Liposomer inneholder én-kjeden amphiphiles, viser spesielt fettsyrer, forskjellige egenskaper sammenlignet med de som inneholder diacylphospholipids på grunn av de unike kjemiske egenskapene til enkelt kjede amphiphiles. Her beskriver vi teknikker, rensing, og bruk av liposomer består delvis eller helt av disse amphiphiles.
Liposomer inneholder én-kjeden amphiphiles, viser spesielt fettsyrer, forskjellige egenskaper sammenlignet med de som inneholder diacylphospholipids på grunn av de unike kjemiske egenskapene til disse amphiphiles. Spesielt forsterke fettsyrer liposomer dynamiske karakter, på grunn av den relativt høye Løseligheten av enkelt-kjeden amphiphiles. Tilsvarende er liposomer inneholder frie fettsyrer mer følsomme for salt og divalent kasjoner, på grunn av sterk samspillet mellom karboksylsyre leder gruppene og metall ioner. Her beskriver vi metoder for forberedelse, rensing og bruk av liposomer består delvis eller hele enkelt kjede amphiphiles (f.eks, oleic syrer).
Liposomer eller blemmer-avdelinger avgrenset bilayer membraner består av amphiphilic lipider – har funnet bruk i mange biomedisinsk applikasjoner som levering biler for legemidler, modeller av celle membraner, og utviklingen av syntetisk celler. Vi og andre har også ansatt liposomer som modeller av primitive cellemembranene i tidlige liv. 1 , 2 , 3 , 4 vanligvis i slike systemer, vi bruker enkelt-kjeden amphiphiles som inneholder bare én lipid hydrokarbon hale (f.eks, oljesyre) som disse molekylene er enklere å syntetisere uten fordelen av kodet protein enzymer moderne celler ansette.
Liposomer består av enkelt-kjeden lipider er lik de dannet fra diacylphospholipids (f.eks1-palmitoyl-2-oleoyl –sn– glycero-3-phosphocholine eller POPC) i den grensen er sammensatt av bilayer membraner. Liposomer dannet fra enten klasse av lipider kan kan beholde en oppløst nyttelast, og forminsket og renset ved ulike teknikker. Flere viktige forskjeller resultat unike kjemiske egenskaper enkelt-kjeden lipider. Blemmer dannet av fosfolipider er stabile over et bredt pH-område, mens fettsyrer blemmer bare stabilt på nøytral til mildt grunnleggende pH (ca. 7-9), som krever visse pH i bufferen for vesicle forberedelse. Mesteparten av tiden, kan denne bufferen også inneholde bestemte løselige molekyler for vesicle innkapsling, som kan være enten funksjonelle materialer (f.eksRNA) for compartmentalized desinfisering eller enkel fluorescerende fargestoffer (f.eks, calcein ) for vesicle karakterisering.
Tilstedeværelse av bare en enkelt hydrokarbon kjede produserer en membran som er både mer gjennomtrengelig til solutes, samt mer dynamisk. I tillegg karboksylsyre leder gruppen i fettsyrer resultater i blemmer som er mer følsomme for tilstedeværelsen av salt og divalent kasjoner (f.eks, Mg2 +). Magnesium er en av de viktigste divalent kasjoner for å utløse biokjemiske reaksjoner i protocells for opprinnelse-of-life studier. I tidlige liv, før utviklingen av sofistikert protein enzym, kan RNA ha vært den dominerende polymer, på grunn av sin doble evnen til å selv replikere og utføre katalyse. Et representativt eksempel av en magnesium-krever relatert reaksjon er ikke-enzymatisk RNA kopiering, først vist i 1960. 5 når kjemisk aktivert RNA nukleotider (dvs. 2-methylimidazolide nukleotider) binde til en eksisterende primer-mal, 3-hydroksyl gruppen av primer angrep den 5′-fosfat av en tilstøtende aktivert monomer å forskyve forlate grupper (dvs. 2-methylimidazole) og skjemaer bånd en ny phosphodiester. Denne RNA kopiering kjemi krever en høy konsentrasjon av Mg2 +, som må være chelated for å være kompatibel med fettsyrer protocells. 6 en annen Mg2 +-avhengige reaksjon er det katalysert av hammerhead ribozyme, som er kanskje den mest preget katalytisk RNA. Denne ribozyme, som kan rekonstitueres fra to korte oligonucleotides, utfører en selv-cleavage reaksjon som er praktisk å overvåke ved en gel SKIFT. Som sådan, er det ofte ansatt som en modell ribozyme i opprinnelse-of-life studier. 7 på grunn av et krav av denne ribozyme for unliganded magnesium, liposomer er vanligvis konstruert av en blanding av fettsyrer og fettsyrer glyserol estere, som er mer stabile til magnesium. 8 , 9 i denne protokollen presenterer vi teknikker vi har utviklet for forberedelse, manipulasjon, karakteristikk av disse vesikler og demonstrere bruk av disse vesikler som protocells til verten ikke-enzymatisk RNA kopiering og hammerhead ribozyme katalyse.
Liposomer dannet av fettsyrer har blitt foreslått av mange som potensielle modeller for primitive celler på grunn av deres høy permeabilitet og dynamiske egenskaper. Karbonoxylsyre leder gruppen enkelt kjede fettsyrer bare innrømmer selvtillit forsamlingen i membraner i et begrenset pH-område, og de resulterende membranene er ganske følsomme for tilstedeværelsen av salter. Resultatet krever fettsyrer blemmer ulike forberedelse og behandling sammenlignet med phospholipid blemmer.
I denne protokollen, selv om vi bruker oljesyre som et eksempel for liposome formasjon, andre lang kjede umettede fettsyrer (C14) og deres derivater (ca. myristoleic syre, palmitoleic syre og tilsvarende alkoholer og glyserol estere) også danne blemmer etter metoden tynnfilm rehydrering totale lipid konsentrasjonen er over cmc og hydrering buffer pH er nær pKa av fettsyrer i membranen. Annet enn tris-HCl bufferen brukes i denne protokollen, ble andre buffer systemer (ca. bicine, fosfat, borate) rapportert å støtte fettsyrer vesicle formasjon, om blemmer i fosfat eller borate bufferen er vanligvis ganske lekk13. De resulterende fettsyrer blemmer etter utvanning er polydisperse og multilamellar, men er enkelt konverteres til små monodisperse unilamellar blemmer ved ekstrudering som beskrevet. Sammenlignet med sonication som en alternativ metode for å generere små blemmer, inneholder ekstrudering flere alternativer for kontroll av vesicle størrelse ved å bruke ulike pore størrelse membraner. Blemmer etter ekstrudering er vanligvis litt større enn membran porestørrelse, men ved å øke antall ekstrudering sykluser, blemmer med en smalere størrelsesDistribusjon og en gjennomsnittlig størrelse nær porestørrelse membranen kan oppnås.
For å syntetisere funksjonelle protocells, må fettsyrer blemmer verten desinfisering skyldes innkapsling av RNA eller andre byggeblokker. Metoden tynnfilm rehydrering gir en enkel måte å skjemaet blemmer som inneholder ønsket innkapslede materialer. Men innkapsling effektiviteten er relativt lav og et stort utvalg av verdifulle materialer som RNA er vanligvis tapt under en renselsesprosess. I noen tilfeller kan innkapsling effektiviteten beskjedent forbedres ved gjentatte fryse-Tin sykluser før ekstrudering. Microfluidic metoder for høy avkastning utarbeidelse av phospholipid liposomer tillate nesten 100% innkapsling effektivitet, men tilsvarende metoder ikke har ennå blitt utviklet for fettsyrer blemmer.
Når håndtere protocells med sin natur chelated eller gratis Mg2 +, rensing etter magnesium løsning tillegg og repurification før hvert punkt sikrer fjerning av lekkasje innkapslet materiale som kan påvirke nøyaktigheten av reaksjon målinger i blemmer. Siden hver rensing tar minst 10 min å oppnå god separasjon og samle vesicle fraksjoner, analyse av raske reaksjoner er vanskelig, og reaksjonen må stoppes før kolonnen repurification.
Protokollen vi presenterer her er godt egnet for bygging av fettsyrer liposomer som vert reaksjoner etterligne de som måtte oppstå i primitive celler. Våre protokoller kan også potensielle anvendelser i utviklingen av biomedisinsk leveringssystemer og bioreaktorer for andre biokjemiske reaksjoner.
The authors have nothing to disclose.
J.W.S. er en etterforsker av Howard Hughes Medical Institute. Dette arbeidet var støttes delvis av en bevilgning (290363) fra Simons Foundation til J.W.S. Både A.E.E. og K.P.A. anerkjenner støtte fra University of Minnesota oppstart midler.
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |