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Immunology and Infection

Réplication de l’ordonné, bibliothèque non redondante de la souche Pseudomonas aeruginosa PA14 Transposon Mutants d’Insertion

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57298
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 2,3, 1,4, 1,4
1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Infection à Pseudomonas aeruginosa entraîne une morbidité importante chez les hôtes vulnérables. La bibliothèque de mutant d’insertion de transposon non redondante de la souche P. aeruginosa PA14, désignée comme la valeur de PA14NR, facilite l’analyse de la fonctionnalité des gènes dans de nombreux processus. Présenté ici est un protocole de générer des copies de haute qualité de la bibliothèque de mutant PA14NR défini.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable très répandue dans les environnements humains. P. aeruginosa est capable de former des biofilms, développent une résistance aux antibiotiques, produisent des facteurs de virulence et évoluent rapidement dans le cadre d’une infection chronique. Ainsi P. aeruginosa peuvent causer tant aiguës et chroniques, difficiles à traiter les infections, ce qui entraîne une morbidité importante dans certaines populations de patients. Souche P. aeruginosa PA14 est un isolat clinique humain avec une structure conservée du génome qui infecte une variété d’hôtes mammifères et nonvertebrate faisant PA14 une souche attrayante pour l’étude de ce pathogène. En 2006, une bibliothèque de mutants d’insertion transposon non redondante contenant 5 459 mutants correspondant à 4 596 prédit PA14 gènes a été générée. Depuis lors, distribution de la bibliothèque de PA14 a permis à la communauté de la recherche pour mieux comprendre la fonction des gènes individuels et des voies complexes de P. aeruginosa. Préservation de l’intégrité de la bibliothèque à travers le processus de réplication nécessite des techniques NOMPROPRE manutention et précis. À cette fin, ce manuscrit présente les protocoles qui décrivent en détail les étapes impliqués dans la réplication de la bibliothèque, bibliothèque contrôle de la qualité et l’entreposage adéquat des mutants individuels.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram-négative plan phénotypique et génotypique diversifiée et adaptable présente dans le sol, l’eau et environnements plus humaines, ainsi que la microflore de la peau. Par rapport à beaucoup d’espèces bactériennes, P. aeruginosa possède un génome relativement important de 5.5-7 Mbp avec G + C haute teneur (65-67 %). En outre, une proportion importante de ses gènes sont impliquée dans l’adaptabilité métabolique et font partie de réseaux de régulation, ce qui permet une grande flexibilité dans la réponse aux stress environnementaux1. P. aeruginosa exprime une multitude de facteurs de virulence, montre la propension à forme biofilms, possède la capacité de coordonner les réponses à travers plusieurs quorum sensing voies et affiche une remarquable capacité de développer une résistance aux antibiotiques et tolérance2,3,4,5,6,7,8. Ces attributs présentent des défis importants pour traiter les infections causées par P. aeruginosa.

Chronique infections à P. aeruginosa peuvent se produire dans de nombreux États de la maladie. Fibrose kystique (FK), une maladie génétique due à une mutation du gène Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) , traduit par ailleurs, infectées de sécrétions dans les voies respiratoires, bronchiectasie progressive et, finalement, la mort d’une insuffisance respiratoire9. L’âge adulte, la majorité des patients fibro-kystiques est chroniquement infectée par P. aeruginosa, qui joue un rôle clé dans la morbidité et la mortalité associées à cette maladie10. En outre, les patients souffrant de graves brûlures blessures11, tracheostomies12, prothèses articulaires13ou de cathéters à demeure14 sont à risque d’infection à P. aeruginosa lié à la capacité de la bactérie de forme biofilms et évasion hôte réponses inflammatoires15. De plus, la colonisation se produit sans concurrence après sélection d’une population antibiotique multi résistante ou tolérante au traitement antimicrobien à large spectre, séquentielle,12,16,17 , 18. meilleure compréhension de la pathogenèse de P. aeruginosa aura des implications importantes pour nombreux états pathologiques.

Plusieurs isolats cliniques de P. aeruginosa , y compris les souches PAO1, PA103, PA14 et PAK, ont été largement étudiées afin d’étudier les différentes fonctionnalités de la pathogénèse P. aeruginosa . Souche PA14 est un isolat clinique qui appartienne à l’une des plus courantes dans le monde entier19,groupes clonaux20 et n’a pas été largement repiquée en laboratoire. PA14is hautement virulent chez les vertébrés modèles d’infection, par une endotoxine notable profil21, pili structure22, pathogénicité des Iles23, tapez système de sécrétion III (TTSS), cytotoxicité vers mammalian cells24 et profils de résistance et persistance antibiotique25. En outre, PA14 est également très virulente dans de nombreux systèmes de modèle hôte-pathogène, y compris des feuilles des plantes infiltration modèles26,27,Caenorhabditis elegans infection modèles28, 29, insecte modèles30,31, ainsi que la pneumonie souris modèles32,33 et brûlures modèles34.

Génome mutants bibliothèques sont des collections de mutants isogéniques de gènes non essentiels qui constituent des outils très puissants pour comprendre la biologie de l’organisme en permettant l’analyse de la fonction des gènes à l’échelle génomique. Deux bibliothèques près de saturation transposon insertion mutant construits chez P. aeruginosa sont actuellement disponibles pour distribution. Les sites d’insertion des transposons ont été déterminées pour les deux bibliothèques. Ces dits bibliothèques non redondante facilitent les études de Génome-large de souches bactériennes en diminuant considérablement le temps et de coûts impliqués dans dépistage indéterminées mutants transposon aléatoire. La bibliothèque mutante de transposon PAO1 P. aeruginosa , construite dans le MPAO1 isoler de souche PAO1 utilisant les transposons ISphoA/ hah etlacZ/ hah35, est organisée par le laboratoire Manoil, Université de Washington. La bibliothèque se compose d’une collection de vérifier à la séquence de 9 437 mutants transposon qui fournit une couverture large de génome et inclut deux mutants pour la plupart gènes36. Informations sur la bibliothèque mutante de P. aeruginosa PAO1 transposon sont disponibles sur le site de lab Manoil public, accessible par internet à http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. P. aeruginosa souche PA14 transposon non redondante insertion bibliothèque mutante (valeur PA14NR) construit en souche PA14 utilisant les transposons MAR2xT7 et TnphoA37 est actuellement distribué par le département de pédiatrie au Massachusetts General Hospital. Le PA14NR Set comprend une collection de plus de 5 800 mutants avec insertions de transposon unique dans des gènes non essentiels37. Détails sur la construction de l’ensemble de la PA14NR sont décrits dans le site public, accessible par internet http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, qui contient également une variété d’outils de recherche en ligne pour faciliter l’utilisation de la PA14NR Ensemble.

L’original PA14NR Set comprend 5 459 mutants, choisis parmi une bibliothèque complète d’environ 34 000 transposon aléatoire mutants d’insertion, qui correspondent aux 4 596 gènes PA14 prédites, ce qui représente 77 % de toutes les prévisions PA14 gènes37. Depuis la construction de la bibliothèque en 2006 les nouveaux mutants ont été ajoutés, et le PA14NR Set comprend actuellement plus de 5 800 mutants38 qui représentent environ 4 600 PA14 gènes. La majorité des mutants transposon PA14 générée dans le type sauvage fond37. Précisions relatives à chaque membre de la bibliothèque mutante, y compris les antécédents génétiques, sont disponibles par le biais de la recherche de la base de données en ligne ou en téléchargeant la feuille de calcul de bibliothèque non redondante, ces deux fonctionnalités disponibles sur le site de PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.CGI). La majorité des mutants ont été créée à l’aide de la MAR2xT7 (MrT7) transposon, avec un petit ensemble créé à l’aide du transposon de TnPhoA (phoA)37. Chaque transposon a une cassette de résistance aux antibiotiques, ce qui permet la sélection de mutants à l’aide de gentamicine (MrT7) ou la kanamycine (phoA). L’ensemble PA14NR de mutants est stocké dans soixante-trois plaques à 96 puits et inclut un contrôle 96 puits supplémentaire deux plaques qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalaient dans un modèle prédéfini. Le format de la plaque à 96 puits couplé avec les outils de recherche en ligne grandement facilite le développement personnalisé de dosages qui permettent aux utilisateurs d’identifier facilement les gènes associés aux phénotypes mutants de dépistage. Les outils de recherche en ligne facilitent également la recherche et la sélection de mutants de pertinents supplémentaires requis pour poursuivre ses études.

Les bibliothèques de mutant de transposon PA14 et PAO1 sont très importantes ressources globales pour la communauté scientifique, et ils complètent mutuellement dans la validation de la fonction des gènes inconnus et les voies de cet bactérie pathogène. Par coïncidence, depuis la construction des bibliothèques de mutation du transposon PAO1 et PA14, analyse de séquençage d’ADN du génome complet de nombreux isolats de P. aeruginosa a montré que PAO1 et PA14 appartiennent à différents sous-clades principaux de la P. aeruginosa phylogénie7,39,40,41. Parce que les isolats cliniques de P. aeruginosa se trouvent répartis tout au long de la phylogenèse, le fait que PAO1 et PA14 appartiennent à différents de P. aeruginosa sous-groupes accroît la valeur des deux bibliothèques transposon mutation pour comparative études.

Les publications décrivant la construction et de criblage des bibliothèques de mutant bactériennes, y compris les bibliothèques P. aeruginosa 35,37,42, sont facilement disponibles dans la littérature. Cependant, au meilleur de notre connaissance, aucun protocoles publiés décrivant les modalités et les techniques utilisées pour la réplication, entretien et la validation des bactéries mutantes bibliothèques existent.

La méthode exposée dans la présente publication décrit un ensemble de trois protocoles qui facilitent l’utilisation et l’entretien de l’ensemble de la PA14NR. Le premier protocole décrit la réplication de la bibliothèque comme recommandé aux bénéficiaires de l’ensemble de la PA14NR. Le deuxième protocole comprend des lignes directrices pour les rayures, de plus en plus et les stocker différents mutants identifiés à l’aide de la valeur de PA14NR. Le troisième protocole décrit les techniques de contrôle de la qualité, y compris amplification par PCR de fragments de mutants de transposons et séquençage subséquent pour confirmer l’identité de mutant. Cet ensemble de protocoles peut être également adapté pour la réplication et l’entretien des autres bactéries mutantes bibliothèques ou des collections. La reproduction des bactéries mutantes bibliothèques ou des collections est vivement conseillée pour préserver l’intégrité de le « original » (copie originale reçue). Réplication de plusieurs copies de l’ensemble des PA14NR de laboratoire de routine minimise la probabilité de contamination interwell de l’original.

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Protocol

ATTENTION : Utiliser des mesures de sécurité standards BSL-2 lors de la manipulation de P. aeruginosa, un pathogène humain. Si vous êtes une personne immunodéprimée ou toute condition médicale qui augmente votre susceptibilité à l’infection bactérienne, prendre des précautions spéciales lorsque vous travaillez avec P. aeruginosa. Consulter le Bureau de la biosécurité dans votre établissement et obtenir l’approbation de votre médecin avant d’utiliser le le PA14 NR Set ou bibliothèques mutants de bactéries pathogènes.

Figure 1
Figure 1 : aperçu du protocole i : réplication de le PA14NR. Jour 1 : Répliquer des cultures mutantes congelées de « copie principale » de la valeur de PA14NR dans LB gélosé et cultiver des mutants pendant une nuit à 37 ° C. Jour 2 : Transfert en croissance mutante de LB gélosé à bien les blocs épais contenant le bouillon liquide LB, poussent en une nuit à 37 ° C sous agitation à 950 tr/min. Jour 3 : Mélanger une nuit LB cultures avec le glycérol, puis transférez-les vers des plaques de 96 puits destination pour le stockage à long terme. 96 place plats plat dans le congélateur-80 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : recommandé installation. Stérilité et workflow lisse doivent être maintenus grâce à l’utilisation des précautions appropriées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

1. le protocole i : réplication de le PA14NR définir

Remarque : La réplication de la bibliothèque est possible en divisant la valeur PA14NR en quatre sous-ensembles de seize assiettes qui peuvent être traitées dans les quatre semaines consécutives. Génération de 1 à 6 copies adhère au flux de travail hebdomadaire décrite dans le tableau 1, alors que la génération de plus de 6 copies suit le flux de travail hebdomadaire, décrite dans le tableau 2. Pour générer des 12 exemplaires de l’ensemble de la PA14NR, ensemencer le même sous-ensemble de PA14NR dans un milieu LB liquide le jour 2 et encore une fois sur 3 jours (à partir de la même série de boîtes de gélose répliquées sur 1 jour) et le transfert pendant la nuit cultures mutantes en plaques copie sur jour 3 et jour 4 respectivement.

Jour 0 Jour 1 Jour 2 Jour 3
Journée de préparation Croissance de mutants PA14NR défini sur milieux gélosés LB Croissance de mutants PA14NR mis dans un milieu liquide LB Transfert de PA14NR la valeur des cultures mutantes aux plaques de destination

Tableau 1 : calendrier de réplication de 1-6 exemplaires du jeu de PA14NR de. Réplication d’un petit nombre de copies peut adhérer à un flux de travail hebdomadaire.

Jour 0 Jour 1 Jour 2 Jour 3 Jour 4
Journée de préparation Croissance de mutants PA14NR défini sur gélose LB Cultiver des mutants PA14NR mis dans un milieu liquide LB Transfert du jour 3 cultures mutantes pour générer le 1er set de 6 exemplaires de PA14NR Set Transfert du jour 4 cultures mutantes pour générer le 2ème set de 6 exemplaires de PA14NR Set
Croissance de mutants PA14NR mis dans un milieu liquide LB

Tableau 2 : calendrier de réplication jusqu'à 12 exemplaires du jeu de PA14NR de. Réplication d’un plus grand nombre de copies exigera la superposition dans un flux de travail hebdomadaire.

  1. Jour 1 : Croissance de PA14NR Set Master copie sur plaques de gélose LB
    1. Porter des gants, blouse et masque pour gérer l’ensemble de la PA14NR.
    2. Désactivez le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %.
    3. Préparer LB agar médias43 et stériliser en autoclave pour 25 min. Cool media à 55 ° C dans l’eau de bain et ajoute soit gentamicine 15 µg/mL, pour des mutants contenant des insertions du transposon MAR2xT7 , ou 200 µg/mL kanamycine, mutants contenant TnphoA insertions.
    4. Versez fondu LB agar en plaques rectangulaires à l’aide d’environ 60 mL de médias par plaque. Plaques sèches dans une hotte stérile pendant environ 1 h avant utilisent. Assurez-vous qu’il n’y a aucune condensation d’eau sur la surface de la gélose. Stocker les plaques à 4 ° C, si nécessaire.
    5. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen sur paillasse éthanol essuyé et mis en place des conteneurs avec des solutions adaptées pour la stérilisation de broche replicator (voir étape 1.1.9). Cliquez sur Ouvrir les contenants en plastique (5,25" L x 4.25" W x 1.75 « H taille approximative) pour la stérilisation de broche de replicator. Contenants de plastique autoclave avant utilisation.
      Remarque : La chaleur de la flamme du bec Bunsen crée une convection current, qui chauffe l’espace au-dessus de la flamme et soulève des particules dans l’air vers le haut et loin de l’air frais dessous, gardant la zone de travail stérile.
    6. Enlever un maximum de quatre plaques de maître PA14NR Set du congélateur-80 ° C (pour éviter la décongélation inutile) et placez-les sur la glace sèche dans la plaque de glace de 4 L.
    7. Prendre la plaque 96 puits maître à être répliqués de glace sèche et placez-le sur le banc pour permettre le dégel brève, qui ne prendra le temps nécessaire pour la stérilisation des broches replicator (environ 3-4 min) (voir étape 1.1.8). Marquer la position de la coordination de l’A1 sur la gélose avant emboutissage. Aligner le plat principal et gélose avec la coordonnée A1 des deux plaques dans le coin supérieur gauche.
    8. Stériliser le réplicateur « pins » en suivant les étapes décrites ci-dessous. Tapoter légèrement replicator après chaque étape pour enlever l’excès de liquide.
      1. Immerger les épingles dans 250 mL de 0,3 à 0,5 % d’hypochlorite de sodium (eau de Javel domestique 10 %) pendant 30 secondes. Minimiser le contact avec une solution d’hypochlorite de sodium, car elle peut conduire à endommager des goupilles. Immerger les épingles dans 250 mL stérile ddH2O ou l’eau ultrapure stérile pendant 10 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 95 % pendant 2 min.
      2. Flamme stériliser épingles replicator en tenant replicator perpendiculairement à la flamme du bec Bunsen, approchant lentement flamme jusqu'à ce que l’éthanol s’enflamme, puis retirer immédiatement de la flamme. Flamme s’éteint une fois tous les brûlures de l’éthanol hors. Gardez un couvercle ou un autre récipient étroit par étouffer la combustion d’éthanol, si nécessaire.
        NOTE : Soyez extrêmement prudent lorsque vous travaillez avec de l’éthanol près d’une flamme. NE tenez pas le réplicateur directement sur la flamme.
      3. Cool épingles en épinglant sur un plat rectangulaire stérile inutilisé, contenant LB gélosé pendant 30 secondes.
    9. Brièvement aluminium chaud flasque du maître PA14NR définir avec votre main avant il décolle. Cela, en refroidissant les goupilles de replicator. Enlever le joint en aluminium avec précaution pour éviter le joint de la plaque de retouche. Pince à épiler permet d’enlever des restes de joint en aluminium.
    10. Insérer dans plat principal, en poussant doucement et replicator se balançant dans les quatre directions pour faire en sorte que broches replicator pivots de contact avec les cultures bactériennes congelées dans chacun des puits-96. Prêter une attention particulière aux puits situé sur le bord extérieur de la plaque en poussant les épingles replicator contre cultures congelées dans les puits situés au bord de la plaque.
    11. Placez délicatement les épingles replicator sur la surface de la gélose. Déplacez replicator dans un léger mouvement circulaire de forme mini-pelouses d’environ 4-5 mm pour chaque souche mutante. Éviter la possibilité que les mini-pelouses peuvent se chevaucher, afin d’éviter la contamination croisée.
    12. Joint plat principal PA14NR la valeur avec un nouveau joint d’aluminium stérile. Ne pas toucher le côté adhésif aluminium joint un point quelconque de l’autre pour éviter la contamination. Assurez-vous que chaque puits et les bords des plaques sont hermétiquement à l’aide d’un rouleau de plat. Plaque de retour 96 puits à glace sèche.
    13. Répéter pour chaque plat principal.
    14. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après la manipulation de l’ensemble de la PA14NR.
    15. Transfert des géloses répliqué à 37 ° C incubateur et incuber pendant la nuit.
  2. Jour 2 : Croissance de la copie maître de la valeur de PA14NR dans un bouillon liquide LB
    1. Préparer de liquide bouillon LB43 contenant soit gentamicine 15 µg/mL, pour des mutants contenant des insertions du transposon MAR2xT7 , ou 200 µg/mL kanamycine, mutants contenant des insertionsphoA Tn.
    2. Effacer la hotte à flux laminaire du matériel inutile et allumez le ventilateur de la hotte pendant au moins 10 min avant de commencer le travail. Essuyer les surfaces de la hotte et tous les produits dans la hotte à l’aide d’éthanol à 70 %.
    3. Remplir les blocs de puits profonds de 2 mL avec 525 µL de bouillon liquid LB contenant des antibiotiques appropriés sous hotte à flux laminaire à l’aide d’une pipette électronique de 12 canaux µL 50-1200. Puis, transfert en blocs de puits profonds remplis de médias à paillasse essuyé l’éthanol. Réutiliser les conseils tant que les conditions stériles sont maintenues.
    4. Porter des gants, blouse et masque pour gérer la valeur PA14NR.
    5. Désactivez le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %.
    6. Apporter des boîtes de gélose avec des souches mutantes cultivées pendant la nuit à paillasse.
    7. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen sur paillasse éthanol essuyé et mis en place des conteneurs avec des solutions adaptées pour la stérilisation de broche replicator (voir étape suivante).
    8. Stériliser les replicator « broches » suivant les étapes décrites ci-dessous. Tapoter légèrement replicator après chaque immersion pour enlever l’excès de liquide.
      1. Immerger les épingles dans 250 mL de 0,3 à 0,5 % d’hypochlorite de sodium pendant 30 secondes. Minimiser le contact mâle réplicateur avec une solution d’hypochlorite de sodium, car elle peut conduire à endommager des goupilles. Ensuite, plonger épingles dans 250 mL stérile ddH2O ou eau ultrapure pendant 10 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 70 % pendant 30 secondes, puis dans 250 mL d’éthanol à 95 % pendant 2 min.
      2. Flamme stériliser épingles replicator, puis cool épingles en épinglant dans inutilisés plaque rectangulaire contenant LB gélosé pendant 30 secondes.
        Remarque : Faire extrêmement attention lorsque vous travaillez avec de l’éthanol près d’une flamme (voir 1.1.8).
    9. Doucement placer des épingles replicator sur gélose contenant croissance mutante et vérifiez que les broches sont en contact avec tous les 96 mutants sur gélose, puis submerger les épingles dans des puits profonds contenant le bouillon liquide LB. Évitez de toucher les parois du puits avec les broches.
    10. Sceller le puits profond bloc avec une membrane d’étanchéité perméable à l’air stérile. Utiliser un rouleau de plat pour s’assurer que chaque individu est bien correctement scellé.
    11. Répéter pour chaque plat d’agar.
    12. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après la manipulation de l’ensemble de la PA14NR.
    13. Croître inoculés cultures liquides pour les 15-16 h à 37° C à 950 tr/mn à l’aide d’un agitateur de haute vitesse, si elles sont disponibles.
      Remarque : Si un shaker haute vitesse n’est pas disponible, l’incubation des blocs de puits profonds dans shaker à 250-300 tr/min est faisable. Cependant, il y a plus de chances de petite colonie variantes (VCS)25 émergents dans des conditions de faible oxygénation. Par conséquent, il est fortement recommandé de garder l’incubation fois sous 15-16 h en cultivant des cultures dans des puits profonds blocs à basse vitesse de l’agitateur. Prolifération indésirable des VCS en mutants puits peut altérer les phénotypes mutants lors de l’utilisation de la bibliothèque pour exécuter des écrans génétiques.
      Certains puits dans le jeu de la PA14NR contiennent des mutants en croissance/non-croissance lente, manquant de clones, ou contenant des médias non inoculés. L’emplacement de ces puits a été enregistré et peut être trouvé dans le fichier de PA14NR Set puits des informations complémentaires accompagnant cette publication.
  3. Jour 3 : Transfert de PA14NR la valeur des cultures durant la nuit en plaques de destination
    1. Effacer la hotte à flux laminaire et allumez le ventilateur de la hotte pendant au moins 10 min avant de commencer le travail. Essuyer les surfaces de la hotte et tous les produits dans la hotte à l’aide d’éthanol à 70 %.
    2. Imprimer des étiquettes adhésifs imperméable à l’eau (voir fiche supplémentaire PA14NR Set étiquettes pour modèle). Supprimer 96 plats en plastique enrouler à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Plaque de décoller l’étiquette et le placer en bordure de la plaque plus proche de l’A1 à H1 puits de la plaque de destination. Un peu soulever le couvercle de la plaque de destination et placer l’étiquette sur le bord inférieur pour afficher l’étiquette lorsque la plaque est recouverte d’un couvercle.
    3. 3,5 L de 60 % de glycérol (v/v) de préparer et stériliser 20 min en autoclave.
    4. Porter des gants, blouse et masque pour gérer l’ensemble de la PA14NR. Blocs de puits profonds prélever sur shaker haute vitesse ou secouage régulier.
    5. Transfert de blocs de puits profonds à hotte stérile à flux laminaire et retirez soigneusement la membrane d’étanchéité respirante. Remplacer avec le joint en aluminium. Spin-down les blocs de puits profonds à très basse vitesse pour recueillir la condensation (30 secondes à 50-150 g, puis décélérer rapidement par la présence de frein centrifuge sur).
    6. Transférer des blocs de puits profonds à hotte stérile et à l’aide d’une pipette électronique de 12 canaux µL 50-1200 et stériles filtrées conseils ajouter 525 µL du mélange de bouillon liquide de glycérol/LB (parts égales LB liquide bouillon et 60 % solution de glycérol) dans chaque puits. La composition de pipetage doucement 300 µL monter et descendre 3 fois avec pipette Electronique. Contact conseils à côté du puits avant d’éjecter les conseils pour éviter les gouttes. Conseils d’éjection et continuer avec la ligne suivante jusqu'à ce que fait avec le bloc entier de puits profonds.
    7. À l’aide de la pipette électronique à répétition 12 canaux avec embouts filtré, pour éviter la contamination interwell pendant aliquotage, tirer 900 µL de culture mutante et distribuer 150 µL dans chaque plaques 96 puits destination de générer 6 exemplaires de la plaque de la bibliothèque. Empêcher les gouttes en touchant la paroi du puits avec des conseils avant de commencer le transfert de la culture en plaques de destination. Si aucune répétition pipette n’est disponible, utiliser une pipette multicanaux pour distribuer 150 µL dans chacune des six plaques 96 puits, en utilisant la technique décrite ci-dessus pour éviter les gouttes.
    8. Joints en aluminium stérile permet de recouvrir les plaques et utilisez un rouleau plaque complètement joint plaque bords et tous les puits. Veillez à ne pas couvrir l’identificateur d’étiquette avec le joint d’étanchéité en aluminium. Ne secouez pas les plaques, que la culture peut éclabousser sur les côtés des puits ou sur le joint en aluminium.
    9. Enlever les plaques scellées de plaques hotte et place sur un plat, surface plane dans le congélateur à-80 ° C.
    10. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après avoir manipulé de la bibliothèque.
    11. Effectuer les contrôles de qualité après la réplication de la bibliothèque et après l’utilisation de la bibliothèque pour exécuter des écrans génétiques (voir Protocole III).

2. le Protocole II : Manutention et entreposage des Mutants individuels de l’ensemble PA14NR

  1. Jour 1 : Mutant Streak d’intérêt
    1. Identifier l’emplacement du mutant d’intérêt par le biais de la http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS lien PA14NR Set ou en utilisant le fichier Library.xls non redondante téléchargé depuis le lien http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/downloads.CGI). Prenez note de l’antibiotique nécessaire pour sélectionner chaque mutant particulière (gentamicine ou kanamycine).
    2. Préparer les milieux gélosés LB, stériliser en autoclave pendant 20 à 25 minutes et refroidir à 55 ° C au bain-marie. Ajouter 15 gentamicine µg/mL pour les mutants contenant des insertions du transposon MAR2xT7 et 200 µg/mL kanamycine mutants contenant des insertions de transposon TnphoA . Versez les milieux gélosés LB sur plaques (plaques rondes ou rectangulaires sont suffisants). Plaques sèches sous hotte stérile pendant environ 30 min à 1 h avant utilisent.
    3. Stériliser tous les ustensiles en plastique et des fournitures non stérile avant utilisation.
    4. Porter des gants, blouse et masque pour gérer l’ensemble de la PA14NR. Effacer le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 % avant de travailler avec le jeu de PA14NR.
    5. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen.
    6. Enlever la plaque à 96 puits PA14NR Set avec mutant d’intérêt du congélateur-80 ° C et placez-le sur la glace sèche, prenez le récipient de glace sèche sur le banc et placer brièvement plaque à 96 puits sur le dessus de banc pour permettre un léger dégel (environ 1-2 min).
      NOTE : Conserver un enregistrement de toutes les plaques à 96 puits PA14NR Set accédé à des mutants individuels strie, car plus d’accès aux plaques de bibliothèque est corrélé à un risque accru de contamination interwell.
    7. Aluminium chaud joint avec la main avant décolle, en prenant soin d’éviter le sceau de retouche la plaque. Pince à épiler permet d’enlever des restes de joint en aluminium.
    8. Repérez le mutant d’intérêt sur la plaque à 96 puits. Utiliser une baguette en bois stérile ou pipette stérile pour prendre une petite quantité de culture congelée de l’individu cupule contenant le mutant d’intérêt.
    9. Strie congelé culture sur gélose de colonies mutantes unique comme suit : délicatement étalées les bactéries sur une section de la plaque pour créer strie 1, à l’aide d’une pointe en bois frais, stérile en bâton ou d’une pipette, faites glisser par le biais de strie 1 et étaler les bactéries sur une deuxième partie de la plaque, pour créer la séquence 2. À l’aide d’une troisième pointe stérile de bâton ou d’une pipette en bois, faites glisser par le biais de strie 2 et transmettre la bactérie au cours de la dernière section de la plaque, pour créer la séquence 3.
    10. Flasque de source avec un nouveau joint d’aluminium stérile. Ne pas toucher le côté adhésif aluminium joint un point quelconque de l’autre pour éviter la contamination. Assurez-vous que chaque puits et les bords de la plaque sont hermétiquement à l’aide d’un rouleau de plat. Plaque de retour 96 puits à neige carbonique et ensuite au congélateur à-80 ° C.
    11. Incuber la gélose dans incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
    12. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après avoir manipulé de la bibliothèque.
  2. Jour 2 : Croissance du mutant d’intérêt dans un bouillon liquide LB
    1. Préparation liquide LB bouillon contenant 15 µg/mL gentamicine ou 200 kanamycine µg/mL, selon les directives de l’insertion de transposon.
    2. Porter des gants, blouse et masque pour gérer de P. aeruginosa.
    3. Désactivez le banc et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %. Créer un champ stérile avec un bec Bunsen.
    4. Transfert de 3 à 5 mL de bouillon LB avec l’antibiotique approprié dans tube à culture stérile avec capuchon.
    5. À l’aide d’un applicateur stérile ou un embout de la pipette stérile, prélever une colonie unique de souche mutante et il ensemencer LB médias.
    6. Incuber les cultures en milieu liquide LB à 37 ° C dans un agitateur à 225-250 tr/min jusqu’au lendemain.
    7. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après avoir manipulé de P. aeruginosa.
  3. Jour 3 : Magasin mutant d’intérêt dans le congélateur-80 ° C
    1. Cryovial étiquette avec le nom de mutant, antibiotiques ajoutés au bouillon LB et date du stockage.
    2. Préparer 500 mL de 50 % (v/v) de glycérol et stériliser en autoclave.
    3. Porter des gants, blouse et masque pour gérer de P. aeruginosa.
    4. Banc de claire et/ou flot laminaire hotte et essuyez la surface avec l’éthanol à 70 %.
    5. Retirez le tube contenant la culture mutante de shaker.
    6. Préparer un petit récipient avec la glace sèche.
    7. Utiliser une hotte à flux laminaire ou créer un champ stérile sur paillasse éthanol essuyé avec bec Bunsen.
    8. Ajouter une quantité égale de culture bactérienne et 50 % de glycérol à la cryovial étiqueté à l’aide des conditions stériles et mélanger doucement avec la pipette (volume final 1-2 mL/flacon selon la taille de le cryovials utilisé). Place cryovial sur glace sèche à stockez-les.
    9. Placez cryovial dans sa boîte étiquetée au congélateur-80 ° C.
    10. Essuyez toutes les surfaces de travail avec l’éthanol à 70 % après la manipulation de P. aeruginosa.

3. Protocole III : contrôle de la qualité d’ensemble de PA14NR

  1. Sélectionnez un ensemble aléatoire de mutants de plaques nouvellement répliqués pour détecter d’éventuelles contaminations interwell (essai de 30-40 mutants est recommandé).
    Remarque : Dans les cas où il est nécessaire de confirmer l’identité d’un mutant utilisée pour la caractérisation d’un gène spécifique, il est recommandé d’effectuer l’amplification PCR avec des amorces gène-spécifique conçus pour la séquence connue du gène qui contient la insertion de transposon. Bien que plus difficile, les avantages de l’utilisation arbitraire des amorces PCR plutôt que des amorces PCR du gène-spécifique lorsque amplyfing DNA fragments de mutants de transposon incluent la facilité de confirmation mutante à grande échelle et la capacité à détecter la présence du potentiel contaminants. À des fins de contrôle de la qualité, il n’est pas nécessaire obtenir les données de séquençage PCR haute qualité pour tous au hasard des mutants slected, tant qu’un nombre suffisant de mutants est examiné afin d’évaluer le taux d’erreur.
  2. Suivre le « Protocole II » pour ensemencer et de développer des souches mutantes.
  3. Stériliser tous les ustensiles en plastique et des fournitures non stérile avant utilisation.
  4. Isoler l’ADN génomique de la méthode préférée. De l’analyse décrite dans cet ouvrage, un kit d’isolation de l’ADN génomique a été utilisé suivant les protocoles du fabricant. Plusieurs souches mutantes peuvent être analysées en même temps.
  5. Mesurer la concentration d’ADN génomique à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume. Ajuster la concentration d’ADN génomique à environ 100 ng/µL.
  6. Utiliser l’ADN génomique en tant que modèle pour exécuter « Réaction PCR1 » tel que décrit à l’étape 1 du tableau 3, générer des fragments PCR Arb1 (Figure 3). Amorces pour cette étape sont répertoriés dans le tableau 4.
  7. Ajouter 0,5 µL de 10 x chargement tampon à 5 µL de réaction PCR1, charger dans un gel d’agarose de 1,5 à 2 % et exécutez le gel à 80-150 V.
    Remarque : Une longueur de fragment spécifique ou une plage de fragment particulier ne devrait pas, et plus d’une bande peut être présente comme l’amorce arbitraire peut lier à plusieurs emplacements.
  8. Utiliser l’ADN de réaction PCR1 en tant que modèle pour exécuter la « Réaction de PCR2 » tel que décrit à l’étape 2 du tableau 3, générer des fragments PCR Arb2 (Figure 3). Amorces pour cette étape sont répertoriés dans le tableau 4.
  9. Ajouter 0,5 µL de 10 x chargement tampon à 5 µL de la réaction de PCR2, charger dans un gel d’agarose de 1,5 à 2 % et exécutez le gel à 80-150 V.
    Remarque : Une longueur de fragment spécifique ou une plage de fragment particulier ne devrait pas, et plus d’une bande peut être présente comme l’amorce arbitraire peut lier à plusieurs emplacements.
  10. Envoyer la réaction de PCR2 avec amorce de transposon-spécifique approprié pour l’ordonnancement.
  11. Analize byBLASTing résultats de séquençage eux contre le génome complet de PA14 en utilisant le lien BLAST fournis sur le site Web de la bibliothèque PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi) ou par leur dynamitage directement contre la séquence de gènes spécifiques de le mutant d’intérêt.
    NOTE : Informations sur les mutants sélectionnés se trouvent en cherchant sur le site de PA14NR Set (recherche http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS ou télécharger le Library.xls non redondante fichier depuis le lien http:/ / pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi).

Figure 3
Figure 3 : PCR amplification et le séquençage des mutants d’insertion de transposon. Vue schématique des étapes impliquées dans l’amplification par PCR et séquençage pour vérification d’identité mutante. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Installation de réaction PCR
Étape 1 Étape 2
Réaction PCR1 : Réaction de PCr2 :
Eau de 23,25 µL (qualité biologie moléculaire) 19.15 µL eau (qualité biologie moléculaire)
Polymérase de Taq 3µL 10 x tampon 5 µL 10 x tampon Taq polymérase
0.5µl Taq polymérase 0,6 µL Taq polymérase
0,625 µL 20 µM amorce Arb1D (tableau 4) 0,625 µL 20 µM amorce Arb2A (tableau 4)
Amorce de transposon-spécifique de 20 µM 0,625 µL (PMFLGM. 3 GB ou Tn5Ext) (tableau 4) Amorce de 0,625 mL 20 µM Transposon-spécifique (PMFLGM. 2 GB a ou Tn5Int2) (tableau 4)
1 µL 10 mM dNTPs 1 µL 10 mM dNTPs
1 µL d’ADN génomique, 100 ng Réaction PCR1 5 µL
Réactionnel final 30 µL Réactionnel final 30 µL
Paramètres de réaction PCR
PCR1 Thermocycleur Conditions : PCr2 Thermocycleur Conditions:
95 ° C – 2 min 95 ° C – 2 min
Répétez 5 cycles : Répétitivité des cycles de 30 :
95 ° C – 30 s 95 ° C – 30 s
30 ° C – 1 min 54 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min 72 ° C – 1,5 min
Répétitivité des cycles de 30 : 72 ° C – 10 min
95 ° C – 30 s 4 ° C – Hold
45 ° C – 30 s
72 ° C – 1 min
72 ° C – 10 min
4° C – Hold

Tableau 3 : PCR réaction mise en place et thermocycleur conditions utilisées pour PCR arbitraire. Les réactions de PCR arbitraires sont exécutées séquentiellement et fragments obtenus au cours de la réaction PCR1 sont utilisés en tant que modèle dans la réaction de PCR2. Paramètres de thermocycleur spécifiques sont utilisés pour chaque ensemble de réactions.

Nom de l’apprêt Séquence d’amorce
Amorces spécifiques de Transposon MAR2xT7
PMFLGM. GB-3 a TACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM. GB-2 a TGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 Transposon séquençage Primer
PMFLGM. GB-4 a GACCGAGATAGGGTTGAGTG
AMTphoA Transposon propres amorces
Tn5Ext GAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2 GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
AMTphoA Transposon séquençage Primer
Tn5Int CGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
Amorces arbitraires
ARB1D GGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2A GGCCAGGCCTGCAGATGATG

Tableau 4 : liste des amorces utilisées dans le contrôle de la qualité Expériences. Amorces utilisées pour l’amplification par PCR et séquençage des mutants d’insertion de transposon pour confirmer l’identité de mutant.

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Representative Results

Douze nouvelles copies de l’ensemble de la PA14NR ont été répliqués à l’aide du Protocole I et une évaluation de contrôle de la qualité des nouvelles copies générées a été réalisée à l’aide du Protocole III.

PA14NR Set mutants plaques ainsi que des plaques de contrôle, qui se composent de type sauvage PA14 inoculés et non inoculés puits intercalés dans un modèle prédéfini (Figure 4 a), ont été répliqués après la méthodologie décrite dans le protocole I. commande de plaques sont inclus dans l’ensemble de PA14NR pour évaluer la contamination interwell possible lors de l’exécution de la réplication de plaque. En outre, des plaques de contrôle peuvent être utilisé pour la pratique des techniques de réplication avant d’accéder à des boîtes qui contiennent des mutants d’insertion de transposon. Croissance des plaques de contrôle a été visuellement inspectée après la réplication sur plaques de gélose LB et une nuit d’incubation pour s’assurer de la présence des patrons de croissance escomptés (Figure 4 b). Présence ou absence de croissance bactérienne dans les puits profonds blocs inoculés avec 1 plaque de contrôle a été évalué après une nuit d’incubation en lisant OD600 au spectrophotomètre. Les résultats ont montré une croissance substantielle dans le puits de PA14 inoculés de type sauvage et absence totale de croissance dans les puits non inoculés (Figure 4). Bien qu’il n’était pas dans la croissance des cultures PA14 type sauvage, il y avait absence totale de croissance dans les puits non inoculés (Figure 4).

Trente-huit souches mutantes choisis au hasard dans un des exemplaires de la gamme de PA14NR nouvellement créées ont été analysés par séquençage de fragments d’ADN générés par PCR arbitraire. Arbitraires réactions de PCR ont été effectuées afin d’amplifier des fragments d’ADN provenant de régions entourant les insertions du transposon de 38 mutants sélectionnés, et les fragments PCR obtenus ont été séquencés par la suite. Un exemple de fragments PCR obtenus après que amplification par PCR de neuf mutants d’insertion de transposon distincts est montrée dans la Figure 5. Recuit d’amorces arbitraires se produit au hasard, la longueur des fragments ne peut être prédites. Lorsque aucune bande n’était visibles, les réactions de PCR ont été répétées. L’identité des insertions du transposon contenues dans 38 mutants analysés a été trouvée en utilisant le lien PA14 Transposon Insertion Mutant Library (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi) pour sélectionner les apprêts nécessaires à l’exécution arbitraire PCR réactions.

Séquençage des résultats obtenus du mutant 38 souches ont été foudroyées contre le génome complet du lien de souche PA14 utilisant l’explosion fourni sur le site Web de la bibliothèque PA14NR (http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi). Résultats du séquençage des mutants choisis au hasard ont été également alignés contre les séquences du gène correspondant à chaque mutant individuel (obtenue à l’aide de le PA14NR Set plaque recherche outil position trouvé sur la bibliothèque de PA14NR site Web http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Search.cgi?SearchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS). Alignements de séquences ont été réalisées à l’aide de l’outil aligner les séquences nucléotidiques BLAST fournie par NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PAGE = MegaBlast & programme = blastn & BLAST_PROGRAMS = megaBlast & PAGE_TYPE = BlastSearch & BLAST_SPEC = blast2seq & DATABASE = n/a & QUERY = & sujets =).

Deux des 38 mutants sélectionnés résultats de séquence généré de basse qualité, probablement en raison de la forte teneur de GC dans la région contenant l’insertion du transposon et ne pourrait pas être analysée plus loin. Résultats de la séquence de 35 des 36 succesfully séquencé mutants correspondant les séquences des gènes correspondant à des mutants PA14NR la valeur sélectionnée. Seulement un sur les 36 séquences n’a pas correspondre à la séquence du gène correspondant à la mutant sélectionné. Toutefois, il n’était pas établi si cet écart résulte d’un problème survenu lors de la réplication des nouveaux exemplaires du Set PA14NR ou peut être attribué à la 2,8 % un étiquetage erroné d’erreur estimé plus tôt pour la PA14NR la valeur37.

Figure 4
Figure 4 : PA14NR la valeur contrôle plaques. A) vous pouvez définir contrôle plaques 1 et 2 présentation de PA14NR. B) photo de plaques de PA14 NR régler le programmateur 1et 2 répliquées sur gélose LB (vue de dessus de gélose). La croissance des bactéries C) moyenne (+/-SD) mesurée en inoculés et non inoculés puits de la plaque de commande 1 après une nuit d’incubation en bloc bien épais. Lectures ont été effectuées à OD600. D) la croissance bactérienne mesuré dans des puits inoculées et non inoculées de commande plaque 1 après une nuit d’incubation en bloc épais bien. Lectures ont été effectuées à OD600 dans les puits individuels. Même les colonnes correspondent aux mesures effectuées dans les puits non inoculés ; colonnes impaires correspondent aux mesures effectuées dans les puits PA14 inoculés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : PCR1 et PCR2 les fragments provenant de réactions d’amplification. Exemple de fragments obtenus à l’aide de réactions d’amplification PCR arbitraire. Des fragments dans les voies 1 à 9 correspondent aux différents mutants sélectionnés au hasard pour effectuer des contrôles de qualité de PA14NR Set répliqué plaques. MWM : Marqueur de poids moléculaire de l’ADN. MWM ADN tailles sont en paires de bases.
PA14NR Set de souches mutantes testé : Lane 1 : 07_4 A10, voie 2 : 07_4 B4, piste 3 : 08_1 C3, piste 4 : 08_1 H6, voie 5 : 08_3 G10, voie 6 : 08_4 B8, voie 7 : 08_4 H3, voie 8 : 09_2 D12, piste 9 : 09_2 G5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le P. aeruginosa PA14NR est une ressource précieuse pour la communauté scientifique. Selon le dataset mars 2017 de la base des Clarivate Analytique Essential Science Indicators, Liberati et al. (2006) 37, qui décrit la construction de l’ensemble de la PA14NR, est classé dans le top 1 % des publications de la microbiologie. Google Scholar rapporte plus de 600 références de la Liberati et al. (2006) le manuscrit original à partir d’août 2017. La bibliothèque a joué un rôle important pour élucider les mécanismes qui sous-tendent la pathogénie P. aeruginosa . Ce qui est important, le format de la plaque à 96 puits du PA14NR Set facilite écrans génétiques à haut rendement conçus pour étudier les diverses P. aeruginosa phénotypes mutants44,45,46. Le Set de PA14NR sont disponible pour la distribution, des précautions spéciales doivent servir à préserver l’intégrité de cette ressource.

Un certain nombre de publications démontre l’utilité d’utiliser le Set de PA14NR génétiques écrans37,38,47,,48. Par exemple, comme un premier test de l’utilitaire de la bibliothèque, Liberati et coll. a réalisé un écran de fixation PVC (polychlorure de vinyle), qui est en corrélation avec la capacité de la bactérie de forme biofilms37,38, 47 , 48. format de la bibliothèque permet également l’étude des traits génétiques complexes tels que l’essaimage de motilité, attestée par l’identification de centaines de gènes d’intérêt dans un simple écran48. La valeur de PA14NR a été utilisée également dans un écran de basé sur la spectrométrie de masse MALDI-TOF à grande échelle pour acquérir et analyser les spectres de profil de cellules intactes du protéome et évaluer l’efficacité de MALDI-TOF biotypage47. Appliquant cette technique, les chercheurs ont pu déterminer si les différences génomiques mineures, telles que celles qui résultent des insertions du transposon, perturbatrices aux efforts de biotypage qui sont utilisés dans des environnements cliniques et thérapeutiques. En outre, le jeu de PA14NR a été utilisé pour effectuer un écran Génome-large d’atténuation de la virulence PA14 dans un modèle d’infection de c. elegans , permettant d’identifier auparavant indéterminées gènes reliés à la virulence P. aeruginosa 38et offrant ainsi un exemple de l’utilisation de la bibliothèque de PA14 pour étudier les interactions hôte-pathogène.

Le jeu de PA14NR sert également une ressource importante pour l’étude de mutants individuels. Pour éviter toute contamination de la bibliothèque, les meilleures pratiques pour l’accès aux mutants d’intérêt sont recommandés. Parce que la gestion de la bibliothèque accroît le risque de contamination, il est recommandé de stocker des mutants d’intérêt dans des flacons individuels pour limiter l’accès aux PA14NR la valeur travail et originaux. Ceci prévient la contamination, améliore la longévité de la bibliothèque et protège l’investissement.

Afin de préserver l’intégrité de la ressource de jeu de PA14NR importante, il est conseillé que tous les destinataires de l’ensemble de PA14NR faire des copies de la bibliothèque à la réception. Malgré tous les efforts, le risque de contamination accidentelle pendant les procédures de réplication ne peut pas être exclu. Par conséquent, il est fortement recommandé que contrôle de qualité complet utilisateurs vérifie après la réplication de la bibliothèque et après l’utilisation de la bibliothèque pour exécuter des écrans génétiques. Il est également fortement recommandé que les utilisateurs font des copies supplémentaires de la PA14NR configuré pour effectuer l’écrans génétiques comme la probabilité de contamination interwell augmente. En outre, copies de bibliothèque utilisées pour effectuer plus de 2-3 écrans génétiques doivent être soumis au contrôle de qualité exhaustif des évaluations. Malheureusement, il n’y a aucune bonne façon de récupérer des bibliothèques qui subissent une perte de clones ou interwell contamination. Exemplaires de compromis ou contaminés doivent être éliminés. En conséquence, il est recommandé que les utilisateurs reproduire plusieurs exemplaires de la bibliothèque pour une utilisation de laboratoire de routine, étant donné que la durée de vie utile de la copie est limitée. Aussi, il est recommandé que les utilisateurs limitent l’accès à la « copie originale » pour préserver l’intégrité de l’ensemble de la PA14NR.

Les protocoles présentés ici fournissent une explication détaillée des techniques de réplication, y compris la mise en place, des protocoles et méthodes conseillées. Les protocoles de réplication décrits pour l’ensemble des PA14NR peuvent être adaptés pour générer jusqu'à 12 exemplaires de la bibliothèque et aussi facilement adaptable pour répliquer les autres bibliothèques bactériennes mutantes. Au meilleur de notre connaissance, il n’y a aucun protocoles publiés disponibles à ce jour avec des descriptions détaillées des procédures et des techniques utilisées pour la réplication, de maintenance et de validation des bactéries mutantes bibliothèques. Nous espérons que ces protocoles offrira aux utilisateurs de l’ensemble de PA14NR et d’autres bibliothèques mutants bactériennes avec les informations nécessaires pour effectuer ces tâches importantes.

Si la bibliothèque est utilisée pour les écrans de haut débit ou comme une source pour des mutants individuels, il est important d’évaluer périodiquement l’intégrité de la copie en cours d’utilisation. Pour ce faire, une formation adéquate du personnel et ré-évaluer la réplication ou mutant techniques de sélection devraient être faits périodiquement. L’utilisation de plaques de contrôle PA14NR la valeur et la performance de routine amplification par PCR et séquençage des mutants aléatoires pour confirmer leur identité sont fortement recommandées. Liberati el al. (2006) 37 a estimé que 2,8 % du nombre total de mutants dans le jeu de la PA14NR a été mal étiqueté, qui met en évidence la nécessité de mutants de transposon spécifiques de séquence et de générer des mutants de délétion dans le cadre avant de commencer toute étude approfondie et/ou publication de la recherche impliquant des gènes spécifiques. Étant donné les protocoles appropriés et méthodes pour la réplication de la bibliothèque et de la sélection de mutants individuels pour complément d’étude, le jeu de PA14NR contribuera à la compréhension de la pathogénicité P. aeruginosa et l’amélioration des résultats cliniques pour infecté patients.

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Disclosures

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêts financiers. Eliana Drenkard et Frederick Ausubel participaient à la création de la bibliothèque de mutant PA14 transposon non redondante. Bryan Hurley et Lael Yonker, actuellement maison et distribuent la bibliothèque mutante dans le cadre du département de pédiatrie au Massachusetts General Hospital.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Lisa Philpotts de la bibliothèque virtuelle de Treadwell MGH pour son orientation dans la recherche de la base de données. Ce travail a été soutenu par la Fondation de la fibrose kystique (YONKER16G0 et HURLEY16G0) et le NIH NIAID (BPH et ADE : R01 A1095338).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for Library Replication
Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 Corning Life Sciences 353072 via Fisher Scientific
Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μL Deep Well Plates, case of 25 Corning Life Sciences 3960 via Fisher Scientific
Nunc OmniTray (rectangular plates), case of 60 Thermo Scientific Rochester 242811 via Fisher Scientific
Rectangular Ice Pan, Midi (4L) Corning Life Sciences 432104 via Fisher Scientific
Secure-Gard Cone Mask, case of 300 Cardinal Health AT7509 via Fisher Scientific
AluminaSeal, pack of 100 Diversified Biotech ALUM-100 via Fisher Scientific
Breathe-Easy membrane, pack of 100 Diversified Biotech BEM-1 via Sigma-Aldrich
Sterile, individually wrapped, 50mL Solution Trough/Reagent Reservoir, case of 100 Sorenson S50100 via Westnet Incorporated
Plate roller VWR 60941-118 via VWR
Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pack of 16 sheets GA International RCL-11T1-WH via Labtag.com (template for printing also available from Labtag.com)
96-well replicator V & P Scientific, Inc. Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm long via V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro, 3mm Shaking incubator Infors HT l10003P via Infors HT
Picus 12 Channel 50-1200μL Electronic Pipette Sartorius 735491PR via Sartorius
Filter Tips 50-1200μL, pack of 960 Biohit 14-559-512 via Fisher Scientific; use electronic multichannel-compatible tips
Dry Ice User-specific vendor
Materials for Individual Mutant Storage
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Materials for Quality Control PCR
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000 via ThermoFisher
PCR Thermocycler
Omnistrips PCR Tubes with domed lids Thermo Scientific AB0404 via Fisher Scientific
ART Barrier low-retention pipette tips (10 uL, 100 uL, 1000 uL) Molecular BioProducts, Inc. Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL) via Sigma-Aldrich
Pipettes (P1000, P200, P20, P2) Gilson F167370 via Gilson
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-130 via Fisher Scientific
MasterPure DNA Purification Kit Epicentre MCD85201 via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use Thermo Scientific SM1333 via ThermoFisher
RediLoad Loading Buffer Invitrogen 750026 via ThermoFisher
Chemicals
Chemicals for Library and Individual Mutant Storage
Glycerol MB Grade, 1L Sigma Aldrich G5516 via Sigma-Aldrich
LB Broth Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.  Wiley, 1994.)
Tryptone Sigma Aldrich T7293 via Sigma-Aldrich
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 via Sigma-Aldrich
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653 via Sigma-Aldrich
Sodium Hydroxide Sigma Aldrich S8045 via Sigma-Aldrich
LB  agar See preparation above, add 15g Bacto Agar
Bacto Agar Sigma Aldrich A5306 via Sigma-Aldrich
Gentamicin sulfate, 10g BioReagent 1405-41-0 via Sigma-Aldrich
Kanamycin sulfate Gibco 11815024 via ThermoFisher
Ethanol, 190 proof Decon 04-355-221 via Fisher Scientific
Chemicals for Quality Control PCR
Primers User-preferred vendor See primers listed in Table 3
Corning cellgro Molecular Biology Grade Water Corning 46000CV via Fisher Scientific
Taq Polymerase Buffer Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
Taq DNA Polymerase, recombinant Invitrogen 10342020 via ThermoFisher
dNTPs Invitrogen 10297018 via ThermoFisher
Agarose Sigma A9539 via Sigma-Aldrich

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References

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Immunologie et Infection numéro 135 Pseudomonas aeruginosa transposon mariner bibliothèque mutante mutagenèse microbiologie infection opportuniste immunologie
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