ליפוזומים המכיל חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת, בעיקר חומצות שומן, התערוכה מאפיינים ברורים לעומת אלה diacylphospholipids המכיל בשל התכונות הכימיות ייחודי של חומרים פעילי שטח שרשרת אחת. כאן נתאר טכניקות עבור הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים מורכבת באופן חלקי או שלם של אלה חומרים פעילי שטח.
ליפוזומים המכיל חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת, בעיקר חומצות שומן, התערוכה מאפיינים ברורים לעומת אלה המכילים diacylphospholipids בשל התכונות הכימיות ייחודי של אלה חומרים פעילי שטח. בפרט, חומצת שומן ליפוזומים לשפר את אופי דינמי, בשל המסיסות גבוה יחסית של חומרים פעילי שטח יחיד-שרשרת. באופן דומה, ליפוזומים המכיל חומצות שומן בחינם רגישים יותר קטיונים כלט ומלח, בשל האינטראקציות חזק בין קבוצות ראש חומצה קרבוקסילית יונים מתכתיים. כאן אנו ממחישים שיטות הכנה, טיהור של השימוש ליפוזומים מורכבת באופן חלקי או שלם של חומרים פעילי שטח רשת יחיד (למשל, חומצות אולאית).
ליפוזומים, או שלפוחית – תאים ותחום על-ידי ממברנות bilayer מורכבת amphiphilic שומנים – מצאו שימוש ביישומים ביו רבים כמו רכבי ההעברה עבור תרופות, מודלים של קרום התא, ועבור התפתחות סינתטיים תאים. אנחנו ואחרים גם המועסקים ליפוזומים כמודלים של קרום התא פרימיטיבי בחיים מוקדם. 1 , 2 , 3 , 4 . בדרך כלל, במערכות כאלה, אנו מעסיקים יחיד-שרשרת חומרים פעילי שטח המכיל הזנב פחמימן השומנים אחד בלבד (למשל, חומצה אולאית), כמו אלה מולקולות פשוטות יותר לסנתז ללא הסיוע של אנזימים מקודד חלבון תאי מודרני להעסיק.
ליפוזומים המורכבת של שומנים חד-שרשרת דומים לאלה של diacylphospholipids (למשל, 1-palmitoyl-2-oleoyl –sn– glycero-3-phosphocholine, או POPC) כי הגבול הוא מורכב bilayer ממברנות. ליפוזומים נוצר גם מחלקה של ליפידים יכול לשמור תוכן מנה של מומס, יכול להיות לקצץ, מטוהרת על-ידי טכניקות שונות. מספר הבדלים חשובים כתוצאה כימי המאפיינים הייחודיים של שומנים חד-שרשרת. שלפוחית הנוצרת על-ידי פוספוליפידים יציבים על טווח pH רחבה, ואילו חומצת שומן שלפוחית יציבים רק ב- pH נייטרלי לבסיסי בלשון המעטה (ca. 7-9), המחייב מסוימים מאגר pH להכנה שלפוחית. רוב הזמן, מאגר זה עשויים להכיל מולקולות ספציפיות מסיסים שלפוחית כימוס, אשר יכול להיות גם חומרים פונקציונליים (למשל, ה-RNA) ממודר תגובות ביוכימיות או צבעי פלורסנט פשוטה (למשל, calcein ) עבור שלפוחית אפיון.
הנוכחות של רק שרשרת פחמימן יחיד מייצרת קרום זה הן יותר חדיר כדי מומסים בגבול, כמו גם דינמיות יותר. בנוסף, חומצה קרבוקסילית ראש הקבוצה נוכח תוצאות חומצות שומן שלפוחית כי הם יותר רגישים לנוכחות של קטיונים כלט ומלח (למשל, Mg2 +). מגנזיום הוא אחד קטיונים כלט החשוב ביותר עבור ותזרז בתגובות ביוכימיות protocells ללימודי מקור החיים. בחיים מוקדם, לפני האבולוציה של אנזימים חלבונים מתוחכמים, RNA ייתכן היה הפולימר דומיננטי, בשל יכולתה כפול לשכפל את עצמי ולבצע זרז. נציג דוגמה RNA הדורשים מגנזיום הקשורים התגובה היא RNA אנזימטי העתקה, שהראו שנות ה-60. 5 כאשר נוקלאוטידים הרנ”א כימית מופעל (כלומר 2-methylimidazolide נוקלאוטידים) לאגד מתחם פריימר-תבנית שישנו, קבוצת 3′-הידרוקסיל תחל התקפות של 5′-פוספט של מונומר מופעל סמוכים לעקור עזיבת קבוצה (קרי 2-methylimidazole) וטפסים חדש פוספודיאסטרי. כימיה העתקה זו RNA דורש ריכוז גבוה של Mg2 +, אשר צריך להיות chelated כדי להיות תואם עם חומצת שומן protocells. 6 מ ג עוד2 +-התגובה תלויה זה מזורז על ידי ריבוזים האמרהאד, וזה אולי הרנ א קטליטי מאופיין ביותר. ריבוזים הזה, אשר יכול להיות מחדש של שתי oligonucleotides קצר, מבצע תגובה עצמית-המחשוף נוח לפקח על-ידי שינוי ג’ל. ככזה, זה הוא לעתים קרובות מועסק בתור ריבוזים מודל במחקרים מקור החיים. 7 עקב דרישה מאת הזה ריבוזים עבור unliganded מגנזיום, ליפוזומים בדרך כלל נבנות על ידי תערובת של חומצות שומן אסטרים גליצרול חומצת שומן, אשר הם יציבים יותר כדי מגנזיום. 8 , 9 . פרוטוקול זה, אנו מציגים טכניקות פיתחו הכנה, מניפולציה, אפיון של שלפוחית הללו ואנו להדגים יישום של שלפוחית האלה כמו protocells על המארח-אנזימטי RNA העתקה של דג-פטיש ריבוזים זרז.
