tamaños de los fragmentos hibridadas con el fragmento esperado tamaños calculan basados en la estrategia de restricción de las inserciones de tándem (Figura 4A) a identificar el arreglo posible tándem de las T-DNAs. Guíese por la Figura 4A para calcular el tamaño de los fragmentos esperados.
        Nota: Si el tamaño de fragmentos hibridizadas no está de acuerdo con los calculados, entonces muy probablemente uno de las integraciones de presente no es completa.
    2. Al analizar la mancha preparado según la estrategia que se muestra en el paso 4.1.1.2 (Figura 4B), estimar el tamaño del fragmento del cruzamiento por hibridación en blot basándose en el tamaño de las bandas del marcador y compararlo con el tamaño esperado. Una inserción intacta produce un solo fragmento con una longitud definida. Cualquier desviación de la longitud esperada indica integración incompleta (figura 7).
  11. Tira de la mancha blanca /negra de la hibridación (opcional).
    Nota: La misma mancha puede ser cruzado por hibridación consecutivamente con diversas puntas de prueba. Antes de continuar con una nueva sonda, tira una sonda hibridada anterior del blot.
    1. Para quitar la punta de prueba de la mancha, lugar de la mancha en una bandeja con su ADN hacia abajo. Vierta un superávit de 0,5% de SDS en la bandeja. Hervir la membrana 2 – 5 minutos. La duración del tratamiento depende del tamaño y contenido de GC de la sonda utilizada. Las sondas más largas y ricas en GC necesitan un tratamiento más largo.
    2. Después de decapar, hibridar el blot con otra sonda, sellar y almacenar a-20 ° C.

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Representative Results

Usando el sistema de la BIBAC-GW, construcciones de reportero para el estudio de ODM en las plantas fueron generado10. Construcciones fueron diseñadas en la entrada de la puerta de entrada vector pENTR gm12 y se inserta en pBIBAC-BAR-GW (figura 1) mediante la reacción de recombinación Gateway LR.

Arabidopsis se transformaron con pDM19, un plásmido de la BIBAC-BAR-GW con un reportero de mTurquoise-eYFP lleva un codón de parada traslacional en el marco de lectura eYFP en la posición 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (figura 2)10. En total, 126 plantas de Arabidopsis fueron transformadas (9 plantas por maceta, macetas de 14). Semillas de estas plantas fueron agrupadas, sembradas en bandejas con suelo y permitió que creciera durante dos semanas antes del tratamiento con solución de glufosinato-amonio. Sólo las plántulas expresando el gen bar (presente en BIBAC-BAR-GW) sobrevivirán tratamiento glufosinato-amonio (figura 3). En total, se identificaron 11 transgénicos transformadas con pDM19 correspondiente a una eficiencia de transformación de 0.02% de las semillas analizadas.

Para los 11 transgénicos aislados, borrar de ADN se utilizó para determinar el número de integraciones de T-DNA. Para ello, la DNA de genomic fue cortado con BglII o ScaI (estrategia como concebido en la Figura 4A). Ambas de estas enzimas de restricción cortan solamente una vez en la secuencia del ADN de T (Figura 7A). Hibridación con sondas reconociendo la barra y eYFP codificación regiones permitieron la detección del número de fragmentos de ADN correspondientes.

La cantidad de ADN individual los fragmentos en el Blot permitida estimar el número de inserciones del T-ADN en las líneas de reportero (tabla 1). Solo fragmentos de cruzamiento por hibridación con sonda eYFP tanto de la barra indican la presencia de una única integración del T-DNA. Desde el 11 transgénicos analizados, seis llevan a integraciones individuales. El número promedio de integraciones fue 1.2.

