Summary

Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

Published: May 04, 2018
doi:

Summary

Infection à Pseudomonas aeruginosa entraîne une morbidité importante chez les hôtes vulnérables. La bibliothèque de mutant d’insertion de transposon non redondante de la souche P. aeruginosa PA14, désignée comme la valeur de PA14NR, facilite l’analyse de la fonctionnalité des gènes dans de nombreux processus. Présenté ici est un protocole de générer des copies de haute qualité de la bibliothèque de mutant PA14NR défini.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable très répandue dans les environnements humains. P. aeruginosa est capable de former des biofilms, développent une résistance aux antibiotiques, produisent des facteurs de virulence et évoluent rapidement dans le cadre d’une infection chronique. Ainsi P. aeruginosa peuvent causer tant aiguës et chroniques, difficiles à traiter les infections, ce qui entraîne une morbidité importante dans certaines populations de patients. Souche P. aeruginosa PA14 est un isolat clinique humain avec une structure conservée du génome qui infecte une variété d’hôtes mammifères et nonvertebrate faisant PA14 une souche attrayante pour l’étude de ce pathogène. En 2006, une bibliothèque de mutants d’insertion transposon non redondante contenant 5 459 mutants correspondant à 4 596 prédit PA14 gènes a été générée. Depuis lors, distribution de la bibliothèque de PA14 a permis à la communauté de la recherche pour mieux comprendre la fonction des gènes individuels et des voies complexes de P. aeruginosa. Préservation de l’intégrité de la bibliothèque à travers le processus de réplication nécessite des techniques NOMPROPRE manutention et précis. À cette fin, ce manuscrit présente les protocoles qui décrivent en détail les étapes impliqués dans la réplication de la bibliothèque, bibliothèque contrôle de la qualité et l’entreposage adéquat des mutants individuels.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable présente dans le sol, l’eau et environnements plus humaines, ainsi que la microflore de la peau. Par rapport à beaucoup d’espèces bactériennes, P. aeruginosa possède un génome relativement important de 5.5-7 Mbp avec G + C haute teneur (65-67 %). En outre, une proportion importante de ses gènes sont impliquée dans l’adaptabilité métabolique et font partie de réseaux de régulation, ce qui permet une grande flexibilité dans la réponse aux stress environnementaux1. P. aeruginosa exprime une multitude de facteurs de virulence, montre la propension à forme biofilms, possède la capacité de coordonner les réponses à travers plusieurs quorum sensing voies et affiche une remarquable capacité de développer une résistance aux antibiotiques et tolérance2,3,4,5,6,7,8. Ces attributs présentent des défis importants pour traiter les infections causées par P. aeruginosa.

Chronique infections à P. aeruginosa peuvent se produire dans de nombreux États de la maladie. Fibrose kystique (FK), une maladie génétique due à une mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , traduit par ailleurs, infectées de sécrétions dans les voies respiratoires, bronchiectasie progressive et, finalement, la mort d’une insuffisance respiratoire9. L’âge adulte, la majorité des patients fibro-kystiques est chroniquement infectée par P. aeruginosa, qui joue un rôle clé dans la morbidité et la mortalité associées à cette maladie10. En outre, les patients souffrant de graves brûlures blessures11, tracheostomies12, prothèses articulaires13ou de cathéters à demeure14 sont à risque d’infection à P. aeruginosa lié à la capacité de la bactérie de forme biofilms et évasion hôte réponses inflammatoires15. De plus, la colonisation se produit sans concurrence après sélection d’une population antibiotique multi résistante ou tolérante au traitement antimicrobien à large spectre, séquentielle,12,16,17 , 18. meilleure compréhension de la pathogenèse de P. aeruginosa aura des implications importantes pour nombreux états pathologiques.

Plusieurs isolats cliniques de P. aeruginosa , y compris les souches PAO1, PA103, PA14 et PAK, ont été largement étudiées afin d’étudier les différentes fonctionnalités de la pathogénèse P. aeruginosa . Souche PA14 est un isolat clinique qui appartienne à l’une des plus courantes dans le monde entier19,groupes clonaux20 et n’a pas été largement repiquée en laboratoire. PA14is hautement virulent chez les vertébrés modèles d’infection, par une endotoxine notable profil21, pili structure22, pathogénicité des Iles23, tapez système de sécrétion III (TTSS), cytotoxicité vers mammalian cells24 et profils de résistance et persistance antibiotique25. En outre, PA14 est également très virulente dans de nombreux systèmes de modèle hôte-pathogène, y compris des feuilles des plantes infiltration modèles26,27,Caenorhabditis elegans infection modèles28, 29, insecte modèles30,31, ainsi que la pneumonie souris modèles32,33 et brûlures modèles34.

Génome mutants bibliothèques sont des collections de mutants isogéniques de gènes non essentiels qui constituent des outils très puissants pour comprendre la biologie de l’organisme en permettant l’analyse de la fonction des gènes à l’échelle génomique. Deux bibliothèques près de saturation transposon insertion mutant construits chez P. aeruginosa sont actuellement disponibles pour distribution. Les sites d’insertion des transposons ont été déterminées pour les deux bibliothèques. Ces dits bibliothèques non redondante facilitent les études de Génome-large de souches bactériennes en diminuant considérablement le temps et de coûts impliqués dans dépistage indéterminées mutants transposon aléatoire. La bibliothèque mutante de transposon PAO1 P. aeruginosa , construite dans le MPAO1 isoler de souche PAO1 utilisant les transposons ISphoA/ hah etlacZ/ hah35, est organisée par le laboratoire Manoil, Université de Washington. La bibliothèque se compose d’une collection de vérifier à la séquence de 9 437 mutants transposon qui fournit une couverture large de génome et inclut deux mutants pour la plupart gènes36. Informations sur la bibliothèque mutante de P. aeruginosa PAO1 transposon sont disponibles sur le site de lab Manoil public, accessible par internet à http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa souche PA14 transposon non redondante insertion bibliothèque mutante (valeur PA14NR) construit en souche PA14 utilisant les transposons MAR2xT7 et TnphoA37 est actuellement distribué par le département de pédiatrie au Massachusetts General Hospital. Le PA14NR Set comprend une collection de plus de 5 800 mutants avec insertions de transposon unique dans des gènes non essentiels37. Détails sur la construction de l’ensemble de la PA14NR sont décrits dans le site public, accessible par internet http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, qui contient également une variété d’outils de recherche en ligne pour faciliter l’utilisation de la PA14NR Ensemble.

L’original PA14NR Set comprend 5 459 mutants, choisis parmi une bibliothèque complète d’environ 34 000 transposon aléatoire mutants d’insertion, qui correspondent aux 4 596 gènes PA14 prédites, ce qui représente 77 % de toutes les prévisions PA14 gènes37. Depuis la construction de la bibliothèque en 2006 les nouveaux mutants ont été ajoutés, et le PA14NR Set comprend actuellement plus de 5 800 mutants38 qui représentent environ 4 600 PA14 gènes. La majorité des mutants transposon PA14 générée dans le type sauvage fond37. Précisions relatives à chaque membre de la bibliothèque mutante, y compris les antécédents génétiques, sont disponibles par le biais de la recherche de la base de données en ligne ou en téléchargeant la feuille de calcul de bibliothèque non redondante, ces deux fonctionnalités disponibles sur le site de PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.CGI). La majorité des mutants ont été créée à l’aide de la MAR2xT7 (MrT7) transposon, avec un petit ensemble créé à l’aide du transposon de TnPhoA (phoA)37. Chaque transposon a une cassette de résistance aux antibiotiques, ce qui permet la sélection de mutants à l’aide de gentamicine (MrT7) ou la kanamycine (phoA). L’ensemble PA14NR de mutants est stocké dans soixante-trois plaques à 96 puits et inclut un contrôle 96 puits supplémentaire deux plaques qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalaient dans un modèle prédéfini. Le format de la plaque à 96 puits couplé avec les outils de recherche en ligne grandement facilite le développement personnalisé de dosages qui permettent aux utilisateurs d’identifier facilement les gènes associés aux phénotypes mutants de dépistage. Les outils de recherche en ligne facilitent également la recherche et la sélection de mutants de pertinents supplémentaires requis pour poursuivre ses études.

Les bibliothèques de mutant de transposon PA14 et PAO1 sont très importantes ressources globales pour la communauté scientifique, et ils complètent mutuellement dans la validation de la fonction des gènes inconnus et les voies de cet bactérie pathogène. Par coïncidence, depuis la construction des bibliothèques de mutation du transposon PAO1 et PA14, analyse de séquençage d’ADN du génome complet de nombreux isolats de P. aeruginosa a montré que PAO1 et PA14 appartiennent à différents sous-clades principaux de la P. aeruginosa phylogénie7,39,40,41. Parce que les isolats cliniques de P. aeruginosa se trouvent répartis tout au long de la phylogenèse, le fait que PAO1 et PA14 appartiennent à différents de P. aeruginosa sous-groupes accroît la valeur des deux bibliothèques transposon mutation pour comparative études.

Les publications décrivant la construction et de criblage des bibliothèques de mutant bactériennes, y compris les bibliothèques P. aeruginosa 35,37,42, sont facilement disponibles dans la littérature. Cependant, au meilleur de notre connaissance, aucun protocoles publiés décrivant les modalités et les techniques utilisées pour la réplication, entretien et la validation des bactéries mutantes bibliothèques existent.

La méthode exposée dans la présente publication décrit un ensemble de trois protocoles qui facilitent l’utilisation et l’entretien de l’ensemble de la PA14NR. Le premier protocole décrit la réplication de la bibliothèque comme recommandé aux bénéficiaires de l’ensemble de la PA14NR. Le deuxième protocole comprend des lignes directrices pour les rayures, de plus en plus et les stocker différents mutants identifiés à l’aide de la valeur de PA14NR. Le troisième protocole décrit les techniques de contrôle de la qualité, y compris amplification par PCR de fragments de mutants de transposons et séquençage subséquent pour confirmer l’identité de mutant. Cet ensemble de protocoles peut être également adapté pour la réplication et l’entretien des autres bactéries mutantes bibliothèques ou des collections. La reproduction des bactéries mutantes bibliothèques ou des collections est vivement conseillée pour préserver l’intégrité de le « original » (copie originale reçue). Réplication de plusieurs copies de l’ensemble des PA14NR de laboratoire de routine minimise la probabilité de contamination interwell de l’original.

Protocol

ATTENTION : Utiliser des mesures de sécurité standards BSL-2 lors de la manipulation de P. aeruginosa, un pathogène humain. Si vous êtes une personne immunodéprimée ou toute condition médicale qui augmente votre susceptibilité à l’infection bactérienne, prendre des précautions spéciales lorsque vous travaillez avec P. aeruginosa. Consulter le Bureau de la biosécurité dans votre établissement et obtenir l’approbation de votre médecin avant d’utiliser le le PA14 NR Set ou bibliothè…

Representative Results

Douze nouvelles copies de l’ensemble de la PA14NR ont été répliqués à l’aide du Protocole I et une évaluation de contrôle de la qualité des nouvelles copies générées a été réalisée à l’aide du Protocole III. PA14NR Set mutants plaques ainsi que des plaques de contrôle, qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalés dans un modèle prédéfini (Figure…

Discussion

Le P. aeruginosa PA14NR est une ressource précieuse pour la communauté scientifique. Selon le dataset mars 2017 de la base des Clarivate Analytique Essential Science Indicators, Liberati et al. (2006) 37, qui décrit la construction de l’ensemble de la PA14NR, est classé dans le top 1 % des publications de la microbiologie. Google Scholar rapporte plus de 600 références de la Liberati et al. (2006) le manuscrit original à partir d’août 2017. La biblio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Lisa Philpotts de la bibliothèque virtuelle de Treadwell MGH pour son orientation dans la recherche de la base de données. Ce travail a été soutenu par la Fondation de la fibrose kystique (YONKER16G0 et HURLEY16G0) et le NIH NIAID (BPH et ADE : R01 A1095338).

Materials

Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels – CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

References

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39 (2017).
  2. Bleves, S., et al. Protein secretion systems in Pseudomonas aeruginosa: A wealth of pathogenic weapons. Int J Med Microbiol. 300 (8), 534-543 (2010).
  3. Breidenstein, E. B., de la Fuente-Nunez, C., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  4. Flynn, K. M., et al. Evolution of ecological diversity in biofilms of Pseudomonas aeruginosa by altered cyclic diguanylate signaling. J Bacteriol. 198 (19), 2608-2618 (2016).
  5. Hazan, R., Maura, D., Que, Y. A., Rahme, L. G. Assessing Pseudomonas aeruginosa persister/antibiotic tolerant cells. Methods Mol Biol. 1149, 699-707 (2014).
  6. Klockgether, J., et al. Genome diversity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 laboratory strains. J Bacteriol. 192 (4), 1113-1121 (2010).
  7. Mathee, K., et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 3100-3105 (2008).
  8. Taylor, P. K., Yeung, A. T., Hancock, R. E. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms: towards the development of novel anti-biofilm therapies. J Biotechnol. 191, 121-130 (2014).
  9. Flume, P. A., Van Devanter, D. R. State of progress in treating cystic fibrosis respiratory disease. BMC Med. 10, 88 (2012).
  10. . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2015 Annual Data Report Available from: https://www.cff.org/Our-Research/CF-Patient-Registry/2015-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2016)
  11. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clin Microbiol Rev. 19 (2), 403-434 (2006).
  12. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S., Christman, J., Prince, A. Pathogen-host interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 171 (11), 1209-1223 (2005).
  13. Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5 (2), 65-71 (2013).
  14. National Nosocomial Infections Surveillance, S. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control. 32 (8), 470-485 (2004).
  15. Cohen, T. S., Parker, D., Prince, A. . Pseudomonas aeruginosa Host Immune Evasion. 7, 3-23 (2014).
  16. Fernandes, A., Dias, M. The microbiological profiles of infected prosthetic implants with an emphasis on the organisms which form biofilms. J Clin Diagn Res. 7 (2), 219-223 (2013).
  17. Khosravi, A. D., Ahmadi, F., Salmanzadeh, S., Dashtbozorg, A., Montazeri, E. A. Study of Bacteria Isolated from Orthopedic Implant Infections and their Antimicrobial Susceptibility Pattern. Res J of Microbiol. 4 (4), 6 (2009).
  18. Roemhild, R., Barbosa, C., Beardmore, R. E., Jansen, G., Schulenburg, H. Temporal variation in antibiotic environments slows down resistance evolution in pathogenic Pseudomonas aeruginosa. Evol Appl. 8 (10), 945-955 (2015).
  19. Fischer, S., et al. Intraclonal genome diversity of the major Pseudomonas aeruginosa clones C and PA14. Environ Microbiol Rep. 8 (2), 227-234 (2016).
  20. Wiehlmann, L., et al. Population structure of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (19), 8101-8106 (2007).
  21. Lam, J. S., Taylor, V. L., Islam, S. T., Hao, Y., Kocincova, D. Genetic and functional diversity of Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide. Front Microbiol. 2, 118 (2011).
