Summary
Her presenterer vi en ny metode for delvis fjerning av den venstre hepatic flik i neonatal (dag 0) mus. Denne nye protokollen er egnet for akutte skader og skader respons i innstillingen neonatal.
Abstract
Morfologiske organ gjenfødelse etter akutt vev tap er vanlig blant lavere virveldyr, men er sjelden observert i pattedyr postnatal liv. Voksen leveren regenerasjon etter 70% delvis hepatectomy resulterer i hepatocyte hypertrophy med noen replikasjon i gjenværende lobes med restaurering av metabolsk aktivitet, men med permanent tap av skadde lobe morfologi og arkitektur. Her, detalj vi en ny kirurgisk metode i neonate som forlater et fysiologiske miljø bidrar til gjenfødelse. Denne modellen innebærer amputasjon av venstre lobe toppen og en påfølgende konservative behandling diett, og mangler nødvendigheten av ligation av store leveren fartøy eller kjemisk skade, etterlot et fysiologiske miljø der gjenfødelse kan oppstå. Vi utvider denne protokollen til amputasjoner på juvenile (P7-14) mus, som skadet leveren overganger fra organ gjenfødelse kompenserende vekst av hypertrofi. Presentert, korte 30 min protokollen gir et rammeverk for å studere mekanismer for regenerasjon og tilbakegangen alder-assosiert i pattedyr karakterisering av antatte hepatic stammen eller progenitors.
Introduction
Muligheten til å generere et organ, eller gjenopprette form og funksjon, har vært antatt å være mest tapt over evolusjonær tid. Regenerativ potensialet i voksen pattedyr leveren etter akutt kjemiske eller fysisk skade har blitt funnet for å involvere mobilisering av alle gjenværende hepatocytter bølger av hypertrofi og noen runder av cellen divisjon, noe som resulterer i en funksjonell, men arkitektonisk ulike organ1,2,3,4,5. Studier har nylig begynt å preger regenerativ svaret neonatal pattedyr organer skade innen den første uken av livet6,7,8. Disse studier har vist at når skadet under neonatal utvikling, visse pattedyr organer svare med morfologiske gjenfødelse i stedet for kompenserende vekst eller fibrose7,8.
Nyere studier har vist at regenerering av både globale struktur og funksjon oppstår under de tidlige neonatal tidsriktige6,7,8. Etablerte leverskade protokoller involverer kjemiske skade eller administrasjon av etanol9,10,11, Paracetamol12,13,14,15 , karbon tetrachloride16,17,18,19, 70% delvis hepatectomy4,20,21eller fjerning av venstre og Median lobes. Kjemisk administrasjon fører til hepatocyte celledød, men ofte forlater mikro - og makro-strukturer intakt. Morfologiske gjenfødelse studeres ikke lett i denne sammenheng, som samlet hepatic arkitekturen ikke ble obliterated. 70% delvis hepatectomy innebærer Sutur ligation av de store skipene, som er nødvendig for å stoppe blødningen, men etterlater et ikke-fysiologiske miljø med permanent avbrytelse av blodkar. Videre, denne metoden er bare brukt på voksen gnagere, og sin søknad til nyfødte er teknisk svært vanskelig. Med dette i bakhodet, utviklet vi en metode der 20-30% av toppen av den venstre lobe er fjernet i nyfødte P0 mus (figur 1A-1B). Denne metoden er kirurgisk konservative, minimal invasiv, ikke teknisk utfordrende, og fører til brutto tap av morfologi uten ligation av blodkar, forlater rommet for regenerering oppstår. Den resulterende trinnvise protokollen, beskrevet nedenfor gir noen forsker til å utføre en delvis lobular hepatectomy på neonatal mus for å studere pattedyr neonatal fornyelse i de tidlige stadiene av postnatal liv. Denne metoden har også klart programmer komparative studier i regenerativ medisin og stamcelleforskningen biologi, som det kan brukes i leveren under senere stadier av livet.
De vanligste akutte skader studiene er kjemisk indusert skade, voksen leveren amputasjon eller 70% delvis hepatectomy. Kjemisk skade ofte innebærer intravenøs, intraperitoneal eller muntlig administrasjon av paracetamol, carbon tetrachloride eller etanol, og er en relativt enkel og ikke-invasiv skade modell. Idet tidligere omtalt, kjemisk skade resultater i hepatocyte celledød, men ofte blader stroma og parenchyma strukturer intakt, gjør det vanskelig å gjøre krav om morfologiske gjenfødelse. Kjemisk skade sentre ofte på hepatic fartøyer, gjør det en nyttig teknikk området og celle-spesifikk skade, men gjør det også vanskelig å avhøre, på hele organ nivå, andre befolkninger som kan være plassert lengre fra fartøy og som kan bidra til fornyelse. Til tross for disse begrensningene fortsatt kjemisk skade en nyttig og svært fysiologisk relevant skade modell.
Voksen 70% delvis hepatectomy innebærer fjerning av venstre og median lobes etter ligation av hepatic blodkar. Hepatectomy responsen har vært godt preget: amputert leveren 14 dager innlegget 70% delvis hepatectomy utvikler en grovt forskjellig arkitektur enn den opprinnelige uskadet lobe, som hepatocytter av gjenværende rett og caudate flikene gjennomgå hypertrofi og noen runder av celledeling4,5. Dette utgjør mistet masse og funksjon, men klarer ikke å regenerere to amputert lobes, og derfor erstatte ikke brutto morfologi. Følgelig er skade responsen på 70% delvis hepatectomy nyttig å studere kompenserende vekst mekanismer med begrenset gjenfødelse.
Her beskriver vi fullt en protokoll for en neonatal delvis lobular hepatectomy. Prosedyren innebærer riktig dyr valg og forberedelse, kirurgiske feltet utarbeidelse, kirurgi og gjenoppretting. Optimalisering og tilpasning av hver av disse trinnene kan kreves for ulike programmer av protokollen.
Vi har mye utført og optimalisert denne protokollen på wild type C57BL/6J pups (JAX 000664), men for å studere ulike celle populasjoner og mekanismer for regenerasjon, vi også brukt ulike transgene dyr inkludert mus skjuler ulike grobunn og CreERT2 effekter av transgener og/eller knock-ins (Axin2CreERT2 JAX 018867, og Sox9CreERT2 JAX 018829) i kombinasjon med fluorescerende journalister, som the Rainbow og mTmG systemer (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. vi fant ikke nødvendig å endre denne metodikken for annen mus stammer, som ingen forskjeller i overlevelse resultater eller regenerativ potensial ble observert.
I tillegg til ulike dyr stammer, utført vi også delvis lobular hepatectomies på neonatal mus behandlet med små molekyler, som 4-hydroxy-tamoxifen og 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU). Dimethyl sulfoxide (DMSO) og etanol ble brukt løsemidler, som det ble funnet at maisolje var en vesentlig årsak til sykelighet. Ellers fant vi at intraperitoneal administrasjon av små molekyler ikke påvirke overlevelse eller regenerativ utfall. Vi spår at denne protokollen blir tilpasset for bruk med andre små molekyler avhøre ulike aspekter av gjenfødelse.
Neonatal musen operasjoner kan være teknisk utfordrende og kan kreve spesiell kompetanse i dyr håndtering og mikroskopiske disseksjon. Husdyrhold kompetanse er nødvendig for å unngå mors kannibalisme etter operasjonen og i umiddelbar gjenoppretting perioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i strengt samsvar med retningslinjer fastsatt av foreningen for vurdering og akkreditering av laboratoriet Animal Care International (AAALAC) og Stanford University's Administrative Panel på laboratoriet dyr Care (APLAC), (Protokollnummer #10266) og i USA, eller det europeiske dyr velferd gjerning, direktivet 2010/63/EU. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyr eksperimenter av regjeringen i Bayern, Tyskland, og fikk tillatelse ikke: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. dyr forberedelse
- Forberede en tom bur med riktig sengetøy på en varmeputen.
- Før berører dyr med hansker, gni mors sengetøy på hanskene.
- Fjern alle pups fra sin mor og sted inn i Tom bur. Fjerne noen av mors sengetøy og plasser den i Tom buret med pups.
- Plass mor i en separat, ren og tørr bur fra kirurgiske feltet.
- Don nye, rene sterile hansker før kirurgiske feltet utarbeidelse.
2. kirurgiske feltet forberedelse
- Bruker en 10-mL pipette, legge 10 mL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) til en 10 cm Petriskål.
- Pipetter 2 mL betadine eller tilsvarende anti-septisk løsning i Petriskål 10cm.
- Plass en dissecting omfang på kirurgiske feltet. Aktivere dissekere omfang lampe og justere nivået av lys kirurgens komfort. En valp kan plasseres i kirurgiske feltet under dissecting omfang lampen. Tilstrekkelig lys kan bekreftes ved fravær av skygger på ventral overflaten av pup.
- Forberede isoflurane anestesi kammeret (se Tabell for materiale) med en nesen kjegle. Kammeret bør rengjøres uten bevis av urin og avføring. Plass nesen kjegle og tilhørende rør under dissecting omfanget i kirurgiske feltet. Lede av oksygen og isoflurane for nesen kjegle.
- Forberede en postoperativ utvinning området med en varmeputen satt på ca 37 ° C. Postoperativ utvinning bør bestå av 4 gasbind plasseres over oppvarming pad. Hvis mulig, gni gasbind pads i mors sengetøy, avføring og urin å bevare mors duft.
Merk: Det er dårlig råd til å bruke en varmelampe, som dette gjør det vanskelig å kontrollere temperaturen. Høye temperaturer vil resultere i døden av neonatal mus. - Forberede og sterilisere alle kirurgiske instrumenter med en autoklav. Verktøyene nødvendig omfatter: mikro-dissekere saks, mikro-dissekere tang, gasbind, hemostat og noen 6-0 monofilament ikke-absorberbare Sutur. Kirurgiske instrumenter kan være resterilzed med noen glass bead sterilisere.
3. delvise Lobular Hepatectomy
- Bedøve pup ved å plassere den i nesen kjegle på sin tilbake og forsiktig taping beina og hendene på plass. Programmet skal motta 5% isoflurane i oksygen.
- Tillate pup å sitte i 5 minutter eller til tilstrekkelig anesthetized, som kontrolleres av en tå knipe test.
- Injisere 5 mg/kg av carprofen subcutaneously før snitt.
Merk: Hele operasjonen bør ikke ta mer enn 30 min. dårligere resultater kan observeres i nyfødte under narkose for over 30 min. Ta forholdsregler å redusere lengden på kirurgi gjennom grundig felt utarbeidelse og wetting i huden før nedleggelsen å minimere Sutur huden tårer.
- Mildt feilfri av bakre bukveggen med en liten gauze pute våt med betadine. Tillate betadine tørke 1 min.
- Få en venstre kravebenet 0,5 cm snitt rett under ribbe buret med mikro-dissekere saks og tang. Forsiktig skille huden ved hjelp av pinsett og gjøre andre dypere snitt i bukhulen (se figur 1 c, høyre og midten)
- Forsiktig bruk lateralt press fra begge sider av magen med ryggen, Butte endene av mikro-dissekere saks og tang tvinge toppen av den venstre lobe av bukhulen. Venstre toppen av den venstre lobe bør være lett visualisert (figur 1 c, høyre).
-
Fra toppen, amputere og veie mengden vev fjernes.
- Ved hjelp av mikro-disseksjon saks, forsiktig amputere ønsket antall vev fra toppen av den venstre lobe.
- Plass amputert vevet i en 1.5-mL tube fylt med PBS. Veie amputert vevet bruker en analytical balanse (se Tabell for materiale).
Merk: Legg et stykke gasbind eller papir på balansen og Tara det. Deretter plasserer amputert vevet gasbind eller papir og måle sin masse. - Fastsette amputert området i 2% paraformaldehyde ved romtemperatur 1t og sted i optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte over tørris for frosne delen analyse. Analysere frosne snitt av skjæring 7-10 µm seksjoner med alle standard kryostaten.
- Ved hjelp av en rullet stykke gasbind, forsiktig erstatte den venstre flik i bukhulen. La gasbind i hulrom til blødning stopper.
- Fjern gasbind og våt kirurgiske området og området rundt med gasbind fuktet med PBS.
- Lukk kirurgiske området med 6-0 monofilament, ikke-absorberbare suturer med en løpende stitch. Den peritoneum og huden skal lukkes separat.
Merk: Forsiktig fukte huden med gasbind fuktet med PBS kan minimere Sutur indusert tårer. - Forsiktig men grundig ren pup med gasbind fuktet med PBS og sikre er ingen blod eller betadine. Rulle fuktet gasbind puten og forsiktig skrubbe over såret tegn å rengjøre alle blod eller betadine.
Merk: Dette er spesielt viktig fordi mor kan kannibaliserer valpene hvis de er renset mangelfullt. - Fjerne programmet fra nesen kjegle og plassere den på utvinning området som inkluderer gasbind pads mors avføring og urin. Når programmet gjenoppretter, erstatte pup i Tom buret med mors sengetøy.
Merk: Ikke bruk en varmelampe. Bruk av en varmelampe kan forårsake neonate overopphetes. - Gjenta på ønsket antall pups. Selv om alle pups kan brukes, er det vanligvis lurt å la noen unger ikke drives på erstattes med det drives pups.
- Erstatt alle pups samtidig med morens sengetøy i mors bur.
4. utvinning og analyse
-
Følge opp musene daglig.
- Kontroller at såret fortsatt lukket og fjerne alle døde pups, hvis den finnes.
- Hvis såret gjenåpner, forberede det kirurgiske område og utvinning området som tidligere beskrevet, og gjenta trinn 3.8 til 3.12.
- Injisere 5 mg/kg av carpofen subcutaneously 24 og 48 h følge fremgangsmåten.
- Følg Pups 56 dager eller mer.
- Avlive dyrene etter ønsket mengde postoperativ dager av karbondioksid (CO2) eksponering og cervical forvridning.
- Plasser mus i innledningen / euthanasia kammer og slå på CO2 til mus slutter å puste.
- Sikre euthanasia ved cervical forvridning. Trykk ned på dorsal halsen museklikk forgrunnen fingre og tommelen og bruker derimot, trekke ned på halen.
-
Fjern den hele lever en bloc og veie den.
- Forsiktig skille hver lobe og veie separat.
Merk: Fjern leveren ved forsiktig Disseksjon av membran og lever og portalen fartøyene. Skille lobes fra hverandre av nøye dissecting hver lobe på sin proksimale vedlegg.
- Forsiktig skille hver lobe og veie separat.
- Bestemme omfanget av gjenfødelse ved å sammenligne masse amputert venstre lobe til massen av hele leveren. En uskadet venstre lobe er ca 30% av hele leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A detaljer en generelle tidslinje neonatal delvis lobular hepatectomy (skjematisk i figur 1B) og den forventede lengden på tiden vente til gjenfødelse er observert. Subtile regenerering av den venstre lobe kan være observert 7-14 dager innlegg kirurgi. Full gjenfødelse ble ofte observert etter 56 dager innlegget kirurgi. Mus bør viser ingen tegn til fysiologiske forandringer etter operasjonen.
Mus gjennomgår delvis lobular hepatectomies kunne gjenopprette for 2, 7, 14, 35 og 56 dager. Hematoxylin og eosin (H & E) av skadet venstre lobes fra disse musene etter utvinning er vist i figur 2. Spesielt etter 56 dager se den amputerte venstre lobe utvisket fra kontroll, uskadet lobes. Operasjoner utført på P14 juvenile mus ble gjort for sammenligning og lov til å gjenopprette for 7, legge 14 og 56 dager kirurgi (Figur S1).
Betegner neonatal gjenfødelse, 45 mus gjennomgikk delvis lobular hepatectomy på dag 0 og massene av alle deres lobes ble tatt 56 dager legge kirurgi. Masse skadet venstre lobe gjennomgikk en økt endring i massen i forhold til andre uskadet median, høyre, og caudate lobes (figur 3A) og uskadet kontroller, nærmer massen av en uskadet venstre lobe på P56. Dette indikerer at gjenfødelse følgende neonatal skader er lokalisert til den venstre lobe. Operasjoner utført på P14 juvenile mus ble gjort for sammenligning, som viste redusert gjenfødelse i venstre lobe og økt kompensasjon fra uskadet lobes (figur 3B), som angir at etter 14 dager, skade svaret til akutt resection byttet fra lobe bestemt gjenfødelse globale kompensasjon. Ytterligere karakterisering ble gjort av flekker områder av den venstre lobe fra skadet mus på postoperativ dag 56 med trådformede utgangen (f-utgangen) å visualisere cellemembraner (figur 4A). Distale og proksimale til skade området var forhold til uskadet kontroller og voksen lobes 14 dager etter 70% delvis hepatectomies. Hepatocytter ble funnet for å ha lignende områder som uskadet Kontroller om 1.5-2 x mindre enn voksne mus gjennomgår regenerering etter klassiske 70% delvis hepatectomy (figur 4B). Dette tyder på at hypertrofi ikke spille en rolle i gjenfødelse. Til slutt, neonatal musene ble injisert med 0.025 mg av 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) i 90% PBS og 10% etanol og 1, 3, 5, 7 og 14 dager etter operasjonen. Antall EdU positiv celler ble regnet fra mus kan gjenopprette i 7 dager etter operasjonen (figur 4C). En betydelig økning i antall EdU positiv celler ble funnet i skadet/regenererende venstre flik sammenlignet med uskadet kontroller, som angir at celle spredning bidrar til neonatal gjenfødelse.
Figur 1: delvis Lobular Hepatectomy oversikt. (A) En generell skjematisk og tidslinjen for den delvis lobular hepatectomy vises med neonatal leveren reseksjon på P0. Analyser ble gjort på P7, P14, P35 eller P56. Resections var også prøvd P7 og P14. (B) en skjematisk av omfanget av eksisjon av det venstre lobe vises, demarcating 20 og 30% resections. (Dette tallet har blitt endret fra Tsai et al.) 6. (C) bilder fra neonatal operasjoner viser: høyre sidig kravebenet snitt (venstre, midten) og eksponering av venstre lobe apex (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: regenerering etter delvis Lobular Hepatectomy. Mus gjennomgår delvis lobular hepatectomies på P0 ble fulgt i 2, 7, 14, 35 og 56 dager. Lever var fast og farget med H & E og omfanget av regenerering av venstre apex kjent. Piler betegne områder der gjenfødelse forekom i P0 mus. Skala er 1 cm. Dette tallet ble endret fra Tsai et al. 6 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: gjenfødelse per Lobe etter delvis Lobular Hepatectomy. (A) mus i delvis lobular hepatectomies på P0 ble analysert 7, 35 og 56 dager post-operatively. Mus var euthanized og masser av alle fliker fra skadet mus (rød) ble tatt og sammenlignet med alder matchet massene uskadet kontroll (rød). (B) Mus gjennomgår delvis lobular hepatectomies på P14 ble analysert 7, 35 og 56 dager post-operatively. Masser av alle fliker fra skadet mus (rød) ble tatt og forhold til massene uskadet kontroll (rød). * = p < 0,05, ** = p < 0.005, *** = p < 0,0005, NS = ikke betydelig. Dette funnet er endret fra Tsai et al. 6 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: karakterisering av gjenfødelse innlegget Hepatectomy. (A) mus i delvis lobular hepatectomies på P0 ble analysert 56 dager etter eksisjon og farget for F-utgangen. Bilder vises av flekker fra proksimale og distale til området amputasjon, samt fra alder-matchet uskadet kontroller og voksen mus 14 dager etter 70% delvis hepatectomy. Skala barer er 100 µm. (B) områder av hepatocytter etter skade på områder proksimale eller distale til resection området ble sammenlignet områder av hepatocytter fra uskadet kontroller og voksen 70% delvis hepatectomies.* = p < 0,05, ** = p < 0.005, *** = p < 0,0005, *** = p < 0.00005, NS = ikke betydelig. (C) mus gjennomgår lobular hepatectomies på P0 ble behandlet med EdU og ble analysert 7 dager etter resection. EdU+ celler i venstre flik vises. (Skala bar, 100 µm). (D) kvantifisering av EdU+ celler i mus behandlet med EdU 7 og 14 dager etter delvis lobular hepatectomy sammenlignet med kontrollene. Verdiene er betyr ± SEM. Dette funnet er har endret fra Tsai et al. 6 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Finne S1: ufullstendig regenerering av Juvenile mus. Mus gjennomgår delvis lobular hepatectomies på P14 ble fulgt i 7, 35 og 56 dager. Lever var fast og farget med H & E og omfanget av regenerering av venstre apex kjent. Piler betegne områder der gjenfødelse forekom i P0 mus. Skala er 1 cm. Dette funnet ble endret fra Tsai et al. 6 Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Akutt hepatic skade har tradisjonelt vært studert med kjemiske (Paracetamol, etanol, carbon tetrachloride) eller kirurgisk modeller (70% delvis hepatectomy). Regenerativ svaret etter 70% delvis hepatectomy har vært preget for å involvere globale hepatocyte hypertrofi og flere runder av celledeling4,5. For å stoppe hemorrhaging, men er denne modellen begrenset, som store skipene må være samskrevet forlate en unormal miljø for gjenfødelse. Mange studier har derfor ansatt andre mindre invasiv modeller av akutt skade gjennom kjemisk skade, forlater brutto arkitekturen i stedet for regenerering oppstår. Nylig har Porrello et al. og Chang et al. vist en markant forskjellige neonatal regenerativ svar etter akutte skader i hjertet, siffer tips og ører7,8. Sine resultater parallelle presentert konklusjoner at leveren også gjennomgår en distinkt regenerativ fenomen i neonatal livet6. Med flere tilsvarende funn i store organer er fornyelse i de tidlige stadiene av postnatal utvikling en nye feltet med potensielle konsekvenser for stem cell biology.
Tidlig dødelighet av neonatal delvis lobular hepatectomies kommer ofte fra utilstrekkelig utvinning, store blødning eller mødre forsømmelse. Som nevnt tidligere, bruk av en høyere intensitet varmekilde som en varmelampe for gjenoppretting, kan føre til døden etter operasjonen. Neonatal mus er avhengig av sin mor for minst de to første ukene av livet. Samtidig, vil mor ofte overse og eller cannibalize henne unge hvis hun registrerer en unormalt (som lukten av blod eller andre kjemikalier)24,25. Det er derfor svært viktig at neonate rengjøres grundig post-operatively og gned med mors sengetøy maske noen støtende dufter. Hvis disse problemene er tilstrekkelig adressert, kan overlevelse nå opp til 100%. Hvis mors kannibalisme blir et problem, kan pups plasseres i et bur med en surrogat mor med noen av hennes egen pups. Hvis dette er tilfelle, bruk det surrogat moder sengetøy i de foregående trinnene.
Eksisjon av 20-30% av nyfødte venstre lobe og påfølgende regenerasjon er trolig ikke ligger bare den venstre lobe. Foreløpig denne metoden er bare testet på venstre, som utsette median og mer bakre rett og caudate lobes ville nødvendiggjøre en større laparotomy, noe som resulterer i høyere risiko for blødning og indirekte, en høyere risiko for mors kannibalisme for den neonate. Imidlertid om mekanismer av neonatal gjenfødelse er heterogene i leveren er et viktig spørsmål tas, og derfor kirurgisk justeringer til denne protokollen bør gjøres avhøre andre hepatic lobes.
Resultatene fra disse neonatale hepatectomy studier har vist en tidsperiode (P0-P7) som gjenfødelse er kunne oppstå. Lignende hepatisk resections er gjort på juvenile mus (P7, P10, P14) og resultere ikke i fullstendig regenerering med demonstrert arr og fibrosis, merke et helt område der amputasjon oppstod. Selv om skade responsen i juvenile mus etter delvis lobular hepatectomy ikke var fokus for en innledende studie, avviket i regenerativ potensial mellom nyfødte og juvenile mus og tap av evnen til å Rekonstituer orgel og vev arkitektur, vil være nødvendig for å forstå hva mekanisme stammen eller stamfar celle neonatal gjenfødelse oppstår.
Vi har tidligere vist at neonatal Spartments lever ikke bare ser like ut i arkitektur og struktur, men er også utvisket av funksjonen. Immunofluorescence flekker for funksjonell hepatic enzymer som glutamin synthetase (GS), carbamoylphosphate synthetase (CPS) og cytochrome p450 2E1 viser en lignende distribusjon innen Spartments sammenlignet med uskadet lobes. Imidlertid er ikke sekundær regenerativ potensialet i en Spartments neonate testet. Neonatal mus kan utvinning i 56 dager er fysiologisk utvisket fra uskadet kontroller, er det sannsynlig at den klassiske regenerative svaret etter voksen 70% delvis hepatectomy ville skje. Imidlertid denne leveren gjenfødelse er ofte begrenset av hepatocyte utmattelse, og derfor føljetong hepatectomies etter delvis lobular hepatectomies ville være en viktig studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi takker P. Chu for H & E og histology; og C. Wang og A. McCarty for nyttig diskusjoner. Forskning var støttet gjennom finansiering fra Virginia og D. K. Ludwig Fund for forskning; Nasjonale hjerte, lunge og blod Institute (R01HL058770 og U01HL099999); California Institutt for regenerativ medisin (RC1 00354) tilskudd til I.W. Y.R. støttet av den menneskelige Frontier vitenskap Program karriere Development Award (CDA00017), tysk Research Foundation (RI 2787/1), Siebel stamcelleforskningen Institutt, og Thomas og Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. ble støttet av NIH (T32GM007365), National Research Service Award (1F30DK108561), og Paul og Daisy Soros fellesskap for nye amerikanere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L.
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
