Summary
Hier presenteren we een nieuwe methode voor gedeeltelijke resectie van de linker hepatische kwab bij neonatale (dag 0) muizen. Dit nieuwe protocol is geschikt voor de studie van acute lever schade en letsel reactie in de neonatale instelling.
Abstract
Morfologische orgel regeneratie na acute weefsel verlies is gemeenschappelijk onder lagere gewervelde dieren, maar wordt zelden waargenomen in zoogdieren postnatale leven. Volwassen lever regeneratie na 70% gedeeltelijke hepatectomy resulteert in hepatocyte hypertrofie met sommige replicatie in resterende lobben met herstel van de metabole activiteit, maar met permanent verlies van de gewonde kwab morfologie en architectuur. Hier, detail we een nieuwe chirurgische methode in de pasgeborene die een fysiologische omgeving dat bevorderlijk is voor de regeneratie laat. Dit model omvat amputatie van de linker kwab apex en een daaropvolgende conservatieve beheer regime, en mist de noodzaak voor afbinding van grote lever schepen of chemische schade, waardoor een fysiologische omgeving waar een regeneratie kan voorkomen. Wij breiden dit protocol amputaties op jonge muizen (P7-14), waarin de benadeelde lever van orgel regeneratie tot compenserende groei door hypertrofie overgangen. Het gepresenteerd, korte 30 min-protocol biedt een kader om te bestuderen van de mechanismen van de regeneratie, de leeftijd-geassocieerde daling bij zoogdieren en de karakterisatie van vermeende hepatische stam of progenitoren.
Introduction
Het vermogen om een orgaan te regenereren, of om te herstellen van vorm en functie, is gedacht te worden meestal verloren evolutionaire mettertijd. Het regeneratieve potentieel van de volwassen zoogdieren lever na acute chemische of fysische schade is gebleken dat de mobilisatie van alle resterende hepatocyten resulterend in golven van hypertrofie en paar rondes van celdeling, wat resulteert in een functionele maar architectonisch verschillende orgel1,2,3,4,5. Studies hebben onlangs begonnen te karakteriseren de regeneratieve reactie van neonatale zoogdieren organen op schade in de eerste week van leven6,7,8. Deze studies hebben aangetoond dat wanneer gewond tijdens de ontwikkeling van de neonatologie, bepaalde zoogdieren organen met morfologische regeneratie in plaats van compenserende groei of fibrose7,8 reageren.
Recente studies is gebleken dat regeneratie van zowel de globale structuur en de functie tijdens de vroege neonatale periode6,7,8 optreedt. Gevestigde lever schade protocollen betrekken chemische schade of beheer van ethanol9,10,11, paracetamol12,13,14,15 , tetrachloorkoolstof16,17,18,19, 70% gedeeltelijke hepatectomy4,20,21, of verwijdering van links en mediane lobben. Chemische administratie leidt tot de dood van de cel van de hepatocyte, maar vaak laat micro - en macro-structuren intact. Morfologische regeneratie kan niet gemakkelijk in deze context worden bestudeerd, zoals de algemene hepatische architectuur was niet uitgewist. De gedeeltelijke hepatectomy van 70% omvat hechtdraad Afbinding van de grote schepen, die nodig is om te stoppen met bloeden, maar laat een niet-fysiologische omgeving met permanente verstoring van therapieën. Bovendien, deze methode is alleen voor volwassen knaagdieren gebruikt, en de toepassing ervan op pasgeborenen is technisch moeilijk. Met dit in het achterhoofd, ontwikkelden we een methode waarbij 20-30% van de apex van de linker kwab is verwijderd in een pasgeboren P0-muis (figuur 1A-1B). Deze methode is operatief conservatieve, minimaal invasieve, niet technisch uitdagend, en leidt tot verlies van morfologie zonder de afbinding van therapieën, ruimte wordt gelaten voor regeneratie optreden bruto. Het resulterende stapsgewijze protocol, hieronder beschreven, zorgt voor een onderzoeker voor het uitvoeren van een gedeeltelijke lobulair hepatectomy op neonatale muizen om zoogdieren neonatale regeneratie in de vroege stadia van postnatale leven te bestuderen. Deze methode heeft ook duidelijke toepassingen aan vergelijkende studies in regeneratieve geneeskunde en de biologie van de cel van de stam, als het kan worden gebruikt in de lever tijdens latere fasen van het leven.
De meest voorkomende acute lever schade studies zijn chemisch geïnduceerde schade, volwassen lever amputatie of gedeeltelijke hepatectomy van 70%. Chemische schade vaak intraveneuze, intraperitoneaal of orale toediening van paracetamol, tetrachloorkoolstof of ethanol impliceert, en is een relatief eenvoudig en niet-invasieve letsel model. Zoals eerder besproken, chemische schade resulteert in de dood van de cel van de hepatocyte, maar vaak bladeren stroma en parenchym structuren intact, waardoor het moeilijk om te maken beweringen over morfologische regeneratie. Chemische schade vaak gecentreerd op hepatische schepen, waardoor het een nuttige techniek te bestuderen van de site en cel-specifieke schade, maar maakt het ook moeilijk te ondervragen, op het niveau van de hele orgel, andere populaties die verder van schepen kan bevinden en die kan bijdragen tot regeneratie. Ondanks deze beperkingen blijft chemische schade een nuttige en zeer fysiologisch relevante schade-model.
Volwassen 70% gedeeltelijke hepatectomy houdt de verwijdering van de linker- en mediaan kwabben na Afbinding van hepatische therapieën. Het antwoord op hepatectomy was goed gekenmerkt: de geamputeerde lever 14 dagen post 70% gedeeltelijke hepatectomy een grove andere architectuur dan die van de oorspronkelijke onbeschadigd kwab, als de hepatocyten van de resterende rechts en Spiegelse kwab ontwikkelt hypertrofie en een paar rondes van celdeling4,5te ondergaan. Dit maakt verloren massa en functie, maar er niet in slaagt om te regenereren de twee geamputeerde lobben, en daarom is geen vervanging voor bruto morfologie. Dientengevolge, is de reactie van de schade op 70% gedeeltelijke hepatectomy nuttig zijn te onderzoeken van compenserende groei mechanismen met beperkte regeneratie.
Hier beschrijven we een protocol voor een neonatale gedeeltelijke lobulair hepatectomy volledig. De procedure hiervoor passende dierlijke selectie en voorbereiding, chirurgische veld voorbereiding operatie en herstel. Optimalisatie en aanpassing van elk van deze stappen kunnen worden vereist voor andere toepassingen van het protocol.
We hebben uitgebreid uitgevoerd en geoptimaliseerd dit protocol op wild type C57BL/6J pups (JAX 000664), echter studeren andere cel populaties en mechanismen van regeneratie, gebruikten we ook verschillende transgene dieren, met inbegrip van muizen herbergen verschillende Cre en CreERT2 transgenen en/of knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, en Sox9CreERT2 JAX 018829) in combinatie met fluorescerende verslaggevers, zoals de regenboog en mTmG systemen (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. we vonden geen behoefte om te veranderen van deze methodologie voor verschillende muis stammen, zoals geen verschillen in overleving resultaten of regeneratieve potentieel werden waargenomen.
Naast het gebruik van verschillende dierlijke variëteiten, hebben we ook gedeeltelijke lobulair hepatectomies uitgevoerd op neonatale muizen met kleine molecules, zoals 4-hydroxy-tamoxifen en 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) behandeld. Dimethylsulfoxide (DMSO) en ethanol werden gebruikt als oplosmiddelen worden gebruikt, zoals bleek dat maïsolie was een belangrijke oorzaak van morbiditeit. We anders gevonden dat intraperitoneale toediening van kleine moleculen niet overleven of regeneratieve uitkomsten beïnvloeden. We voorspellen dat dit protocol aangepast voor gebruik met andere kleine moleculen worden zal te ondervragen van verschillende aspecten van regeneratie.
Neonatale muis chirurgie kunnen technisch uitdagende en bijzondere expertise in dierlijke handling en microscopische dissectie kunnen vereisen. De veehouderij expertise is nodig om te voorkomen dat moeders kannibalisme na chirurgie en tijdens de onmiddellijke herstelperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtsnoeren uiteengezet door de vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC) en Stanford University's administratieve Panel voor proefdier Zorg (APLAC), (protocolnummer #10266) en in de Verenigde Staten, of de Europese Animal Welfare Act, richtlijn 2010/63/EU. Het protocol is goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de regering van Beieren, Duitsland, en de machtiging niet ontvangen: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. dierlijke voorbereiding
- Bereiden een lege kooi met passende beddengoed op een verwarming pad.
- Voorafgaand aan het aanraken van dieren met handschoenen, wrijf de Moederdag beddengoed op de handschoenen.
- Verwijder alle pups van hun moeder en plaats in het lege kooi. Verwijder een aantal van de moeder-beddegoed en plaats het in de lege kooi met de pups.
- Plaats de moeder in een aparte, schone, droge kooi uit de buurt van het chirurgische gebied.
- Don nieuwe, schone steriele handschoenen vóór de chirurgische veld voorbereiding.
2. chirurgische veld voorbereiding
- Met behulp van een pipet 10 mL, voeg 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar een 10-cm petrischaal.
- Pipetteer 2 mL betadine of een vergelijkbare groep anti-septisch oplossing in de petrischaal 10-cm.
- Plaats een ontleden scope op het chirurgische gebied. Inschakelen ontleden toepassingsgebied lamp en aanpassen van de hoeveelheid licht aan comfort van de chirurg. Een pup kan worden geplaatst in het chirurgische gebied onder de lamp toepassingsgebied ontleden. Voldoende licht kan worden bevestigd door het ontbreken van schaduwen op het ventrale oppervlak van de pup.
- Voorbereiden van de kamer van de verdoving Isofluraan (Zie Tabel van materialen) met een neus kegel. De kamer moet worden gereinigd zonder bewijs van urine of ontlasting. Plaats de neus en de bijbehorende leidingen onder het ontleden toepassingsgebied in het chirurgische gebied. Doorschakelen van de toevoer van zuurstof en Isofluraan uitsluitend naar de neus.
- Bereiden van een post-operatieve herstel gebied met een verwarming pad ingesteld bij ongeveer 37 ° C. De post-operatieve herstel moet bestaan uit 4 stuks van gaas geplaatst op de top van de verwarming pad. Indien mogelijk, wrijf gaas kussentjes in de Moederdag beddengoed, ontlasting en urine voor het behoud van de Moederdag geur.
Opmerking: Het is onverstandig gebruik van een warmte lamp, als dit het moeilijk maakt te controleren van de temperatuur. Hoge temperaturen zal resulteren in de dood van neonatale muizen. - Bereiden en alle chirurgische instrumenten met een autoclaaf steriliseren. De hulpprogramma's die nodig zijn: Ontrafeling van micro schaar, pincet micro-ontleden, gaas, hemostat en een 6-0 monofilamenten niet-absorbeerbare hechtdraad. Chirurgische instrumenten kunnen resterilzed met een glazen kraal sterilisator.
3. gedeeltelijke lobulair Hepatectomy
- Anesthetize de pup door deze te plaatsen in de neus op haar terug en zachtjes taping haar voeten en de handen in plaats. De pup moet worden ontvangen van 5% Isofluraan in zuurstof.
- Laat de pup om te zitten voor 5 minuten of totdat voldoende verdoofd, die kan worden geverifieerd door een teen snuifje test.
- Injecteren van 5 mg/kg carprofen subcutaan vóór insnijding.
Opmerking: De hele operatie moet niet langer duren dan 30 min. slechtere uitkomsten kunnen worden waargenomen bij pasgeborenen die onder algemene anesthesie voor meer dan 30 min. Neem voorzorgsmaatregelen om de lengte van de operatie door middel van grondige veld voorbereiding en bevochtiging van de huid voorafgaand aan de sluiting om te minimaliseren van de hechtdraad geïnduceerde huid tranen te minimaliseren.
- Voorzichtig schoon uit de achterste buikwand met een kleine gaas zeem nat met betadine. Laat de betadine te drogen voor 1 min.
- Maak een incisie van de linker midclaviculaire 0.5 cm direct onder de ribbenkast met de ontrafeling van het micro schaar en pincet. Zachtjes scheiden van de huid met behulp van Tang en maak een tweede dieper ingesneden in de peritoneale Holte (Zie Figuur 1 c, links of gecentreerd)
- Zachtjes toepassing zijdelingse druk aan beide zijden van de buik met behulp van de rug, de stompe uiteinden van de ontrafeling van het micro schaar en pincet te dwingen de apex van de linker kwab uit de peritoneale holte. De linker apex van de linker kwab moet gemakkelijk gevisualiseerde (Figuur 1 c, rechts).
-
Van de apex, amputeren en weegt de hoeveelheid weefsel te worden verwijderd.
- Met behulp van de micro-dissectie schaar, zachtjes amputeren de gewenste hoeveelheid weefsel van de apex van de linker kwab.
- Plaats het geamputeerde weefsel in een 1.5-mL-buis gevuld met PBS. Weeg het geamputeerde weefsel met behulp van een analytische balans (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Plaats een stukje papier of gaas op de balans en het tarra. Vervolgens plaatst u het geamputeerde weefsel op het gaas of papier en meten van de massa. - Corrigeer het geamputeerde gebied in 2% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en de plaats in optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde over droogijs voor bevroren sectie analyse. Bevroren secties door snijden 7-10 µm secties met behulp van een standaard cryostaat analyseren.
- Met behulp van een warmgewalste stuk gaas, vervang zachtjes de linker kwab in de peritoneale holte. Laat de gaas in de holte tot het bloeden stopt.
- Verwijder het gaas en nat van de chirurgische site en het omliggende gebied met gaas gedrenkt met PBS.
- Sluit de chirurgische site met 6-0 monofilamenten, een niet-absorbeerbare draadjes met een running stitch. Het buikvlies en de huid moeten afzonderlijk worden gesloten.
Opmerking: Zachtjes bevochtiging van de huid met gaas gedrenkt met PBS kan minimaliseren hechtdraad geïnduceerde tranen. - Voorzichtig maar grondig reinigen van de pup met gaas gedrenkt met PBS en ervoor te zorgen geen bloed of betadine blijft. Rol de doorweekte gaas pad en scrub zachtjes over het teken van de wond schoon uit bloed of betadine.
Opmerking: Dit is vooral belangrijk als de moeder de pups kannibaliseren kan als ze zijn onvoldoende schoongemaakt. - Verwijder de pup uit de neus en plaats het op het gebied van herstel waarin de gaas pads blootgesteld aan de uitwerpselen en de urine van de moeder. Zodra de pup zich herstelt, vervangen door de pup in de lege kooi van de moeder-beddegoed.
Opmerking: Gebruik geen een warmte lamp. Het gebruik van een warmte lamp kan de pasgeborene oververhit raken. - Herhaal de procedure voor het gewenste aantal pups. Hoewel alle pups kunnen worden gebruikt, is het over het algemeen raadzaam om te vertrekken een paar pups niet geopereerd worden vervangen samen met de bediende pups.
- Vervang alle pups gelijktijdig met hun moeder beddengoed in de Moederdag kooi.
4. herstel en analyse
-
Follow-up van de muizen dagelijks.
- Controleer dat de wond gesloten blijft en verwijder eventuele dode pups, indien aanwezig.
- Als de wond heropent, bereiden de chirurgische site en herstel gebied als eerder beschreven, en herhaal stappen 3.8 aan 3.12.
- Injecteren van 5 mg/kg carpofen subcutaan 24 en 48 h na de procedure.
- Volg Pups van 56 dagen of meer.
- Euthanaseren de dieren na de gewenste hoeveelheid post-operatieve dagen door blootstelling aan kooldioxide (CO2) en de cervicale dislocatie.
- Plaats van muizen in de inductie / euthanasie kamer en inschakelen van de CO-2 tot muizen stoppen met ademhalen.
- Zorgen voor euthanasie door cervicale dislocatie. Duw op de dorsale hals van de muis met de voorgrond-vinger en duim naar beneden en met de andere hand, pull-down op de staart.
-
Verwijder de gehele lever en bloc en wegen.
- Zorgvuldig elke kwab scheiden en afzonderlijk wegen.
Opmerking: Verwijder de lever door zorgvuldige dissectie van de diafragma en hepatische en portaal schepen. De lobben van elkaar scheiden door zorgvuldig elke kwab bij bevestiging daarvan op de proximale ontleden.
- Zorgvuldig elke kwab scheiden en afzonderlijk wegen.
- Het bepalen van de omvang van de regeneratie door het vergelijken van de massa van de geamputeerde linker kwab met de massa van de hele lever. Een ongedeerd linker kwab is ongeveer 30% van de gehele lever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A detailleert een algemene tijdlijn van de neonatale gedeeltelijke lobulair hepatectomy (schematische in figuur 1B), en de verwachte duur van tijd om te wachten tot de regeneratie wordt waargenomen. Subtiele regeneratie van de linker kwab kan worden waargenomen 7-14 dagen post operatie. Volledige regeneratie werd vaak waargenomen na 56 dagen operatie post. Muizen moeten geen tekenen vertonen van fysiologische afwijkingen na de operatie.
Muizen die een gedeeltelijke lobulair hepatectomies mochten te herstellen voor de 2, 7, 14, 35, 56 dagen. De Haematoxyline en eosine (H & E) van gewonde links lobben van deze muizen na herstel zijn afgebeeld in Figuur 2. Met name na 56 dagen, kan de geamputeerde linker kwab kijken niet te onderscheiden van controle, ongedeerd lobben. Operaties gedaan op P14 jonge muizen werden gedaan voor vergelijking en toegestaan om te herstellen voor 7, post 14, tot 56 dagen operatie (Figuur S1).
Karakteriseren neonatale regeneratie, 45 muizen onderging gedeeltelijke lobulair hepatectomy op dag 0 en de massa's van alle hun kwabben 56 dagen genomen waren post operatie. De massa van de gewonde linker kwab onderging een grotere verandering in de massa in vergelijking met de andere ongedeerd mediaan, rechts, en Spiegelse kwab (Figuur 3 bis) en ongedeerd besturingselementen, nadert de massa van een ongedeerd linker kwab bij P56. Dit geeft aan dat regeneratie volgende neonatale lever schade is gelokaliseerd aan de linker kwab. Operaties gedaan op P14 jonge muizen werden gedaan voor vergelijking, die toonde verminderde regeneratie in de linker kwab en verhoogde compensatie van de ongedeerd lobben (figuur 3B), waaruit blijkt dat door 14 dagen, het antwoord van de schade op acute resectie overgestapt van kwab specifieke regeneratie globale vergoeding. Verdere karakterisering werd gedaan door de kleuring van de gebieden van de linker kwab van gewonde muizen op postoperatieve dag 56 met filamenteuze actine (f-actine) te visualiseren celmembranen (figuur 4A). Gebieden distale en proximale op het gebied van letsel werden vergeleken met ongedeerd besturingselementen en volwassen lobben 14 dagen na gedeeltelijke hepatectomies van 70%. Hepatocyten bleken te hebben vergelijkbare gebieden als ongedeerd besturingselementen, over 1,5-2 x minder dan volwassen muizen ondergaan regeneratie na gedeeltelijke hepatectomy van klassieke 70% (figuur 4B). Dit suggereert dat hypertrofie speelt een rol bij regeneratie van niet. Ten slotte, neonatale muizen werden ingespoten met 0,025 mg 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) in 90% PBS en 10% ethanol en 1, 3, 5, 7 en 14 dagen na de operatie. Het aantal EdU positieve cellen werden geteld van muizen kunnen herstellen voor de 7 dagen na de operatie (figuur 4C). Een aanzienlijke toename van het aantal EdU positieve cellen werden gevonden in de gewond/regenereren linker kwab in vergelijking met ongedeerd besturingselementen, die aangeeft dat de celproliferatie tot neonatale regeneratie bijdraagt.
Figuur 1: overzicht van gedeeltelijke lobulair Hepatectomy. (A) Een algemene schema en de tijdlijn van de gedeeltelijke lobulair hepatectomy is getoond met neonatale lever resectie gedaan te P0. Analyses werden uitgevoerd op P7, P14, P35 of P56. Resections waren ook geprobeerd op P7 en P14. (B) een schematische voorstelling van de omvang van de resectie van de linker kwab wordt weergegeven, afbakening van de 20 en 30% resections. (Dit cijfer is gewijzigd van Tsai et al.) 6. (C) beelden van neonatale chirurgie tonen: recht zijdige midclaviculaire insnijding (links, midden) en de blootstelling van de linker kwab apex (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: regeneratie na gedeeltelijke lobulair Hepatectomy. Muizen die een gedeeltelijke lobulair hepatectomies op P0 werden gevolgd voor 2, 7, 14, 35 en 56 dagen. Levers waren vastgesteld en gekleurd met H & E en de omvang van de regeneratie van de linker apex werd opgemerkt. Pijlen duiden gebieden waar de regeneratie in P0 muizen zich heeft voorgedaan. De bar van de schaal is 1 cm. Dit cijfer werd vanaf Tsai et al. gewijzigd 6 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: regeneratie per Lobe na gedeeltelijke lobulair Hepatectomy. (A) muizen ondergaan gedeeltelijke lobulair hepatectomies op P0 werden geanalyseerd op 7, 35 en 56 dagen post-operatively. Muizen werden euthanized en massa's van alle lobben van gewonde muizen (rood) werden gegrepen en in vergelijking met leeftijd gecompenseerde massa's van ongedeerd controle (rood). (B) Muizen die een gedeeltelijke lobulair hepatectomies op P14 werden geanalyseerd op 7, 35 en 56 dagen post-operatively. Massa's van alle lobben van gewonde muizen (rood) werden genomen en vergeleken met massa's van ongedeerd controle (rood). * = p < 0,05, ** = p < 0.005, *** = p < 0.0005, NS = niet significant. Dit dacht is van Tsai et al. gewijzigd 6 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: karakterisering van regeneratie Post Hepatectomy. (A) muizen ondergaan gedeeltelijke lobulair hepatectomies op P0 werden geanalyseerd 56 dagen na resectie en gekleurd voor F-actine. Beelden getoond van vlekken van gebieden proximale en distale op het gebied van amputatie, evenals vanaf leeftijd-matched ongedeerd controles en van volwassen muizen 14 dagen na de gedeeltelijke hepatectomy van 70%. Schaal bars zijn 100 µm. (B) gebieden van hepatocyten na letsel op gebieden proximaal of DISTAAL naar de site van de resectie werden vergeleken met gebieden van hepatocyten uit ongedeerd besturingselementen en volwassen 70% gedeeltelijke hepatectomies.* = p < 0,05, ** = p < 0.005, *** = p < 0.0005, *** = p < 0,00005, NS = niet significant. (C) muizen ondergaan lobulair hepatectomies op P0 werden behandeld met EdU en 7 dagen na resectie werden geanalyseerd. EdU+ cellen in de linker kwab worden weergegeven. (Schaal bar, 100 µm). (D) kwantificering van EdU+ cellen in muizen behandeld met EdU 7 en 14 dagen na gedeeltelijke lobulair hepatectomy in vergelijking met besturingselementen. Waarden zijn middelen ± SEM. Dit dacht al vanaf Tsai et al. is gewijzigd 6 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur S1: onvolledige regeneratie van jonge muizen. Muizen die een gedeeltelijke lobulair hepatectomies op P14 werden gevolgd voor 7, 35 en 56 dagen. Levers waren vastgesteld en gekleurd met H & E en de omvang van de regeneratie van de linker apex werd opgemerkt. Pijlen duiden gebieden waar de regeneratie in P0 muizen zich heeft voorgedaan. De bar van de schaal is 1 cm. Dit dacht werd van Tsai et al. gewijzigd 6 Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Acute hepatische letsel is traditioneel bestudeerd met behulp van chemische (paracetamol, ethanol, tetrachloorkoolstof) of chirurgische modellen (70% gedeeltelijke hepatectomy). De regeneratieve reactie na gedeeltelijke hepatectomy van 70% wordt gekenmerkt om globale hepatocyte hypertrofie en meerdere rondes van celdeling4,5te betrekken. Om te stoppen bloedingen, is dit model echter beperkt, zoals de grote bloedvaten moeten worden afgebonden verlaten van een abnormale omgeving voor regeneratie. Vele studies hebben daarom andere minder invasieve modellen van acuut letsel door chemische schade, het verlaten van de bruto architectuur in plaats voor regeneratie optreden werkzaam. Onlangs, Porrello et al. en Chang et al. is gebleken dat een sterk verschillende neonatale regeneratieve reactie na acuut letsel in het hart, cijfer tips en oren7,8. Hun conclusies van de resultaten parallel gepresenteerd, dat de lever ook een aparte regeneratieve fenomeen in neonatale leven6ondergaat. Bij meerdere soortgelijke vaststellingen in belangrijke organen is regeneratie in de vroege stadia van postnatale ontwikkeling een opkomende veld met potentiële gevolgen voor stamcelbiologie.
Vroege sterfte van neonatale gedeeltelijke lobulair hepatectomies komt vaak van onvoldoende herstel, grote bloeding of moeders verwaarlozing. Zoals gezegd, het gebruik van een hogere intensiteit warmtebron zoals een warmte lamp voor herstel, kan leiden tot de dood na de operatie. Neonatale muizen zijn afhankelijk van hun moeder gedurende ten minste de eerste twee weken van het leven. Op hetzelfde moment, zal de moeder vaak verwaarlozing en of haar jonge kannibaliseren als ze een abnormaliteit (zoals de geur van bloed of andere chemicaliën)24,25 zintuigen. Daarom is het zeer belangrijk dat de pasgeborene post-operatively grondig schoongemaakt en ingesmeerd met moeders beddengoed om te maskeren een offensief geuren. Als deze problemen adequaat worden aangepakt, kan overleven tot 100% bereiken. Als moeders kannibalisme een probleem wordt, kunnen de pups worden geplaatst in een kooi met een surrogaat-moeder met een aantal van haar eigen pups. Als dit het geval is, gebruikt u de surrogaat Moederdag beddengoed in de vorige stappen.
De resectie van 20-30% van de neonatale linker kwab en het daarop volgende regeneratie is waarschijnlijk niet inherent aan alleen de linker kwab. Momenteel, deze methode is alleen getest op links, als de mediaan bloot en meer posterieure rechts en Spiegelse kwab zou vereisen een grotere laparotomie, wat resulteert in een hoger risico op bloeding en, indirect, een hoger risico op maternale kannibalisme voor de Neonate. Echter, of de mechanismen van neonatale regeneratie heterogene binnen de lever zijn is een belangrijke vraag om te worden aangepakt, en daarom chirurgische dit protocol moet worden aangepast aan het ondervragen van de andere hepatische lobben.
De resultaten van deze neonatale hepatectomy studies hebben aangetoond een periode (P0-P7) gedurende welke regeneratie vermag optreden. Soortgelijke hepatische resections zijn gedaan over jonge muizen (P7, P10, P14) en niet leiden tot volledige regeneratie met aantoonbare litteken en fibrose, markering van een helder stukje waar de amputatie is opgetreden. Hoewel de reactie van de schade in jonge muizen na gedeeltelijke lobulair hepatectomy was niet de focus van een eerste studie, de discrepantie in regeneratieve potentieel tussen bij pasgeborenen en jonge muizen, en het verlies van de mogelijkheid om te reconstrueren van organen en weefsel architectuur, zijn essentieel om te begrijpen door wat mechanisme stam of progenitor cel neonatale regeneratie plaatsvindt.
Wij hebben eerder aangetoond dat neonatale geregenereerde levers niet alleen deze in architectuur en structuur verschijnen, maar ook niet te onderscheiden door de functie zijn. Immunofluorescentie vlekken voor functionele hepatische enzymen zoals cytochroom p450 2E1, glutamine synthetase (GS) en carbamoylphosphate synthetase (CPS) tonen een gelijkaardige distributie binnen geregenereerde gebieden in vergelijking met ongedeerd lobben. Het secundaire regeneratieve potentieel van een geregenereerde neonate is echter niet getest. Zoals neonatale muizen kunnen herstel voor 56 dagen fysiologisch niet te onderscheiden van ongedeerd besturingselementen, is het waarschijnlijk dat de klassieke regeneratieve antwoord volgt volwassen 70% gedeeltelijke hepatectomy zou voordoen. Echter deze lever regeneratie is vaak beperkt door hepatocyte uitputting en seriële hepatectomies na gedeeltelijke lobulair hepatectomies zou daarom een belangrijke studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatieverschaffing.
Acknowledgments
Wij danken P. Chu voor het uitvoeren van de H & E en histologie; en C. Wang en A. McCarty voor nuttige discussies. Onderzoek werd gesteund door middel van financiering van de Virginia en D. K. Ludwig Fund for Cancer Research; het nationale hart-, Long- en bloed Instituut (R01HL058770 en U01HL099999); en het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (RC1 00354) subsidies aan I.W. onder werd gesteund door het Human Frontier Science programma carrière Development Award (CDA00017), de Duitse Research Foundation (2787/1 RI), de Siebel stamcel instituut, en de Thomas en Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. werd gesteund door de NIH (T32GM007365), de National Research Service Award (1F30DK108561), en Paul en Daisy Soros Fellowship voor nieuwe Amerikanen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