  22. Choi, J. Y., et al. Identification of virulence genes in a pathogenic strain of Pseudomonas aeruginosa by representational difference analysis. J Bacteriol. 184 (4), 952-961 (2002).
  23. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  24. Mikkelsen, H., McMullan, R., Filloux, A. The Pseudomonas aeruginosa reference strain PA14 displays increased virulence due to a mutation in ladS. PLoS One. 6 (12), e29113 (2011).
  25. Drenkard, E., Ausubel, F. M. Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature. 416 (6882), 740-743 (2002).
  26. Rahme, L. G., et al. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  27. Rahme, L. G., et al. Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (24), 13245-13250 (1997).
  28. Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1149, 653-669 (2014).
  29. Mahajan-Miklos, S., Tan, M. W., Rahme, L. G., Ausubel, F. M. Molecular mechanisms of bacterial virulence elucidated using a Pseudomonas aeruginosa-Caenorhabditis elegans pathogenesis model. Cell. 96 (1), 47-56 (1999).
  30. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  31. Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect Immun. 71 (5), 2404-2413 (2003).
  32. Coleman, F. T., et al. Hypersusceptibility of cystic fibrosis mice to chronic Pseudomonas aeruginosa oropharyngeal colonization and lung infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1949-1954 (2003).
  33. Pazos, M. A., et al. Pseudomonas aeruginosa ExoU augments neutrophil transepithelial migration. PLoS Pathog. 13 (8), e1006548 (2017).
  34. Maura, D., Hazan, R., Kitao, T., Ballok, A. E., Rahme, L. G. Evidence for direct control of virulence and defense gene circuits by the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator, MvfR. Sci Rep. 6, 34083 (2016).
  35. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  36. Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Bacteriol. 194 (23), 6387-6389 (2012).
  37. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  38. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathog. 8 (7), e1002813 (2012).
  39. Stewart, L., et al. Draft genomes of 12 host-adapted and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and their positions in the core genome phylogeny. Pathog Dis. 71 (1), 20-25 (2014).
  40. Thrane, S. W., et al. The widespread multidrug-resistant serotype O12 Pseudomonas aeruginosa clone emerged through concomitant horizontal transfer of serotype antigen and antibiotic resistance gene clusters. MBio. 6 (5), e01396-e01315 (2015).
  41. van Belkum, A., et al. Phylogenetic Distribution of CRISPR-Cas Systems in Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa. MBio. 6 (6), e01796-e01715 (2015).
  42. Lewenza, S., et al. Construction of a mini-Tn5-luxCDABE mutant library in Pseudomonas aeruginosa PAO1: a tool for identifying differentially regulated genes. Genome Res. 15 (4), 583-589 (2005).
  43. . . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
  44. Breidenstein, E. B., Khaira, B. K., Wiegand, I., Overhage, J., Hancock, R. E. Complex ciprofloxacin resistome revealed by screening a Pseudomonas aeruginosa mutant library for altered susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4486-4491 (2008).
  45. Musken, M., Di Fiore, S., Dotsch, A., Fischer, R., Haussler, S. Genetic determinants of Pseudomonas aeruginosa biofilm establishment. Microbiology. 156 (Pt 2), 431-441 (2010).
  46. Schurek, K. N., et al. Novel genetic determinants of low-level aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 52 (12), 4213-4219 (2008).
  47. Oumeraci, T., et al. Comprehensive MALDI-TOF biotyping of the non-redundant Harvard Pseudomonas aeruginosa PA14 transposon insertion mutant library. PLoS One. 10 (2), e0117144 (2015).
  48. Yeung, A. T., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. J Bacteriol. 191 (18), 5592-5602 (2009).

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Drenkard, E., Hibbler, R. M., Gutu, D. A., Eaton, A. D., Silverio, A. L., Ausubel, F. M., Hurley, B. P., Yonker, L. M. Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants. J. Vis. Exp. (135), e57298, doi:10.3791/57298 (2018).

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