Para 6 líneas con una sola integración del T-DNA, la integridad del reportero insertado constructo se evaluó mediante ADN borrar (estrategia como concebido en la Figura 4B). La DNA de Genomic fue cortado con BglII y Pcique para liberar un fragmento de 5,5 kb que contiene el gene de fusión de la barra y mTurquoise-eYFP (Figura 7A). Una sonda contra eYFP fue utilizada para detectar el fragmento esperado. Todas las plantas probadas llevaron un fragmento intacto. Nota que examinaron el fragmento excluye a la izquierda y la frontera del derecho T-ADN y por lo tanto no examina la integridad del T-ADN entero, pero sólo la parte que contiene los transgenes de interés.

Se determinó la expresión del gen reportero fluorescente en líneas transgénicas independientes solo copia difieren sólo por la localización genómica del T-ADN. Niveles de transcripción relativa del reportero de mTurquoise-eYFP impulsado por el promotor CaMV 35S fueron medidos por RT-qPCR en cuatro líneas de reportero DM19 llevar integraciones intactos, solo copia de las cuales la posición genómica fue determinada10. La variación en los niveles de expresión de gen reportero entre las líneas es menor: la máxima diferencia en los niveles de RNA mTurquoise-eYFP fue 2 veces (figura 8A).

A continuación, el ODM se llevó a cabo en estas líneas de reportero. Tres de las cuatro líneas de reportero independiente demostraron similar eficacia ODM (figura 8B). Sin embargo, una línea, DM19 [4] 1, rindió una muy baja eficiencia ODM en comparación con las otras líneas. Estos resultados indican que los ODM se ve afectado por el contexto genómico local. De qué manera el contexto genómico local la integración del T-DNA en DM19 [4] 1 difiere de las otras líneas restos a identificar. Análisis de conjuntos de datos disponibles en marcas de activo e inactivo de la cromatina en los sitios de integración T-DNA genomic en plantas no-transgénicas no presentó una respuesta10.