ליפוזומים של חומצות שומן שהוצעו על ידי רבים דגמים פוטנציאליים עבור תאים פרימיטיביים בשל שלהם חדירות גבוהה ואת מאפייני דינמי. קבוצת ראש קרבוקסילית של חומצות שומן שרשרת אחת בלבד מאפשר הרכבה עצמית תוך ממברנות בטווח מוגבל pH, בקרום וכתוצאה מכך די רגישים לנוכחות של מלחי. כתוצאה מכך, חומצת שומן שלפוחית דורשים הכנה שונה וטיפול בשיטות לעומת פוספוליפיד שלפוחית.
ב פרוטוקול זה, שלמרות שאנו משתמשים חומצה אולאית כדוגמה עבור ליפוזום היווצרות, השני שרשרת חומצות שומן בלתי רוויות (C14) ונגזרותיהם (ca. חומצה myristoleic, חומצה palmitoleic, כהלים התואם את גליצרול אסטרים) גם טופס שלפוחית בעקבות השיטה התייבשות סרט דק כל עוד ריכוז סה כ שומנים בדם הוא מעל cmc את ה-pH מאגר הידרציה קרובה pKa של חומצת השומן בתוך הקרום. מלבד טריס-HCl מאגר בשימוש פרוטוקול זה, מערכות אחרות-מאגר (ca. bicine, פוספט, בוראט) דווחו לתמוך היווצרות שלפוחית חומצת שומן, למרות שלפוחית נוצר מאגר פוספט או בוראט הם בדרך כלל די דולפים13. השלפוחיות המוגלתיות חומצת שומן שנוצר לאחר התייבשות הם polydisperse ו multilamellar, אבל בקלות מומרים קטנות monodisperse unilamellar שלפוחית על ידי ההבלטה כמתואר. לעומת sonication כאמצעי חלופי עבור יצירת שלפוחית קטנה, שחול מספק אפשרויות נוספות עבור הפקד של שלפוחית גודל על-ידי החלת ממברנות גודל הנקבוביות שונים. על ידי הגדלת מספר מחזורים שחול, ניתן להשיג שלפוחית עם התפלגות גודל לצר יותר, גודל ממוצע של קרוב גודל הנקבוביות קרום שלפוחית לאחר שחול בדרך כלל מעט יותר גדול מאשר גודל הנקבוביות ממברנה.
כדי לסנתז protocells תפקודית, חומצת שומן שלפוחית צריך מארח תגובות ביוכימיים ספציפיים הנובע ומגעים RNA או אבני הבניין השני. השיטה התייבשות סרט דק מספק דרך קלה כדי שלפוחית טופס המכיל חומרים שעברו אנקפסולציה הרצוי. עם זאת, היעילות כימוס נמוכה יחסית, חלק גדול של חומרים יקרים כגון RNA יאבדו בדרך כלל במהלך תהליך טיהור. במקרים מסוימים היעילות כימוס ניתן לשפר בצניעות לפי מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-להפשיר לפני ההבלטה. Microfluidic שיטות להכנת תשואה גבוהה פוספוליפיד ליפוזומים מאפשר כמעט 100% כימוס יעילות, אולם מקבילה לא ובכל זאת פותחו שיטות עבור שלפוחית חומצת שומן.
כאשר טיפול protocells עם chelated או חינם מ ג2 +, טיהור אחרי תוספת פתרון מגנזיום ו repurification לפני כל נקודת זמן מבטיחה סילוק דלף אנקפסולציה חומר אשר עלול להשפיע על הדיוק של קצב התגובה מדידות בתוך שלפוחית. מאז כל אחד לטיהור לוקח לפחות 10 דקות כדי להשיג הפרדה טובה וכדי לאסוף את השברים שלפוחית, הניתוח של התגובות מהיר הוא קשה, חייבים לעצור את התגובה לפני עמודה repurification.
פרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא גם מתאים לבנייה של חומצת שומן ליפוזומים לארח תגובות מחקה אלה שעלולים להתרחש בתאים פרימיטיבי. הפרוטוקולים שלנו מאפשרים גם יישומים פוטנציאליים בפיתוח של מערכות משלוח ביו ריאקטורים לתגובות ביוכימיים אחרים.
The authors have nothing to disclose.
J.W.S. הוא חוקר במכון רפואי הווארד יוז. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק (290363) של הקרן סימונס J.W.S. הן A.E.E. והן K.P.A. מכיר בכך תמיכה מקרנות הפעלה אוניברסיטת מינסוטה.
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |