Summary
Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.
Abstract
Morphologische Organregeneration nach akuten Gewebeverlust ist häufig bei niedrigeren Wirbeltiere, aber wird selten in Säugetieren postnatale Leben beobachtet. Erwachsenen Leberregeneration nach 70 % teilweise Hepatektomie führt in Hepatozyten Hypertrophie mit einigen Replikation im verbleibenden Lappen mit Wiederherstellung der Stoffwechselaktivität, aber mit dauerhaften Verlust des verletzten Lappens Morphologie und Architektur. Hier zeigen wir eine neue Operationsmethode in der Neugeborenen, die eine physiologische Umgebung förderlich für die Regeneration lässt. Dieses Modell beinhaltet Amputation der linke Lappen Spitze und eine anschließende konservative Verwaltung Regime, und fehlt die Notwendigkeit einer Ligatur der großen Leber Gefäße oder chemischen Verletzungen, so dass eine physiologische Umgebung wo Regeneration stattfinden kann. Wir erweitern dieses Protokoll zu Amputationen an juvenilen (P7-14) Mäusen, bei denen die Geschädigte Leber von Organregeneration in kompensatorischen Wachstum durch Hypertrophie wechselt. Das präsentiert, kurz 30 min-Protokoll sieht einen Rahmen um die Mechanismen der Regeneration, der altersassoziierten Rückgang bei Säugetieren und die Charakterisierung der vermeintlichen hepatische Stiel oder Vorfahren zu studieren.
Introduction
Die Fähigkeit zur Regeneration eines Organs oder zur Wiederherstellung von Form und Funktion, ist gedacht worden, vor allem über die evolutionäre Zeit verloren. Das regenerative Potential der Erwachsenen Säugetier-Leber nach chemischen oder physikalischen akutverletzung wurde gefunden, um die Mobilisierung der alle verbleibenden Hepatozyten in Wellen von Hypertrophie und einige Runden der Zellteilung, wodurch eine funktionale aber was beinhalten architektonisch verschiedenen Orgel1,2,3,4,5. Vor kurzem, haben Studien begonnen, die regenerative Reaktion des Neugeborenen Säugetieren Organe auf eine Verletzung innerhalb der ersten Woche des Lebens6,7,8charakterisieren. Diese Studien haben gezeigt, dass wenn bei Neugeborenen Entwicklung verletzt, bestimmte Säugetiere Organe mit morphologischen Regeneration statt kompensatorische Wachstum oder Fibrose7,8 reagieren.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Regeneration der globalen Struktur und Funktion während der frühen neonatalen Periode6,7,8auftritt. Etablierten Leberschädigung Protokolle beinhalten chemische Verletzungen oder Verwaltung von Ethanol9,10,11, Paracetamol12,13,14,15 , Carbon Titantetrachlorid16,17,18,19, 70 % teilweise Hepatektomie4,20,21oder Entfernung der linken und mittlere Lappen. Chemische Verwaltung führt zum Zelltod Hepatozyten, aber oft Mikro und Makro-Strukturen intakt. Morphologische Regeneration kann nicht ohne weiteres in diesem Zusammenhang untersucht werden, wie die insgesamt hepatische Architektur nicht ausgelöscht wurde. Die 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet Naht Ligatur der großen Gefäße, die Blutung zu stoppen notwendig ist, sondern lässt eine nicht-physiologischen Umgebung mit ständigen Unterbrechungen des Gefäßsystems. Darüber hinaus ist nur mit dieser Methode auf Erwachsene Nagetiere, und ihre Anwendung auf das Neugeborene ist technisch äußerst schwierig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, die in dem 20-30 % von der Spitze des linken Lappens, in einer Neugeborenen Maus P0 entfernt wird entwickelt (Abbildung 1A-1 b). Diese Methode ist chirurgisch konservative, minimal-invasive, nicht technisch anspruchsvoll und führt zum Verlust der Morphologie ohne die Unterbindung des Gefäßsystems, lässt Raum für Regeneration auftreten Brutto. Das resultierende Schritt für Schritt-Protokoll, wie unten beschrieben, ermöglicht für jeden Forscher eine partielle Lobuläres Hepatektomie an Neugeborenen Mäusen durchführen, um Säugetiere neonatale Regeneration in den frühen Stadien des postnatalen Lebens zu studieren. Diese Methode hat auch klare Anwendungen zu vergleichende Studien in der regenerativen Medizin und Stammzellbiologie, wie es in späteren Phasen des Lebens in der Leber verwendet werden kann.
Die häufigste akute Leberschädigung Studien sind chemisch induzierten Schäden, adult Leber Amputation oder 70 % teilweise Hepatektomie. Chemische Schäden oft intravenös, intraperitoneal oder orale Verabreichung von Paracetamol, Carbon Titantetrachlorid oder Ethanol beinhaltet, und ist eine relativ einfache und nicht-invasive Verletzung Modell. Wie bereits diskutiert, chemische Schäden Ergebnisse in Hepatozyten Zelltod, aber oft Blätter Stroma und Parenchym Strukturen intakt, macht es schwierig, Aussagen über morphologische Regeneration machen. Chemische Schäden oft konzentriert sich auf die hepatische Schiffe, so dass es eine nützliche Technik, Website und zellspezifische Verletzungen, studieren aber auch erschwert, kann weiter von Schiffen liegen und das mag, Ebene der gesamten Organs, anderen Populationen zu befragen, zur Regeneration beitragen. Trotz dieser Einschränkungen bleibt chemische Schäden noch eine nützliche und sehr physiologisch relevanten Verletzungen-Modell.
Erwachsene 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet die Entfernung der linken und mittleren Lappen nach Ligatur der hepatischen Gefäßsystem. Die Antwort auf Hepatektomie hat gut charakterisiert: die amputierten Leber 14 Tage Post 70 % teilweise Hepatektomie eine grob Architektur von derjenigen der ursprünglichen unbeschädigt Lappen als die Hepatozyten der verbleibenden rechten und caudatus Lappen entwickelt Hypertrophie und ein paar Runden der Zellteilung4,5zu unterziehen. Dies macht verloren und Funktion, aber schlägt fehl, die beiden amputierten Lappen zu regenerieren und ist daher kein Ersatz für grobe Morphologie. Dadurch eignet sich der Verletzung auf 70 % teilweise Hepatektomie, kompensatorischen Wachstum Mechanismen mit begrenzten Regeneration zu studieren.
Hier beschreiben wir voll und ganz ein Protokoll für eine neonatale teilweise Lobuläres Hepatektomie. Das Verfahren beinhaltet geeignete tierische Auswahl und Vorbereitung, Vorbereitung des Operationsfeldes, Chirurgie und Wiederherstellung. Optimierung und Anpassung der einzelnen Schritte können für verschiedene Anwendungen des Protokolls erforderlich.
Wir haben ausgiebig durchgeführt und optimiert dieses Protokoll auf Wildtyp C57BL/6J Welpen (JAX 000664), jedoch um unterschiedliche Zellpopulationen und Mechanismen der Regeneration zu untersuchen, wir auch verschiedene Transgene Tiere einschließlich Mäuse beherbergen verschiedene Cre verwendet und CreERT2 transgene und/oder Knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, und Sox9CreERT2 JAX 018829) in Kombination mit fluoreszierenden Reporter, wie der Regenbogen und mTmG Systeme (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. fanden wir keine Notwendigkeit, diese Methode für verschiedene Mausstämme ändern, da keine Unterschiede im Überleben Ergebnisse oder regenerative Potenzial beobachtet wurden.
Neben der Verwendung von verschiedener tierischer Stämmen, führten wir auch teilweise lobulären Hepatectomies an Neugeborenen Mäusen mit kleinen Molekülen, wie 4-hydroxy-Tamoxifen und 5-Ethynyl-2 '-Deoxyuridine (EdU) behandelt. Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Ethanol dienten als Lösungsmittel, da festgestellt wurde, dass Mais-Öl war eine wesentliche Ursache für Morbidität. Ansonsten fanden wir, dass intraperitonealer Verabreichung von kleinen Molekülen nicht überleben oder regenerative Ergebnisse beeinflussen. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll für die Verwendung mit anderen kleinen Molekülen zu verschiedenen Aspekten der Regeneration zu verhören angepasst werden.
Neugeborenen Maus Operationen können technisch anspruchsvoll und erfordern spezielles Know-how im Umgang mit Tieren und mikroskopische Dissektion. Tierhaltung-Kompetenz gilt, mütterliche Kannibalismus zu vermeiden nach der Operation und während der sofortigen Wiederaufnahme Periode.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von der Association for Assessment und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International (AAALAC) und der Stanford University Verwaltungs-Panel am Versuchstier durchgeführt Pflege (APLAC), (Protokoll-Nummer #10266) und in den Vereinigten Staaten oder dem Europäischen Tierschutzgesetz Richtlinie 2010/63/EU. Das Protokoll wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen des bayerischen Regierung, Deutschland, genehmigt und erhielt die Genehmigung nicht: 55.2-1-54-2532-150-2015.
(1) tierische Vorbereitung
- Bereiten Sie eine leere Käfig mit geeigneter Einstreu auf ein Heizkissen.
- Reiben Sie vor Tieren mit Handschuhen berühren die Mutter Bettzeug auf die Handschuhe.
- Entfernen Sie alle Welpen von ihrer Mutter und Ihrem Platz in den leeren Käfig. Entfernen Sie einige der mütterlichen Bettwäsche und legen Sie sie in den leeren Käfig mit den Welpen.
- Die Mutter in einem separaten, sauberen und trockenen Käfig entfernt das OP-Feld zu platzieren.
- Don neue, saubere sterile Handschuhe vor der Vorbereitung des Operationsfeldes.
(2) op-Feld-Vorbereitung
- Mit einer 10 mL-Pipette, 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Hinzufügen einer 10 cm Petrischale.
- Pipette 2 mL Betadine o.ä. antiseptisch-Lösung in der Petrischale 10cm.
- Legen Sie einen sezierenden Anwendungsbereich auf das Operationsfeld. Sezieren Umfang Lampe schalten Sie und passen Sie die Stufe des Lichts, der Chirurg Komfort. Ein Welpe kann in das OP-Feld unterhalb der sezierenden Umfang Lampe platziert werden. Ausreichend Licht kann durch das Fehlen von Schatten auf der ventralen Oberfläche der Pup bestätigt werden.
- Vorbereiten die Isofluran-Narkose-Kammer (siehe Tabelle der Materialien) mit einem Prüfkopf. Die Kammer sollte ohne Nachweis von Urin oder Kot gereinigt werden. Legen Sie die bugnase und damit verbundenen Schläuche sezierenden Rahmen im Operationsfeld. Die Strömung von Sauerstoff und Isofluran ausschließlich auf die bugnase abzulenken.
- Bereiten Sie einen postoperative Recovery-Bereich mit einem Heizkissen gesetzt bei etwa 37 ° C. Die postoperative Erholung sollte bestehen aus 4 Stück Gaze über das Heizkissen platziert. Wenn möglich, reiben Sie Gaze-Pads in der Mutters-Einstreu, Kot und Urin, die Mutter Duft zu bewahren.
Hinweis: Es ist schlecht beraten, eine Wärmelampe verwenden, da dies es schwierig macht, die Temperatur zu kontrollieren. Erhöhte Temperaturen führt zu den Tod des Neugeborenen Mäusen. - Vorbereiten und alle chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven sterilisieren. Die Werkzeuge sind erforderlich: Mikro-sezieren Schere, Mikro-sezieren Zange, Gaze, Gefäßklemme und 6-0 Monofile nicht resorbierbaren Naht. Chirurgische Instrumente können Resterilzed mit jedem Glas Bead Sterilisator.
(3) teilweise Lobuläres Hepatektomie
- Der Welpe zu betäuben, indem man sie in die bugnase auf seinen zurück und sanft taping, seine Füße und Hände im Ort. Der Welpe sollte 5 % Isofluran in Sauerstoff erhalten.