Figure 1
Figura 1: mapa funcional de vectores pBIBAC-GW. derivados de pBIBAC-GW están disponibles con cualquier resistencia al glufosinato (bar) o fluorescencia DsRed en las capas de semilla (DsRed) como un marcador de selección en las plantas. Para dos vectores, un gen de resistencia a kanamicina es el marcador de selección en las bacterias. El Gateway ccdB cassette se muestra entre las puntas de flecha verdes que representa la recombinación sitios attR1 y attR2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: construcción de reportero mutagénesis. Los genes del reportero mTurquoise-eYFP son conducidos por el promotor CaMV 35S. MTurquoise región de la codificación está fusionada a un eYFP codificación región portadoras de una mutación de C-A en la posición 120, dando por resultado un codón de parada prematuro traslacional TAA y terminación prematura de la traducción de la proteína de fusión. 3′ señal de poliadenilación de Nopaline Synthase (nos 3') se utiliza para terminar la transcripción de la construcción de22. Señal de localización nuclear (NLS) se utiliza para apuntar las proteínas traducidas al núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: bandeja llena de plántulas de Arabidopsis antes y después del tratamiento de glufosinato-amonio. Las plántulas no expresan el gen bar que está presente en el T pBIBAC-BAR-GW-die de ADN después de ser rociado con glufosinato-amonio en solución. Las fotos muestran la misma bandeja de plántulas (A) antes de rociar con glufosinato-amonio, 14 días después de la siembra y (B) 10 días más tarde, después de rociar dos veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: estrategia de restricción de ADN General para identificar el número y la integridad de inserta T-DNAs. (A) un sitio de restricción (R) en medio de la T-DNA permite sondear independientes de la izquierda (L rojo) y la parte derecha del T-ADN (verde R). Las caricaturas de la derecha muestran que dependiendo de integraciones de single o multi copy T-ADN, diferentes patrones de bandas se obtienen con ADN borrar. Bandas marcan con un * tienen una longitud definida, mientras que la longitud de otras bandas depende del sitio de restricción más cercano en el flanqueo de la DNA genomic. Insertar solo: La L y R sonda ambos dan un fragmento independiente. El tamaño del fragmento promedio esperada se puede calcular basado en la frecuencia del sitio de la restricción en el genoma. El tamaño mínimo es la distancia desde el sitio de la restricción a la izquierda frontera (LB) o derecho de frontera (RB), dependiendo de qué extremo de la integración está siendo sondeado, y si el T-ADN intacto. Repeat tandem: Las sondas para L y R dan ambos dos fragmentos; para cada sondeo uno de los fragmentos incluye flanqueando la DNA genomic, el segundo fragmento tiene un tamaño esperado y se identifica con ambas puntas de prueba. Repetición invertida: Dependiendo de la direccionalidad del cassette integrado, pueden identificarse una L y dos fragmentos de R, o dos L y una R. Inserciones solo individuales: El resultado es un número de fragmentos independientes, y el número de fragmentos corresponde al número de integraciones. (B) restricción sitios en las extremidades de la T-DNA permiten determinar la integridad del fragmento entre los sitios de restricción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: un gel de agarosa con el patrón de restricción y la correspondiente transparencia. (A) en el gel de agarosa de ADN genómico digerido con EcoRse muestra. La adecuada digestión de la DNA es ilustrada por la presencia de bandas discretas satélite. (B) marca la posición de las ranuras y las bandas del marcador en una transparencia, es posible que más adelante fácilmente calcular el tamaño del cruzamiento por hibridación de fragmentos. Aquí, se utilizan marcadores de MRC Holland (azul y rojo), indicada por M. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: configuración para borrar capilar. En un tubo capilar Borrar configuración, papel de filtro se coloca en una placa plástica con los extremos del libro suspensión en tampón x SSC 20. El papel se humedece con 20 x SSC y un gel de agarosa que se coloca en la parte superior, seguida por una membrana de nylon, papel de filtro y una pila de los tejidos. Un peso ligero se coloca en la parte superior. Cuidado de eliminar burbujas de aire entre el gel, papel y membrana. Film transparente se utiliza para evitar el resecamiento de la configuración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: ejemplo de ADN borrar estrategia y resultado experimental. (A) ADN borrar estrategia para determinar el número y la integridad de integraciones de T-DNA. Puntos de corte de las enzimas de restricción seleccionadas dentro del T-ADN se indican con barras verticales. El eYFP y barra de sondas para hibridación con ADN genómico digerido se indican mediante una línea con el punto terminal debajo del T-ADN. (B–D) ADN ejemplo blots. La DNA de Genomic fue cortada con Scay el blot fue sondeado con un bar y eYFP sonda (B y C). La DNA de Genomic fue cortar con BglII y Pciy sondada con una sonda de barra . Fragmentos intactos son 5.5 kbp en tamaño (D). Nota que el conjunto de muestras en D es diferente de las indicadas en B y C. * indica el tamaño del fragmento esperado; M, marcador. En B, C y D se utiliza el mismo marcador de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: niveles de expresión de mTurquoise-eYFP y eficiencias ODM en líneas de reportero independiente mTurquoise-eYFP. (A) pariente mTurquoise-eYFP transcripción los niveles medidos por RT-qPCR en líneas de reportero DM19. Se utilizaron niveles de transcripción de la actina para la normalización. (B) ODM eficiencia medida en las líneas de reportero DM19. Para A y B, las barras indican la media de al menos cinco réplicas biológicas. Barras de error indican SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de lugar geométrico del T-ADN NR de integraciones de T-DNA Línea de reportero Número de los fragmentos detectados Integridad
SCA Me BGL II BGL II/PciI
bar eYFP bar eYFP eYFP
Integraciones de locus único 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2] -5 1 1 1 1 +
1 19 [2] -9 1 1 1 1 +
1 19 [2] -11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
repetir 2, invertido 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, integración incompleta 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Integraciones de locus múltiples 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND: no determinado.

Tabla 1: Resumen de la DNA borrar datos para transgénicos aislado después de la transformación con pDM19.

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Discussion

Crítica a la generación de transgénicos con integraciones individuales, intactos de un transgen es la elección del vector binario utilizado. Vectores familia BIBAC se han utilizado para proporcionar secuencias de intereses a muchos planta especie23,24,25,26,27,28. Vectores de la BIBAC, incluyendo BIBAC-GW, rendimiento solo copia integraciones con alta eficiencia: el número promedio de la inserciones por línea es de 1,5 a 2, en comparación a 3 o superior para binario más utilizado vectores5,9, 29. como una importante mejora en comparación con otros vectores de la BIBAC, con los vectores de la BIBAC-GW, las secuencias de interés pueden ser insertadas fácilmente usando Gateway recombinación sitios12. Los vectores modificados superar los problemas generales de los vectores de la BIBAC en estrategias de clonación convencionales: i) un número muy limitado de sitios de restricción únicos y ii) un ADN bajo rendimiento. Los sitios de recombinación Gateway hacen BIBAC GW vectores una alternativa atractiva a otros vectores binarios para la generación de plantas transgénicas.

Aquí se describe una serie de protocolos, de generar BIBAC-GW derivados que contienen secuencias de interés, para planta de transformación y el ADN blot análisis para el número y la integridad de las secuencias transgénicas. Varios de los protocolos registrados en este trabajo, Gateway clonación, electroporación de bacterias y la transformación de la planta, es práctica común en muchos laboratorios y también puede ser realizada con ligeras modificaciones. Es importante saber que BIBAC-GW es un vector de la solo-copia en e. coli y en a. tumefaciens. Por lo tanto, al aislamiento de la DNA, el rendimiento es bajo; se recomienda ampliar el procedimiento de aislamiento.

En transgénicos llevan múltiples integraciones del T-ADN, los transgenes introducidos son sometidos a menudo a1,2,4,30el silenciamiento del gen y por lo tanto, para la mayoría de las aplicaciones evitarán. Para identificar las plantas transgénicas con integraciones individuales, intactos, se recomienda utilizar análisis blot de DNA. Mientras que métodos distintos de ADN borrar puede ser utilizado para determinar el número de copias del T-ADN y la integridad de los ADNs T en líneas transgénicas (análisis de segregación, cola-PCR cuantitativo PCR (qPCR) y digital gota PCR), aunque la mano de obra intensiva, Blot de DNA es a menudo el método de elección. Análisis de segregación no sean capaz de diferenciar entre múltiples e integraciones de T-DNA en loci individuales. COLA-PCR a menudo debajo-estimaciones de número de la copia, especialmente si más de una integración del T-DNA presente31y qPCR necesita optimización elaborado para resultados confiables31,32. Digital gota PCR es un método bastante preciso para la detección número de copia si el equipo requerido está disponible31. El beneficio adicional de transferencia de ADN es fácil detección de truncado T-DNAs, que fácilmente se pierde en todas las técnicas basadas en PCR.

Con análisis blot de DNA, los fragmentos de cruzamiento por hibridación de la mancha blanca /negra necesitan estar bien identificable en señal y tamaño. Varios factores se saben para afectar el resultado de ADN borrar. Además de una selección adecuada de enzimas de restricción (estrategia indicada en la figura 4) y marcadores de tamaño suficiente ADN de buena calidad. Menos de 2 μg de genoma de Arabidopsis ADN no dará fragmentos bien identificables. Cuando se trabaja con genomas más grandes, más el ADN es necesario. Para obtener cantidades suficientes de Arabidopsis ADN, pueden utilizarse los tejidos florales o plántulas 1 semana - viejas. Un lote de plántulas cultivadas en una placa de Petri rinde 2-8 μg de DNA. Para evitar la degradación del ADN durante el aislamiento, se debe tener cuidado para procesar el material de planta rápido. Además, la DNA de genomic resuspendió en Tris-EDTA para reducir su degradación por las nucleasas y almacenada a 4 ° C en lugar de-20 ° C para evitar mellar de ADN debido a repetidos ciclos de hielo-deshielo. Si no está seguro que todas las muestras de ADN son digeridas completamente, se sugiere rehybridize lo blot de DNA con una sonda reconociendo una región genómica endógena, única. Al seleccionar secuencias sonda para la identificación de secuencias transgénicas o endógenas, es crucial para sólo seleccionar secuencias únicas. Para ser capaces de determinar precisamente el tamaño de fragmentos hibridizadas, las posiciones de la DNA gel ranuras y bandas del marcador de ADN deben marcarse en una transparencia (figura 5B) al visualizar un gel teñido de bromuro de etidio (figura 5A) en UV transiluminador. En el caso de las secuencias de marcador no hibridar con la sonda de ADN, o hibridación es parcial, es la única forma de rastrear el tamaño del cruzamiento por hibridación de fragmentos.

Una vez que se tiene cuidado para lograr la hibridación buena señal y estimación del tamaño del fragmento, la interpretación de los resultados de Blot es sencilla. Cuando usando solamente una enzima de la restricción y cruzamiento por hibridación con diferentes sondas de detección o la parte izquierda o derecha del T-ADN, el número de fragmentos detectados refleja el número de inserciones de ADN de T. Por ejemplo, figura 7B, C muestra el mismo blot de DNA, cruzado por hibridación con sondas diferentes, bar (figura 7B) y proteína fluorescente amarillo mayor (eYFP) (figura 7), utilizando la estrategia que se muestra en la Figura 7A. Todos los carriles, excepto 4, mostrar un número igual de fragmentos en ambas lacras: dos fragmentos de line 6 y un solo fragmento de otras líneas. Este número de los fragmentos detectados es el número de inserciones de T-DNA.

Cuando el número de fragmentos detectados con puntas de prueba de enlace ya sea la izquierda o derecha parte del T-ADN es diferente (en cuanto a la figura 7BC, línea 4), inserciones incompletas están presentes, o el T-DNAs insertaron en disposición tandem. Las inserciones del tándem Mostrar la longitud del fragmento no aleatoria para uno de los fragmentos de ADN de T (Figura 4A, panel derecho) y pueden ser identificadas comparando el tamaño del fragmento hibridizada con lo que se espera basado en la estrategia de restricción. Una estrategia adicional de Blot puede necesitarse para confirmar el arreglo tándem de las inserciones de T-DNA. En el ejemplo mostrado en la línea 4 (figura 7B, C), dos inserciones se arreglan en una orientación invertida de repetición.

Estimación de la integridad de un T-DNA, o parte de ella, la longitud del fragmento del cruzamiento por hibridación se puede calcula basándose en la estrategia de restricción. Cualquier desviación del tamaño que indica la presencia de una inserción incompleta. Por ejemplo, en la figura 7, en el carril 4, un fragmento de cruzamiento por hibridación migra en 8 kbp, (en lugar de los esperados 5.5 kbp) que indica un tamaño de fragmento mayor debido a la falta de uno de los sitios de restricción.

Vectores de la BIBAC-GW son excelentes herramientas para generar integraciones intactos solo copia en un número de especies de plantas. El protocolo reportado aquí proporciona un procedimiento confiable para identificar plantas con integraciones individuales, intactos de un transgen de interés.

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Disclosures

Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación es apoyada por el holandés tecnología Fundación STW (12385), que forma parte de la organización de países bajos para la investigación científica (NWO), y que en parte es financiado por el Ministerio de economía (OTP Grant 12385 a MS).  Agradecemos a Carol M. Hamilton (Universidad de Cornell, Estados Unidos) para proporcionar la pCH20, la columna vertebral de los vectores de la BIBAC GW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Genética número 133 de vectores binarios BIBAC puerta de enlace compatible binario vector planta de transformación integración individual silenciamiento génico ADN borrar borrar meridional
Generación de plantas transgénicas con inserciones de la solo-copia usando Vector binario BIBAC-GW
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Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

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