Summary
Nous présentons ici une nouvelle méthode pour la résection partielle du lobe hépatique gauche chez les souris néonatales (jour 0). Ce nouveau protocole est convenable pour l’étude d’atteinte hépatique aiguë et réponse de blessures dans le cadre néonatal.
Abstract
Régénération d’orgue morphologiques suite à la perte de tissu aiguë est fréquente chez les vertébrés inférieurs, mais est rarement observée dans la vie postnatale chez les mammifères. Régénération du foie adulte après hépatectomie partielle de 70 % se traduit par hypertrophie des hépatocytes avec une réplication dans des lobes restants avec la restauration de l’activité métabolique, mais avec une perte permanente de la morphologie et l’architecture de la lobe blessé. Ici, nous détaillons une nouvelle méthode chirurgicale chez le nouveau-né qui laisse un environnement physiologique propice à la régénération. Ce modèle implique l’amputation de l’apex du lobe gauche et un régime de gestion conservatrice subséquente et n’a pas la nécessité d’une ligature des principaux vaisseaux hépatiques ou des lésions chimiques, laissant un environnement physiologique où la régénération peut se produire. Nous étendons ce protocole à des amputations sur des souris (P7-14) juvéniles, au cours de laquelle le foie blessé passe de régénération d’organes à croissance compensatoire par l’hypertrophie. Le protocole présenté, bref 30 min fournit un cadre pour étudier les mécanismes de régénération, son déclin âge-associé chez les mammifères et la caractérisation des souches hépatiques putatif ou progéniteurs.
Introduction
La capacité de régénérer un organe, soit de rétablir la forme et la fonction, a été pensée pour être plus souvent perdu au fil du temps évolutionnaire. Le potentiel de régénération du foie chez les mammifères adult après une lésion aiguë chimique ou physique s’est avéré implique la mobilisation de tous les hépatocytes restants aboutissant à des vagues d’hypertrophie et quelques tours de la division cellulaire, résultant en un mais fonctionnel orgue architecture différente1,2,3,4,5. Récemment, les études ont commencé à caractériser le comportement régénératrice d’organes chez les mammifères nouveau-nés à des blessures au sein de la première semaine de vie6,7,8. Ces études ont montré que lorsque blessé durant le développement néonatal, certains organes de mammifères réagissent avec régénération morphologique au lieu de compensatoire croissance ou fibrose7,8.
Des études récentes ont montré que la régénération de la structure globale et la fonction se produit pendant le tôt période néonatale6,7,8. Protocoles établis des lésions hépatiques impliquent des blessures chimiques ou administration d’éthanol9,10,11, acétaminophène12,13,14,15 , tétrachlorure de carbone16,17,18,19, 70 % une hépatectomie partielle4,20,21ou la suppression de la gauche et lobes médians. Administration chimique conduit à la mort des cellules hépatocytes, mais laisse souvent des micro - et macro-structures intactes. Régénération morphologique ne peut être étudiée aisément dans ce contexte, que l’architecture globale hépatique n’était pas oblitéré. L’hépatectomie partielle 70 % implique les ligature de suture des vaisseaux principaux, qui est nécessaire pour arrêter le saignement, mais laisse un environnement non physiologique avec une interruption permanente du système vasculaire. De plus, cette méthode a été utilisée uniquement sur des rongeurs adultes et son application aux nouveaux-nés est techniquement extrêmement difficile. Dans cette optique, nous avons développé une méthode dans laquelle 20 à 30 % de l’apex du lobe gauche est enlevé dans une souris nouveau-née de P0 (Figure 1 a-1 b). Cette méthode est par chirurgie conservatrice, peu invasive, pas techniquement difficile et mène au brut perte de morphologie sans la ligature des vaisseaux, laissant la place à la régénération se produisent. Le protocole étape par étape qui en résulte, décrit ci-dessous, permet pour tout chercheur d’effectuer une hépatectomie partielle lobulaire sur souris néonatales afin d’étudier les mammifères régénération néonatale dans les premiers stades de la vie après l’accouchement. Cette méthode a également des applications claires pour des études comparatives en médecine régénératrice et de la biologie des cellules souches, comme il peut être utilisé dans le foie pendant les derniers stades de la vie.
Les études d’atteinte hépatique aiguë plus courantes sont lésion induite chimiquement, amputation du foie adulte ou 70 % une hépatectomie partielle. Dommages chimiques souvent consiste en une administration par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou orale d’acétaminophène, tétrachlorure de carbone ou d’éthanol et sont un modèle relativement simple et non invasif des blessures. Tel que déjà mentionné, les résultats de dommages chimiques dans la mort des cellules hépatocytes, mais souvent les feuilles stroma et parenchyme structures intactes, rendant difficile de faire des revendications sur régénération morphologique. Dommages chimiques souvent se concentre sur les vaisseaux hépatiques, ce qui en fait une technique utile pour étudier le site et blessures spécifiques des cellules, mais rend également difficile à interroger, au niveau des organes entiers, autres populations qui peut être situé plus loin de navires, et qui peut contribuer à la régénération. Malgré ces limites, dommages chimiques reste un modèle de blessures très physiologiquement pertinentes et utiles.
Adulte 70 % une hépatectomie partielle consiste à enlever le lobe gauche et médian après ligature des vaisseaux hépatique. La réponse à une hépatectomie a été bien caractérisée : le foie amputé 14 jours post 70 % une hépatectomie partielle développe une architecture nettement différente de celle du lobe original intact, comme les hépatocytes des lobes restants droite et noyau caudés subir une hypertrophie et quelques cycles de division cellulaire4,5. Cela représente la masse perdue et fonction, mais ne parvient pas à se régénérer les deux lobes amputés et donc ne remplace pas la morphologie générale. En conséquence, la réponse de blessure à 70 % une hépatectomie partielle est utile pour étudier les mécanismes de croissance compensatoire avec régénération limitée.
Nous décrivons ici pleinement un protocole pour une hépatectomie lobulaire partielle néonatale. La procédure implique une sélection animale appropriée et préparation, préparation du champ opératoire, chirurgie et la récupération. Optimisation et adaptation de chacune de ces étapes peuvent être nécessaires pour différentes applications du protocole.
Nous avons largement réalisé et optimisé ce protocole sur les chiots de C57BL/6J de type sauvage (JAX 000664), cependant, afin d’étudier les mécanismes de régénération et les différentes populations cellulaires, nous avons également utilisé divers animaux transgéniques y compris souris associées Cre diverses et CreERT2 transgènes ou knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, et JAX Sox9CreERT2 018829) en combinaison avec des journalistes fluorescents, telles que l’arc-en-ciel et mTmG (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. nous avons ne trouvé aucun besoin de changer cette méthodologie pour les souches de souris différente, car aucune différence dans les résultats de survie ou potentiel de régénération ont été observés.
En plus d’utiliser des souches animales différentes, nous avons effectué également partielle hepatectomies lobulaire sur souris néonatales traitées avec petites molécules, telles que la 4-hydroxy-tamoxifen et 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU). Le diméthylsulfoxyde (DMSO) et éthanol ont été utilisés comme solvants, comme il a été constaté que l’huile de maïs a été une cause importante de morbidité. Dans le cas contraire, nous avons constaté que l’administration intrapéritonéale de petites molécules n’affecte pas la survie ou résultats régénératrices. Nous prédisons que ce protocole sera adapté pour une utilisation avec d’autres petites molécules pour interroger les différents aspects de la régénération.
Chirurgies de souris néonatale peuvent être techniquement difficiles et peuvent nécessiter une expertise particulière en gestion d’animaux et de dissection microscopique. Expertise de l’élevage est nécessaire pour éviter le cannibalisme maternels après une intervention chirurgicale et durant la période de récupération immédiate.
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Protocol
Toutes les expériences sur des animaux ont été réalisées en stricte conformité avec les directives énoncées par l’Association pour l’évaluation et de la Commission Administrative d’accréditation du laboratoire Animal Care International (AAALAC) et de l’Université de Stanford sur l’Animal de laboratoire Soins (APLAC), (numéro de protocole #10266) et dans les États-Unis ou la Loi sur la protection des animaux européenne, Directive 2010/63/UE. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale du gouvernement de Bavière, en Allemagne et a reçu la permission ne : 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. la préparation animaux
- Préparer une cage vide avec literie appropriée sur un coussin chauffant.
- Avant de toucher les animaux avec des gants, frotter la literie de la mère sur les gants.
- Retirer tous les chiots de leur mère et leur place dans la cage vide. Enlever une partie de la literie de la mère et le placer dans la cage vide avec les chiots.
- Placer la mère dans une cage séparée, propre et sec, loin du champ chirurgical.
- Don nouveau, propre stériles gants avant la préparation du champ opératoire.
2. préparation du terrain chirurgicale
- À l’aide d’une pipette de 10 mL, ajouter 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à un plat de Pétri de 10 cm.
- Pipette de 2 mL de solution antiseptique betadine ou équivalent dans le plat de Pétri de 10cm.
- Placez une dissection étendue sur le champ opératoire. Allumez la lampe à portée de dissection et ajustez le niveau de lumière pour le confort du chirurgien. Un chiot peut être placé dans le champ chirurgical sous la lampe dissection de la portée. Suffisamment de lumière peut être confirmé par l’absence des ombres sur la surface ventrale du chiot.
- Préparer la chambre d’anesthésie isoflurane (voir Table des matières) avec un cône de nez. La chambre doit être nettoyée sans preuve d’urine ou les excréments. Placez le cône de nez et le tube associé dans le cadre de dissection dans le champ opératoire. Dévier le flux d’oxygène et isoflurane uniquement à la coiffe.
- Préparer une zone de récupération post-opératoire avec un coussin chauffant à environ 37 ° C. La récupération postopératoire doit être composé de 4 morceaux de gaze placé sur le dessus du coussin chauffant. Si possible, frotter les tampons de gaze en literie, matières fécales et l’urine pour préserver l’odeur de la mère de la mère.
Remarque : Il est peu judicieux d’utiliser une lampe chauffante, tel qu’il est donc difficile de contrôler la température. Des températures élevées entraînera la mort de souris néonatales. - Préparer et stériliser tous les instruments chirurgicaux avec un autoclave. Les outils nécessaires comprennent : ciseaux micro-dissection, micro-dissection forceps, gaze, hémostatique et aucune suture non résorbable de monofilament de 6-0. Instruments chirurgicaux peuvent être restérilisés avec n’importe quel stérilisateur de perle de verre.
3. partielle hépatectomie lobulaire
- Anesthésier le chiot en le plaçant dans le cône de nez sur son enregistrement précédent et doucement ses pieds et les mains en place. Le chiot devrait recevoir 5 % isoflurane en oxygène.
- Laisser le chiot de s’asseoir pendant 5 min ou jusqu'à ce que suffisamment anesthésiés, qui peut être vérifié par un test du pincement orteil.
- Injecter 5 mg/kg de carprofen par voie sous-cutanée avant l’incision.
Remarque : L’opération entière prenne n’est plus que 30 min. de moins bons résultats peuvent être observés chez les nouveau-nés qui sont sous anesthésie générale pendant plus de 30 minutes. Prendre des précautions pour réduire au minimum la durée de la chirurgie par une préparation approfondie de terrain et humidification de la peau avant la fermeture pour minimiser les larmes de suture induite par la peau.
- Nettoyez doucement au large de la paroi abdominale postérieure avec une petite compresse humide avec betadine. Permettre la bétadine sécher pendant 1 min.
- Pratiquer une incision cm 0,5 médio-claviculaire gauche juste sous la cage thoracique avec les ciseaux micro-dissection et les forceps. Doucement, séparer la peau à l’aide de pinces et faire une seconde incision plus profonde dans la cavité péritonéale (voir Figure 1, Centre et gauche)
- Exercez une légère pression latérale des deux côtés de l’abdomen à l’aide de la dos, extrémités franches du micro-dissection ciseaux et pinces pour forcer l’apex du lobe gauche hors de la cavité péritonéale. L’apex gauche du lobe gauche devrait être facilement visualisés (Figure 1, droit).
-
À partir de l’apex, amputer et peser la quantité de tissu à enlever.
- En utilisant les ciseaux micro-dissection, amputer doucement la quantité désirée de tissu de l’apex du lobe gauche.
- Placer le tissu amputé dans un tube de 1,5 mL rempli avec du PBS. Peser le tissu amputé à l’aide d’une balance analytique (voir Table des matières).
Remarque : Placez un morceau de gaze ou du papier sur la balance et tarer il. Puis placez le tissu amputé sur la gaze ou du papier et de mesurer sa masse. - Difficulté la zone amputée dans 2 % de paraformaldéhyde à température ambiante pendant 1 heure et le lieu de température de coupe optimale (OCT) composée sur la glace sèche pour l’analyse de la section congelée. Analyser les coupes congelées de coupe 7-10 µm des sections à l’aide d’un cryostat standard.
- À l’aide d’un morceau de rouleau de gaze, remplacer doucement le lobe gauche dans la cavité péritonéale. Laissez la gaze dans la cavité jusqu'à l’arrêt du saignement.
- Retirer la gaze et mouiller le champ opératoire et ses environs avec de la gaze imbibée avec du PBS.
- Fermer le site chirurgical avec monofilament de 6-0, les sutures non résorbables avec le point d’exécution. Le péritoine et la peau doivent être fermés séparément.
NOTE : Mouiller doucement la peau avec de la gaze imbibée avec du PBS peut minimiser larmes de suture induite. - Doucement mais complètement nettoyer le chiot avec une gaze imbibée de PBS et n’Assurez-vous qu’aucun reste de sang ou betadine. Rouler la compresse imbibée et frottez doucement sur le signe de la plaie pour enlever n’importe quel sang ou de la bétadine.
NOTE : Ceci est particulièrement important que la mère peut cannibaliser les chiots si ils sont nettoyés insuffisamment. - Retirer le chiot de la coiffe et le placer sur la zone de récupération qui comprend les tampons de gaze, exposés à des matières fécales et l’urine de la mère. Une fois que le chiot se redresse, remplacer le chiot dans la cage vide avec literie de la mère.
Remarque : Ne pas utiliser une lampe chauffante. L’utilisation d’une lampe de chaleur peut provoquer le nouveau-né à surchauffer. - Répétez la procédure sur le nombre de chiots. Bien que tous les chiots peuvent être utilisés, il est généralement conseillé de laisser quelques petits ne pas opérés à remplacer ainsi que les petits exploités.
- Remplacer tous les programmes potentiellement indésirables simultanément avec la literie de leur mère dans la cage de la mère.
4. récupération et analyse
-
Suite aux souris tous les jours.
- Vérifier que la plaie reste fermée et retirez tout petits morts, le cas échéant.
- Si la blessure se rouvre, préparer la zone site et reprise chirurgicale comme précédemment décrits et répéter étapes 3,8 à 3,12.
- Injecter 5 mg/kg de carpofen par voie sous-cutanée de 24 et 48 h après la procédure.
- Suivez les petits pendant 56 jours ou plus.
- Euthanasier les animaux après la quantité désirée de jours post-opératoires exposition de dioxyde de carbone (CO2) et de la dislocation cervicale.
- Placez la souris dans l’induction / chambre de l’euthanasie et allumez le CO2 jusqu'à souris arrêtent de respirer.
- S’assurer que l’euthanasie par dislocation cervicale. Poussez vers le bas sur la nuque dorsale de la souris à l’aide de l’évidence-doigt et le pouce et de l’autre main, tirer vers le bas sur la queue.
-
Supprimer la totalité du foie en bloc et pesez-le.
- Soigneusement séparer chaque lobe et peser séparément.
Remarque : Retirez le foie par une dissection minutieuse des vaisseaux diaphragme et hépatique et portail. Séparer les lobes de l’autre en disséquant soigneusement chaque lobe à sa fixation proximale.
- Soigneusement séparer chaque lobe et peser séparément.
- Déterminer l’étendue de la régénération en comparant la masse du lobe gauche amputée à la masse du foie entier. Un lobe gauche blessé est environ 30 % du foie entier.
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Representative Results
Figure 1 a détaille une chronologie générale de l’hépatectomie partielle lobulaire néonatale (schématique à la Figure 1 b) et la durée prévue de la période d’attente jusqu'à ce que la régénération est observée. Régénération subtile du lobe gauche peut être observée 7-14 jours post chirurgie. La régénération complète a souvent été observée après que 56 jours après l’intervention chirurgicale. Souris ne devraient montrer aucun signe d’anomalies physiologiques après la chirurgie.
Souris hepatectomies lobulaire partielle de l’objet ont été autorisés à récupérer pour 2, 7, 14, 35 et 56 jours. L’hématoxyline et éosine (H & E) des lobes gauche blessés de ces souris après récupération sont indiquées à la Figure 2. Notamment, après 56 jours, le lobe gauche amputé peut-être sembler impossibles à distinguer de contrôle, lobes pas blessés. Chirurgies effectuées sur P14 souris juvéniles ont été faits pour comparaison et resurgir pour 7, 14 et 56 jours après l’intervention chirurgicale (Figure S1).
Afin de caractériser la régénération néonatale, 45 souris ont subi une hépatectomie partielle lobulaire au jour 0 et les masses de toutes leurs lobes étaient prises 56 jours après l’intervention chirurgicale. La masse du lobe gauche blessé subit une transformation accrue en masse par rapport aux autres médiane blessé, à droite et le lobe caudé (Figure 3 a) et contrôles blessés, presque la masse d’un lobe gauche blessé à P56. Cela indique que la régénération hépatique néonatale après une blessure est localisée dans le lobe gauche. Chirurgies effectuées sur P14 souris juvéniles ont été effectués à titre de comparaison, qui a montré une diminution de la régénération dans le lobe gauche et rémunération accrue des lobes blessés (Figure 3 b), ce qui indique que pendant 14 jours, la réponse de blessures à la résection aiguë passé de régénération spécifiques du lobe à la rémunération globale. Une caractérisation plus poussée a été faite par coloration des régions du lobe gauche de la souris blessées à jour postopératoire 56 avec les filaments d’actine (actine-f) pour visualiser les membranes cellulaires (Figure 4 a). Zones distales et proximales à la zone de la blessure ont été comparés aux contrôles indemnes et lobes adultes 14 jours suivant la hepatectomies partielle de 70 %. Les hépatocytes ont montré des zones semblables comme témoins indemnes, sur 1,5 à 2 x souris moins d’adultes en cours de régénération après classique 70 % une hépatectomie partielle (Figure 4 b). Ceci suggère que l’hypertrophie ne joue pas un rôle dans la régénération. Enfin, les souris néonatales ont été injectés avec 0,025 mg de 5-éthynyl-2'-déoxyuridine (EdU) éthanol PBS et 10 % à 90 % et 1, 3, 5, 7 et 14 jours après la chirurgie. Le nombre de cellules positives EdU ont été compté chez des souris a permis de récupérer les 7 jours suivant la chirurgie (Figure 4). Une augmentation significative du nombre de cellules positives EdU trouvées dans le lobe gauche blessé/régénération, lorsque comparés à des témoins indemnes, indiquant que la prolifération des cellules contribue à la régénération néonatale.
Figure 1 : aperçu partiel d’une hépatectomie lobulaire. (A) Un schéma général et la chronologie de l’hépatectomie partielle lobulaire est montré avec résection hépatique néonatale, faite P0. Des analyses ont été effectuées à P7, P14, P35 ou P56. Résections ont également été jugées à P7 et P14. (B) un schéma de l’étendue de la résection du lobe gauche est illustré, délimitant des résections de 20 à 30 %. (Ce chiffre a été modifié par Tsai et al.) 6. (C) Images de chirurgies néonatales affichage : droit profonde incision médio-claviculaire (gauche, Centre) et exposition de l’apex du lobe gauche (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : régénération après une hépatectomie partielle lobulaire. Souris l’objet partiel hepatectomies lobulaire à P0 ont été suivis pendant 2, 7, 14, 35 et 56 jours. Foies étaient fixées et colorées avec H & E, et la mesure de la régénération de l’apex gauche a été notée. Flèches indiquent les zones où la régénération est survenue chez les souris P0. Barre d’échelle est de 1 cm. Ce chiffre a été modifié de Tsai et al. 6 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : régénération par Lobe après une hépatectomie partielle lobulaire. (A) souris en cours hepatectomies lobulaires partielles au P0 ont été analysées à 7, 35 et 56 jours après l’opération. Souris ont été euthanasiés et masses de tous les lobes de souris blessées (rouges) ont été pris et par rapport à l’âge des masses assortis du contrôle pas blessé (rouge). (B) Subissant partielle hepatectomies lobulaire à P14 de souris ont été analysées à 7, 35 et 56 jours après l’opération. Masses de tous les lobes de souris blessées (rouges) ont été pris et par rapport aux masses de contrôle pas blessé (rouge). * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,0005, NS = non significatif. Ceci figuré a été modifié par Tsai et al. 6 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : caractérisation de régénération après hépatectomie. (A) souris en cours hepatectomies lobulaires partielles au P0 ont été analysés 56 jours après résection et colorés pour l’actine F. Images apparaissent des taches de zones proximales et distales à la zone de l’amputation, aussi bien à partir de témoins indemnes du même âge et de souris adultes 14jours après hépatectomie partielle de 70 %. Barreaux de l’échelle est de 100 µm. (B) les zones d’hépatocytes suite blessure à zones proximales ou distales sur le site de résection ont été comparés aux zones d’hépatocytes de contrôles indemnes et adulte hepatectomies.* partielle de 70 % = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,0005, *** = p < 0,00005, NS = non significatif. (C) souris en cours de hepatectomies lobulaire à P0 ont été traités avec EdU et ont été analysés à 7 jours après la résection. Cellules de EdU+ dans le lobe gauche sont indiqués. (Echelle, 100 µm). (D) Quantification de EdU+ cellules chez les souris traitées avec EdU 7 et 14 jours après une hépatectomie partielle lobulaire comparée aux témoins. Les valeurs sont moyens ± SEM Ceci figuré été a modifié de Tsai et al. 6 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure S1 : régénération incomplète des souris jeunes. Subissant partielle hepatectomies lobulaire à P14 de souris ont été suivis pendant 7, 35 et 56 jours. Foies étaient fixées et colorées avec H & E et la mesure de la régénération de l’apex gauche a été notée. Flèches indiquent les zones où la régénération est survenue chez les souris P0. Barre d’échelle est de 1 cm. Ceci figuré modification de Tsai et al. 6 S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Atteinte hépatique aiguë a traditionnellement étudiée à l’aide de produit chimique (acétaminophène, éthanol, tétrachlorure de carbone) ou modèles chirurgicaux (70 % une hépatectomie partielle). La réponse régénératrice après hépatectomie partielle de 70 % a été caractérisée d’impliquer l’hypertrophie des hépatocytes global et plusieurs cycles de division cellulaire4,5. Pour arrêter l’hémorragie, cependant, ce modèle est limité, car les principaux vaisseaux doivent être ligaturés en laissant un environnement anormal pour la régénération. De nombreuses études ont donc employée autres modèles moins invasives du traumatisme aigu à dommages chimiques, laissant l’architecture brute en place pour la régénération se produisent. Récemment, Porrello et coll. et Chang et coll. ont démontré une réponse régénératrice néonatale nettement différente après lésion aiguë dans le cœur, des chiffres conseils et oreilles7,8. Leurs conclusions parallèles des résultats présentés que le foie subit aussi un phénomène distinct régénératrice dans la vie néonatale6. Avec plusieurs des conclusions similaires dans les principaux organes, régénération dans les premiers stades du développement postnatal est un domaine émergent avec des implications potentielles pour la biologie des cellules souches.
La mortalité précoce de néonatale hepatectomies lobulaire partielle viendrait souvent de récupération insuffisante, hémorragie importante ou négligence maternelle. Comme indiqué précédemment, l’utilisation d’une source de chaleur intensité plus élevée comme une lampe pour la récupération, peut entraîner la mort suite à une chirurgie. Souris néonatales sont dépendants de leur mère au moins les deux premières semaines de vie. Dans le même temps, la mère sera souvent négliger et ou cannibaliser ses petits si elle détecte une anomalie (par exemple, l’odeur de sang ou d’autres produits chimiques)24,25. Il est donc très important que le nouveau-né est nettoyé soigneusement après l’opération et frotté avec literie maternelle pour masquer toute offensives parfums. Si ces questions sont abordées adéquatement, survie peut atteindre jusqu'à 100 %. Si le cannibalisme maternels devient un problème, les chiots peuvent être placés dans une cage avec une mère porteuse avec certains de ses propres petits. Si c’est le cas, utiliser la literie de la mère porteuse dans les étapes précédentes.
La résection de 20 à 30 % du lobe gauche néonatale et régénération subséquente est probablement non inhérents au lobe gauche seulement. Actuellement, cette méthode n’a été testée sur la gauche, comme exposant la médiane et plus postérieures droite et noyau caudés lobes nécessiterait une laparotomie plus grande, ce qui entraîne un risque plus élevé d’hémorragie et, indirectement, à un risque plus élevé de cannibalisme maternels pour les nouveau-né. Cependant, si les mécanismes de régénération néonatale sont hétérogènes dans le foie est une question importante à trancher, et des ajustements chirurgicales au présent protocole il faudrait donc d’interroger les autres lobes hépatiques.
Les résultats de ces études une hépatectomie néonatale ont montré un laps de temps (P0-P7) au cours de laquelle la régénération est en mesure de se produire. Les résections hépatiques similaires ont été faites sur des souris juvéniles (P7, P10, P14) et n’entraînent pas la régénération complète avec cicatrice démontrée et fibrose, marquant une zone dégagée où a eu lieu l’amputation. Bien que la réponse de blessures chez les jeunes souris après une hépatectomie partielle lobulaire n’était pas l’objet d’une étude initiale, la différence de potentiel de régénération entre souris néonatales et juvéniles et la perte de la capacité de reconstituer des organes et tissus architecture, sera essentielle pour comprendre de quelles cellules souches ou progénitrices de mécanisme se produit une régénération néonatale.
Nous avons démontré précédemment que foies régénérées néonatales non seulement apparaissent identiques dans l’architecture et la structure, mais sont également identiques par fonction. Immunofluorescence taches pour les enzymes hépatiques fonctionnels tels que la glutamine synthétase (GS), carbamoylphosphate synthétase (CPS) et du cytochrome p450 2E1 montrent une distribution similaire au sein de zones régénérées par rapport aux lobes pas blessés. Toutefois, le potentiel régénératif secondaire d’un nouveau-né régénéré n’a pas été testé. Comme souris néonatales a permis à la récupération pendant 56 jours sont physiologiquement indistinguibles des commandes pas blessés, il est probable que la réponse régénératrice classique après une hépatectomie partielle 70 % adultes se produirait. Toutefois, cette régénération du foie est souvent limitée par l’épuisement de l’hépatocyte et serial hepatectomies suite hepatectomies lobulaire partielle serait donc une importante étude.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation.
Acknowledgments
Nous remercions P. Chu pour l’exécution de H & E et histologie ; et C. Wang et A. McCarty pour discussions utiles. Recherche a été financée grâce au financement de la Virginie et D. K. Ludwig Fund for Cancer Research ; le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL058770 et U01HL099999) ; le California Institute for Regenerative Medicine (RC1 00354) subventions à I.W. Y.R. a été soutenue par le Human Frontier Science programme Career Development Award (CDA00017), la Fondation de recherche allemande (RI 2787/1), l’Institut de cellules souches de Siebel et le Thomas et Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. était accompagnée de la NIH (T32GM007365), le prix National du Service de recherche (1F30DK108561) et Paul et Daisy Soros Fellowship pour les nouveaux américains.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
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