- Lassen Sie den Welpen zum Sitzen für 5 min oder bis ausreichend betäubt, die von einer Zehe kneiftest nachgeprüft werden kann.
- 5 mg/kg Carprofen subkutan vor dem Schnitt zu injizieren.
Hinweis: Die gesamte Operation dauert nicht mehr als 30 min. schlechtere Ergebnisse beim Neugeborenen beobachtet werden können, die unter Vollnarkose für über 30 min stehen. Vorkehrungen Sie zur Minimierung der Länge der Chirurgie durch gründliche Bereich Vorbereitung und Benetzung der Haut vor der Schließung, Naht induzierte Haut Tränen zu minimieren.
- Mit einem kleinen Tupfer nass mit Betadine der hinteren Bauchwand reinigen Sie sanft. Lassen Sie Betadine 1 min trocknen.
- Machen Sie einen linken Mitte clavicular 0,5 cm Schnitt direkt unterhalb des Brustkorbs mit dem Mikro-sezieren Scheren und Pinzetten. Sanft die Haut mit einer Pinzette zu trennen und einen zweite tieferen Einschnitt in die Bauchhöhle (siehe Abbildung 1, Links und Mitte) machen
- Sanft seitlichen Druck von beiden Seiten des Bauches mit der Rückseite, die stumpfen Enden der Mikro-sezieren Scheren und Pinzetten, um die Spitze des linken Lappens aus der Bauchhöhle zu zwingen. Die linke Spitze des linken Lappens sollte leicht visualisiert (Abbildung 1, rechts).
-
Von der Spitze zu amputieren Sie und wiegen Sie die Menge des Gewebes entfernt werden.
- Mit der Mikro-Dissektion Schere, sanft amputieren Sie die gewünschte Menge des Gewebes von der Spitze des linken Lappens.
- Ort der amputierten Gewebe in ein 1,5-mL-Röhrchen gefüllt mit PBS. Die Amputierte Gewebe mit einer Analysenwaage wiegen (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Legen Sie ein Stück Gaze oder Papier auf die Waage und Tarieren sie. Dann platzieren Sie die Amputierte Gewebe Gaze oder Papier und Messen Sie seine Masse zu. - Befestigen der amputierten Bereich in 2 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 1 h und Ort optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte über Trockeneis für Gefrierschnitte Analyse. Gefrierschnitte abschnittsweise schneiden 7-10 µm mit jedem standard Kryostat zu analysieren.
- Den linken Lappen mit einem gerollten Stück Gaze, sanft in die Bauchhöhle ersetzt werden. Verlassen Sie die Gaze in den Hohlraum, bis die Blutung aufhört.
- Entfernen Sie die Gaze und nass der Operationsstelle und Umgebung mit Gaze getränkt mit PBS.
- Schließen Sie die Operationsstelle mit 6-0 Monofile, nicht resorbierbare Nähte mit einem Running-Stich. Das Peritoneum und die Haut sollte separat geschlossen werden.
Hinweis: Sanft Benetzung der Haut mit Gaze getränkt mit PBS kann Naht induzierte Tränen minimieren. - Sanft aber gründlich reinigen Sie der Welpe mit Gaze getränkt mit PBS und gewährleisten Sie bleibt weder Blut noch Betadine zu. Roll das getränkte Gaze-Pad und sanft über die Wunde Zeichen sauber aus Blut oder Betadine scrub.
Hinweis: Dies ist besonders wichtig, da die Mutter die Welpen Ausschlachten kann, wenn sie nur unzureichend gereinigt werden. - Entfernen Sie den Welpen aus die bugnase und legen Sie es auf die Recovery-Bereich, die enthält die Gaze-Pads, Kot und Urin der Mutters ausgesetzt. Sobald der Welpe erholt, ersetzen Sie der Welpe in den leeren Käfig durch die Mutter Bettzeug.
Hinweis: Verwenden Sie keiner Wärmelampe. Die Verwendung einer Wärmelampe kann das Neugeborene zu einer Überhitzung führen. - Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl der Welpen. Obwohl alle Welpen verwendet werden können, ist es im Allgemeinen ratsam, ein paar Welpen nicht operiert, zusammen mit den operierten Welpen ersetzt werden zu lassen.
- Ersetzen Sie alle Welpen gleichzeitig mit ihrer Mutter Einstreu in der Mutter-Käfig.
4. Erholung und Analyse
-
Follow-up auf den Mäusen täglich.
- Überprüfen Sie, dass die Wunde geschlossen ist und entfernen Sie Toten Welpen zu, falls vorhanden.
- Wenn die Wunde wieder öffnet, bereiten Sie die op Website und Erholung-Bereich als zuvor beschrieben, und wiederholen Sie Schritte 3,8 bis 3.12.
- 5 mg/kg Carpofen subkutan 24 und 48 h nach dem Eingriff zu injizieren.
- Welpen für 56 Tage oder länger zu folgen.
- Die Tiere nach der gewünschten Menge an postoperativen Tagen durch Kohlendioxid (CO2) Belichtung und zervikale Dislokation einschläfern.
- Platzieren Sie Mäuse in der Induktion / Euthanasie Kammer und schalten Sie die CO2 bis Mäuse aufhören zu atmen.
- Euthanasie durch zervikale Dislokation zu gewährleisten. Auf der dorsalen Hals der Maus mit der Vordergrund-Finger und Daumen nach unten drücken Sie und mit der anderen Hand ziehen Sie am Heck.
-
Entfernen Sie die gesamte Leber en bloc und wiegen Sie es.
- Sorgfältig trennen Sie jeder Lappen und wiegen Sie getrennt.
Hinweis: Entfernen Sie die Leber durch sorgfältige Präparation der Zwerchfell und Leber und Portal Schiffe. Die Lappen voneinander zu trennen, jeder Lappen an den proximalen Anhang sorgfältig seziert.
- Sorgfältig trennen Sie jeder Lappen und wiegen Sie getrennt.
- Legen Sie den Umfang der Regeneration durch den Vergleich der Mass der amputierten linken Lappen, die Masse der gesamten Leber. Eine unverletzte linke Lappen ist etwa 30 % der gesamten Leber.
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Representative Results
Abbildung 1A beschreibt eine allgemeine Chronologie der Neugeborenen teilweise Lobuläres Hepatektomie (schematisch in Abbildung 1 b) und die voraussichtliche Zeitdauer zu warten, bis die Regeneration beobachtet wird. Subtile Regeneration der linke Lappen kann beobachteten 7-14 Tage Post op. Volle Regeneration wurde oft beobachtet, nach 56 Tagen-Chirurgie Post. Mäuse sollten keine Anzeichen von physiologischen Auffälligkeiten nach der Operation.
Mäuse, die derzeit teilweise lobulären Hepatectomies durften wieder für 2, 7, 14, 35 und 56 Tagen. Hämatoxylin und Eosin (H & E) der verletzten linken Lappen aus diesen Mäusen nach der Wiederherstellung sind in Abbildung 2dargestellt. Nach 56 Tagen sieht vor allem der Amputierte linken Lappen von Kontrolle, unverletzt Lappen nisht zu unterscheidend. Operationen gemacht auf P14 juvenile Mäuse wurden zum Vergleich gemacht und erlaubt wieder für 7, 14 und 56 Tagen nach der Operation (Abbildung S1).
Zur Charakterisierung von Neugeborenen Regeneration 45 Mäuse unterzog sich teilweise Lobuläres Hepatektomie am Tag 0 und die Massen der alles, was ihre Lappen 56 Tage aufgenommen wurden nach der Operation. Die Masse des verletzten linken Lappens wurde eine erhöhte Masse gegenüber unverletzt Median, rechts, und caudatus Lappen (Abbildung 3A) und unverletzt Kontrollen, kurz vor der Masse von einem unverletzten linke Lappen am P56. Dies weist darauf hin, dass Regeneration, die folgender Neugeborener Schädigung der Leber, der linke Lappen lokalisiert ist. Operationen gemacht auf P14 juvenile Mäuse zum Vergleich, die verminderte Regeneration in der linke Lappen und höhere Entschädigungen von der unverletzten Lappen (Abb. 3 b) zeigte gemacht wurden, darauf hinweist, dass 14 Tage, die Verletzungen Reaktion auf akute Resektion von bestimmten Regeneration Lappen umgestellt auf globale Entschädigung. Weitere Charakterisierung erfolgte durch Färbung Bereiche des linken Lappens aus verletzten Mäuse am postoperativen Tag 56 mit filamentösen Aktin (f-Actin), Zellmembranen (Abb. 4A) zu visualisieren. Bereichen distal und proximal zum Bereich der Verletzungen wurden mit unverletzt Kontrollen und Erwachsenen Lappen 14 Tage nach 70 % partielle Hepatectomies verglichen. Hepatozyten fanden sich auf ähnlichen Gebieten als unverletzt Steuerelemente über 1,5-2 x weniger als Erwachsener Mäuse in der Regeneration nach klassischen 70 % teilweise Hepatektomie (Abbildung 4 b). Dies deutet darauf hin, dass Hypertrophie Regeneration keine Rolle spielt. Schließlich wurden die Neugeborenen Mäuse mit 0,025 mg 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) in 90 % PBS und 10 % Ethanol und 1, 3, 5, 7 und 14 Tage nach der Operation injiziert. Die Anzahl der EdU positive Zellen wurden von Mäusen erlaubt wieder für 7 Tage nach der Operation (Abbildung 4) gezählt. Eine deutliche Steigerung der Zahl der EdU positive Zellen fanden sich in der verletzt/Regeneration linke Lappen im Vergleich zu unverletzt Kontrollen, die darauf hinweist, dass die Zellproliferation neonatale Regeneration beiträgt.
Abbildung 1: partielle Lobuläres Hepatektomie Übersicht. (A) Eine allgemeine Schaltplan und Timeline der teilweisen Lobuläres Hepatektomie mit Neugeborenen Leber Resektion Geschehenzu P0 gezeigt. Analysen wurden auf P7, P14, P35 oder P56 durchgeführt. Resektionen waren auch auf P7 und P14 versucht. (B) ein Schaltplan über das Ausmaß der Resektion des linken Lappens zeigt, 20-30 % Resektionen Abgrenzung. (Diese Abbildung wurde von Tsai Et Al.modifiziert) 6. (C) Bilder von Neugeborenen Operationen zeigen: Recht einseitig Mitte clavicular Inzision (Links, Mitte) und Exposition der linke Lappen Spitze (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Regeneration nach teilweiser Lobuläres Hepatektomie. Mäuse, die derzeit teilweise lobulären Hepatectomies bei P0 folgten 2, 7, 14, 35 und 56 Tage. Lebern wurden festgelegt und mit H & E gefärbt, und das Ausmaß der Regeneration der linken Scheitel wurde festgestellt. Pfeile kennzeichnen Bereiche wo Regeneration bei P0 Mäusen aufgetreten ist. Maßstabsleiste beträgt 1 cm. Diese Zahl wurde von Tsai Et Al. modifiziert. 6 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Regeneration pro Lappen nach teilweiser Lobuläres Hepatektomie. (A) Mäuse, die derzeit teilweise lobulären Hepatectomies bei P0 auf 7, 35 und 56 Tagen postoperativ analysiert wurden. Mäuse wurden eingeschläfert und Massen von allen Lappen aus verletzten Mäuse (rot) aufgenommen wurden und im Vergleich zu übereinstimmende Massen von unverletzten Regler (Red) altern. (B) Mäuse, die derzeit teilweise lobulären Hepatectomies auf P14 wurden auf 7, 35 und 56 Tagen postoperativ analysiert. Massen von allen Lappen aus verletzten Mäuse (rot) wurden genommen und im Vergleich zur Masse der unverletzten Kontrolle (rot). * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,0005, NS = nicht signifikante. Dies herausgefunden wurde von Tsai Et Al. modifiziert 6 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Charakterisierung der Regeneration Post Hepatektomie. (A) Mäusen derzeit teilweise lobulären Hepatectomies bei P0 56 Tage nach der Resektion analysiert und für F-Aktin gebeizt wurden. Bilder werden 14 Tage nach 70 % teilweise Hepatektomie Flecken von Bereichen proximal und distal zum Bereich der Amputation, sowie ab dem Alter abgestimmt unverletzt Kontrollen und von Erwachsenen Mäusen gezeigt. Maßstabsleisten sind 100 µm. (B) Bereiche der Hepatozyten nach Verletzung in Bereichen proximale oder distale Resektion Website wurden im Vergleich zu Gebieten der Hepatozyten aus unverletzt Kontrollen und Erwachsene 70 % teilweise hepatectomies.* = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,0005, *** = p < 0,00005, NS = nicht signifikante. (C) Mäuse einer lobulären Hepatectomies bei P0 mit EdU behandelt wurden und 7 Tage nach Resektion analysiert wurden. EdU+ Zellen in der linke Lappen werden angezeigt. (Maßstabsleiste, 100 µm). (D) Quantifizierung der EdU+ Zellen in Mäusen mit EdU 7 und 14 Tagen nach der teilweisen Lobuläres Hepatektomie im Vergleich zu Kontrollen behandelt. Werte sind Mittel ± SEM Dies herausgefunden wurde von Tsai Et Al. geändert hat 6 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung S1: unvollständige Regeneration von jungen Mäusen. Mäuse, die derzeit teilweise lobulären Hepatectomies auf P14 folgten 7, 35 und 56 Tage. Lebern wurden festgelegt und mit H & E gefärbt und das Ausmaß der Regeneration der linken Scheitel wurde festgestellt. Pfeile kennzeichnen Bereiche wo Regeneration bei P0 Mäusen aufgetreten ist. Maßstabsleiste beträgt 1 cm. Dies herausgefunden wurde von Tsai Et Al. modifiziert. 6 Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Akute Leberschädigung ist traditionell mit chemischen (Paracetamol, Ethanol, Carbon Titantetrachlorid) oder chirurgische Modelle (70 % partielle Hepatektomie) untersucht worden. Die regenerative Antwort nach 70 % teilweise Hepatektomie charakterisiert worden ist, um globale Hepatozyten Hypertrophie und mehrfache Umläufe der Zellteilung4,5einzubinden. Um Blutungen zu stoppen, ist dieses Modell jedoch begrenzt, da die großen Schiffe verlassen eine abnorme Umgebung zur Regeneration ligiert werden müssen. Viele Studien haben deshalb andere weniger invasiv Modelle von akuten Verletzungen durch chemische Schäden, verlassen die grobe Architektur im Ort zur Regeneration auftreten, eingesetzt. Vor kurzem, Porrello Et Al. und Chang Et Al. haben eine deutlich andere neonatale regenerative Antwort nach akuten Verletzungen im Herzen, Ziffer Tipps und Ohren7,8gezeigt. Ihre Ergebnisse parallel Schlussfolgerungen, dass die Leber auch eine deutliche regenerative Phänomen in Neugeborenen Leben6durchläuft. Mit mehrere ähnliche Ergebnisse in wichtigen Organen ist Regeneration in den frühen Stadien der postnatalen Entwicklung ein aufstrebendes Gebiet mit möglichen Folgen für die Stammzellbiologie.
Frühe Sterblichkeit von Neugeborenen teilweise lobulären Hepatectomies kommt häufig von unzureichender Erholung, große Blutung oder mütterlichen Vernachlässigung. Wie bereits erwähnt, ist die Verwendung einer höheren Intensität Wärmequelle wie eine Wärmelampe für Erholung, kann zum Tod nach der Operation führen. Neugeborene Mäuse sind abhängig von ihrer Mutter für mindestens die ersten zwei Wochen des Lebens. Zur gleichen Zeit wird die Mutter oft vernachlässigen und oder Ausschlachten ihre jungen, wenn sie eine Anomalie (z. B. der Geruch von Blut oder andere Chemikalien)24,25spürt. Es ist daher sehr wichtig, dass das Neugeborene postoperativ gründlich gereinigt und rieb mit mütterlichen Bettwäsche, offensive Düfte zu verschleiern. Wenn diese Probleme angemessen berücksichtigt werden, kann überleben bis zu 100 % erreichen. Wenn der mütterlichen Kannibalismus ein Problem wird, können die Welpen in einen Käfig mit einer Leihmutter mit einigen ihrer eigenen Welpen platziert werden. Wenn dies der Fall ist, verwenden Sie die Leihmutter Bettwäsche in den vorherigen Schritten.
Die Resektion von 20-30 % der Neugeborenen linke Lappen und anschließende Regeneration ist wahrscheinlich nur der linke Lappen nicht inhärent. Derzeit, diese Methode nur auf der linken Seite, als den Median auszusetzen getestet wurde und mehr posterioren rechts und caudatus Lappen würde erfordern eine größere Laparotomie, wodurch ein erhöhtes Risiko für Blutungen und indirekt auch ein höheres Risiko für mütterliche Kannibalismus für die Neugeborene. Allerdings seien die Mechanismen der Neugeborenen Regeneration heterogene innerhalb der Leber ist eine wichtige Frage angesprochen werden, und daher chirurgische Anpassungen zu diesem Protokoll erfolgen, um die hepatischen Lappen zu verhören.
Die Ergebnisse aus diesen Neugeborenen Hepatektomie Studien zeigten einen Zeitraum (P0-P7) während der Regeneration auftreten kann. Ähnlich wie Leber Resektionen an juvenilen Mäusen (P10, P7, P14) getan worden und führen nicht zu einer vollständigen Regeneration mit nachgewiesenen Narbe und Fibrose, markieren einen freien Platz, wo die Amputation aufgetreten ist. Obwohl Verletzungen bei jungen Mäusen nach teilweise Lobuläres Hepatektomie nicht im Mittelpunkt der eine erste Studie, die Diskrepanz in regenerative Potenzial zwischen Neugeborenen und jungen Mäusen und der Verlust der Fähigkeit, Organ- und Gewebespenden wiederherzustellen reagierten Architektur, werden für das Verständnis von welcher Mechanismus Stammzellen und Vorläuferzellen Zelle neonatale Regeneration stattfindet.
Wir haben bereits gezeigt, dass Neugeborenen regeneriert Leber nicht nur das gleiche in Architektur und Struktur scheinen, sondern sind auch nicht zu unterscheiden von Funktion. Immunfluoreszenz Flecken für funktionelle hepatische Enzyme wie Glutamin synthestase (GS), Carbamoylphosphate synthestase (CPS) und Cytochrom p450 2E1 zeigen eine ähnliche Verteilung innerhalb der regenerierten Bereiche im Vergleich zu unverletzt Lappen. Das sekundäre regenerative Potential des regenerierten Neugeborene wurde jedoch nicht getestet. Da Neugeborene Mäusen erlaubt, Erholung für 56 Tage physiologisch von unverletzten Steuerelemente nisht zu unterscheidend sind, ist es wahrscheinlich, dass die klassischen regenerative Reaktion nach Erwachsenen 70 % teilweise Hepatektomie auftreten würde. Jedoch dieser Leberregeneration wird häufig durch Hepatozyten Erschöpfung beschränkt und serielle Hepatectomies nach teilweiser lobulären Hepatectomies wäre daher eine wichtige Studie.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Angaben.
Acknowledgments
Wir danken P. Chu zur Durchführung von H & E und Histologie; und C. Wang und A. McCarty für hilfreiche Diskussionen. Forschung wurde unterstützt durch Mittel aus dem Virginia und D. K. Ludwig Fund for Cancer Research; das National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL058770 und U01HL099999); und California Institute for Regenerative Medicine (RC1 00354) Zuschüsse für IW Y.R wurde unterstützt durch die Human Frontier Science Programm Career Development Award (CDA00017), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (RI 2787/1), Siebel Stem Cell Institute, und die Thomas und Stacey Siebel-Stiftung (1119368-104-GHBJI). J.M.T. wurde von der NIH (T32GM007365), der nationalen Forschung Service Award (1F30DK108561), und Paul und Daisy Soros Fellowship für neue Amerikaner unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
