Liposomer som indeholder single-kæde amphiphiles, udviser især fedtsyrer, forskellige egenskaber i forhold til disse indeholdende diacylphospholipids på grund af de unikke kemiske egenskaber af enkelt kæde amphiphiles. Her beskriver vi teknikker til fremstilling, rensning og brug af Liposomer bestod af en del eller hele af disse amphiphiles.
Liposomer som indeholder single-kæde amphiphiles, udviser især fedtsyrer, forskellige egenskaber i forhold til dem, der indeholder diacylphospholipids på grund af de unikke kemiske egenskaber af disse amphiphiles. Især forbedre fedtsyre Liposomer dynamiske karakter, på grund af den relativt høje Opløselighed af single-kæde amphiphiles. Tilsvarende er Liposomer som indeholder frie fedtsyrer mere følsomme over for salt og divalent kationer, på grund af de stærke vekselvirkninger mellem carboxylsyre hoved grupper og metalioner. Her viser vi teknikker til fremstilling, rensning og brug af Liposomer bestod af en del eller hele enkelt kæde amphiphiles (fx, oliesyre syrer).
Liposomer, eller blærer – rum afgrænset af tolagede membraner består af amphiphilic lipider – har fundet anvendelse i talrige biomedicinske anvendelser som levering køretøjer for lægemidler, modeller af cellemembraner, og udvikling af syntetisk celler. Vi og andre har også ansat Liposomer som modeller for primitive cellemembraner tidligt i livet. 1 , 2 , 3 , 4 typisk i sådanne systemer, vi ansætter single-kæde amphiphiles indeholder kun en lipid kulbrinte hale (fx, oliesyre), som disse molekyler er enklere at syntetisere uden gavn for kodede protein enzymer moderne celler ansætte.
Liposomer består af enkelt-kæde lipider er lig dem, dannet af diacylphospholipids (f.eks.1-palmitoyl-2-oleoyl –sn– glycero-3-phosphocholine, eller POPC) i, at grænsen er sammensat af tolagede membraner. Liposomer dannet fra enten klasse af lipider kan kan bevare en opløst nyttelast, og nedprioriteret og renset ved hjælp af forskellige teknikker. Flere vigtige forskelle skyldes de unikke kemiske karakteristika for single-kæde lipider. Vesikler dannet af fosfolipider er stabil over en bred pH interval, mens fedtsyre vesikler er kun stabilt på neutral til mildt grundlæggende pH (ca. 7-9), som kræver visse pH buffer for vesikel forberedelse. Det meste af tiden, kan denne buffer også indeholde specifikke opløselige molekyler til vesikel indkapsling, som kan være enten funktionelle materialer (fxRNA) for opdelte biokemiske reaktioner eller simpel fluorescerende farvestoffer (fx, calcein ) til vesikel karakterisering.
Tilstedeværelse af kun en enkelt kulbrinte kæde producerer en membran, der er både mere gennemtrængelig for opløste stoffer, såvel som mere dynamisk. Derudover carboxylsyre hoved gruppen i fedtsyrer resultater i blærer, der er mere følsomme over for tilstedeværelsen af salt og divalent kationer (fx, Mg2 +). Magnesium er et af de vigtigste divalent kationer for katalysere biokemiske reaktioner i protocells for oprindelsen af liv undersøgelser. Tidligt i livet, før udviklingen af avancerede protein enzymer, kan RNA have været den dominerende polymer, på grund af sin dobbelte kapacitet til selvstændig replikere og udføre katalyse. Et repræsentativt eksempel på en magnesium-kræver RNA relateret reaktion er ikke-enzymatiske RNA kopiering, første gang demonstreret i 1960 ‘ erne. 5 når kemisk aktiveret RNA nukleotider (dvs. 2-methylimidazolide nukleotider) binder sig til en allerede eksisterende primer-skabelon kompleks, 3′-hydroxyl gruppe af primeren angreb 5′-phosphatet af en tilstødende aktiveret monomer at fortrænge den forlader gruppen (dvs. 2-methylimidazole), og former en nye phosphodiester obligation. Denne RNA kopiering kemi kræver en høj koncentration af Mg2 +, som skal være Chelateret for at være kompatibel med fedtsyrer protocells. 6 en anden Mg2 +-afhængig reaktion er der katalyseret af hammerhead ribozym, som måske er de bedst karakteriserede katalytisk RNA. Denne ribozym, som kan være fremstillet af to korte oligonukleotider, udfører en self-kavalergang reaktion, der er praktisk til overvågning af en gel Skift. Som sådan, er det ofte ansat som model ribozymer i livets oprindelse undersøgelser. 7 på grund af et krav af denne ribozym for unliganded magnesium Liposomer er typisk opbygget af en blanding af fedtsyre og fedtsyre glycerol estere, som er mere stabilt at magnesium. 8 , 9 i denne protokol, vi præsenterer teknikker vi har udviklet i forberedelse, manipulation, karakterisering af disse vesikler og demonstrere anvendelsen af disse blærer som protocells til værten ikke-enzymatiske RNA kopiering og hammerhead ribozym katalyse.
Liposomer dannet fra fedtsyrer er blevet foreslået af mange som mulige modeller for primitive celler på grund af deres høje permeabilitet og dynamiske egenskaber. Enkelt kæde fedtsyrer carboxylic hoved gruppen kun tillader samlesæt til membraner i en begrænset pH interval, og de resulterende membraner er meget følsomme over for tilstedeværelsen af salte. Som et resultat, kræver fedtsyre vesikler forskellige forberedelse og håndtering af metoder i forhold til phospholipid vesikler.
I denne protokol, selv om vi bruger oliesyre som forbillede for Liposom dannelse, andre lange kæde umættede fedtsyrer (C14) og derivater deraf (ca. myristoleic syre, palmitoleic syre, og de tilsvarende alkoholer og estere, glycerol) også danne blærer efter tyndfilm rehydrering metode, så længe den samlede lipid koncentrationen er over cmc og hydrering buffer pH er tæt på pKa fedtsyre i membranen. Andre end tris-HCl buffer anvendes i denne protokol, blev andre buffersystemer (ca. bicine, fosfat, Borat) rapporteret at støtte fedtsyre vesikel dannelsen, selvom vesikler dannet i fosfat eller Borat buffer er normalt ret utæt13. De resulterende fedtsyre vesikler efter rehydrering er polydisperse og multilamellar, men er let konverteres til små monodisperse unilamellar blærer ved ekstrudering, som beskrevet. Sammenlignet med sonikering som en alternativ metode til at generere små blærer, giver ekstrudering flere muligheder for kontrol af vesikel størrelse ved at anvende forskellige pore størrelse membraner. Vesikler efter ekstrudering er som regel lidt større end membran porestørrelse, men ved at øge antallet af ekstrudering cyklusser, vesikler med en smallere størrelse distribution og en gennemsnitlig størrelse tæt på membranen porestørrelse kan opnås.
For at syntetisere funktionelle protocells, skal fedtsyre vesikler vært specifikke biokemiske reaktioner som følge af indkapsling af RNA eller andre byggesten. Tyndfilm rehydrering metode giver en nem måde at form vesikler indeholdende ønskede indkapslede materialer. Men indkapsling effektivitet er relativt lav og en stor del af kostbare materialer såsom RNA er typisk tabt i rensningsprocessen. I nogle tilfælde kan indkapsling effektiviteten forbedres beskedent ved gentagne fryse-tø cykler inden ekstrudering. Mikrofluid metoder til højtydende forberedelse af fosfolipid Liposomer mulighed for næsten 100% indkapsling effektivitet, men lignende metoder ikke har endnu blevet udviklet for fedtsyre vesikler.
Da håndtering protocells med enten chelaterede eller gratis Mg2 +, rensning efter magnesium løsning ud og repurification før hvert tidspunkt sikrer fjernelse af lækket indkapslet materiale, der kan påvirke nøjagtigheden af reaktionshastigheden målinger inde vesikler. Da hver rensning tager mindst 10 min. til at opnå god adskillelse og samle vesikel fraktioner, analyse af hurtige reaktioner er vanskelig, og reaktionen skal stoppes før kolonne repurification.
Den protokol, vi præsenterer her er velegnet til opførelse af fedtsyre Liposomer, der fungerer som værter reaktioner efterligne dem, der kan opstå i primitive celler. Vores protokoller også aktivere potentielle anvendelser i udviklingen af biomedicinske fremføringsmidler og bioreaktorer til andre biokemiske reaktioner.
The authors have nothing to disclose.
J.W.S. er en Investigator af Howard Hughes Medical Institute. Dette arbejde blev støttet i en del af en bevilling (290363) fra Simons Foundation til J.W.S. Både A.E.E. og K.P.A. anerkender støtte fra University of Minnesota start midler.
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |