Liposomer innehållande singel-kedjan amphiphiles, uppvisar särskilt fettsyror, distinkta egenskaper jämfört med de som innehåller diacylphospholipids på grund av enda kedja amphiphiles unika kemiska egenskaper. Här beskriver vi tekniker för förberedelse, rening och användning av liposomer består i del eller hela dessa amphiphiles.
Liposomer innehållande singel-kedjan amphiphiles, uppvisar särskilt fettsyror, distinkta egenskaper jämfört med dem som innehåller diacylphospholipids på grund av dessa amphiphiles unika kemiska egenskaper. I synnerhet förbättra fettsyra liposomer dynamiska karaktär, på grund av den relativt höga lösligheten av singel-kedjan amphiphiles. Liposomer innehållande fria fettsyror är likaså känsligare för salt och tvåvärda katjoner, på grund av de starka samspelet mellan karboxylsyra huvud grupper och metalljoner. Här visar vi tekniker för förberedelse, rening och användning av liposomer består delvis eller hela enda kedja amphiphiles (e.g., oljesyra syror).
Liposomer, eller blåsor – fack avgränsas av lipidens membran består av amfifila lipider – har funnit användning i många biomedicinska tillämpningar som leveransfordon för läkemedel, modeller av cellmembran, och för utvecklingen av syntetiska celler. Vi och andra har också anställt liposomer som modeller av primitiva cellmembran tidigt i livet. 1 , 2 , 3 , 4 vanligtvis i sådana system, vi anställer singel-kedjar amphiphiles som innehåller endast en lipid kolväte svans (t.ex., oljesyra), eftersom dessa molekyler är enklare att syntetisera utan förmånen av de kodade protein enzymer moderna celler anställa.
Liposomer består av singel-kedjan lipider är liknande de bildas från diacylphospholipids (t.ex.1-palmitoyl-2-oleoyl –sn– glycero-3-phosphocholine eller POPC) däri gränsen består av lipidens membran. Liposomer bildas från antingen klass av lipider kan kan behålla en upplöst nyttolast, och skalas ned och renas genom olika tekniker. Flera viktiga skillnader resultera från de unika kemiska egenskaperna för singel-kedjan lipider. Blåsor bildas av fosfolipider är stabil över ett brett pH-område, medan fettsyra blåsor bara är stabil vid neutralt till milt grundläggande pH (ca. 7-9), vilket kräver vissa pH-buffert för vesikler beredning. De flesta av tiden, kan denna buffert också innehålla specifika lösliga molekyler för vesikler inkapsling, som kan vara antingen funktionella material (t.ex., RNA) för konkurrensbetingat biokemiska reaktioner eller enkel fluorescerande färgämnen (t.ex., det calcein ) för vesikler karakterisering.
Förekomsten av endast en enda kolväte kedja producerar ett membran som är mer genomsläppliga för lösta ämnen, såväl som mer dynamisk. Dessutom den karboxylsyra huvud gruppen närvarande i fettsyror resulterar i blåsor som är mer känsliga för förekomsten av salt och tvåvärda katjoner (t.ex., Mg2 +). Magnesium är en av de viktigaste divalenta katjonerna för katalysera biokemiska reaktioner i protocells för livets ursprung studier. Tidigt i livet, innan utvecklingen av sofistikerade protein enzymer, kan RNA ha varit den dominerande polymeren, på grund av dess dubbla kapaciteten att själv replikera och utföra katalys. Ett representativt exempel på en magnesium-kräver RNA om reaktion är icke-enzymatiska RNA kopiering, först visat i 1960-talet. 5 när kemiskt aktiverat RNA nukleotider (dvs. 2-methylimidazolide nukleotider) binder till ett redan existerande primer-mall-komplex, 3′-hydroxylgruppen grundfärgens angriper det 5′-fosfatet av en intilliggande aktiverade monomer att tränga undan de lämnar gruppen (dvs. 2-metylimidazol), och bildar en ny phosphodiester bond. Detta RNA kopiering kemi kräver en hög koncentration av Mg2 +, som behöver vara kelaterat ska vara kompatibelt med fettsyra protocells. 6 en annan Mg2 +-beroende reaktion är som katalyseras av den hammerhead ribozyme, det är kanske bäst kännetecknas katalytiskt RNA. Detta ribozym, som kan beredas från två korta oligonukleotider, utför en self-klyvning reaktion som är bekvämt att övervaka genom en gel-SKIFT. Som sådan, är det ofta anställd som en modell ribozym i livets ursprung studier. 7 på grund av ett krav av denna ribozym för unliganded magnesium, liposomer är vanligtvis tillverkade av en blandning av fettsyror och glycerol fettsyreestrar, som är mer stabila till magnesium. 8 , 9 i detta protokoll, vi presenterar teknik vi har utvecklat för förberedelse, manipulation, karakterisering av dessa blåsor och demonstrera tillämpning av dessa blåsor som protocells till värd icke-enzymatiska RNA kopiering och hammerhead ribozyme katalys.
Liposomer bildas från fettsyror har föreslagits av många som potentiella modeller för primitiva celler på grund av sin höga permeabilitet och dynamiska egenskaper. Enda fettsyror karboxyl huvud gruppen bara självmontering in membran i en begränsad pH-område och de resulterande membran är ganska känsliga för förekomsten av salter. Som ett resultat, kräver fettsyra blåsor olika förberedelser och hantering metoder jämfört med fosfolipid blåsor.
I detta protokoll, även om vi använder oljesyra som ett exempel för Liposom bildandet, andra lång kedja, omättade fettsyror (C14) och deras derivat (ca. myristoleic syra, palmitoleic syra och de motsvarande alkoholerna och estrar av glycerol) också bilda blåsor efter metoden tunn film rehydrering så länge den totala lipid-koncentrationen är ovanför cmc och återfuktning buffert pH ligger nära pKa av fettsyran i membranet. Andra än tris-HCl buffert används i detta protokoll, rapporterades andra buffertsystem (ca. bicine, fosfat, Borat) att stödja fettsyra vesikler bildning, även blåsor bildas i fosfat eller Borat buffert är vanligtvis ganska läckande13. De resulterande fettsyra blåsor efter rehydrering är polydisperse och multilamellar, men kan lätt omvandlas till små monodisperse unilamellar blåsor av extrudering som beskrivs. Jämfört med ultraljudsbehandling som en alternativ metod för att generera små blåsor, ger extrudering fler alternativ för kontroll av vesikler storlek genom att tillämpa olika por storlek membran. Blåsor efter extrudering är vanligtvis något större än membran porstorlek, men genom att öka antalet extrudering cykler, blåsor med en smalare storlek distribution och en genomsnittlig storlek nära membran porstorlek kan erhållas.
För att syntetisera funktionella protocells, måste fettsyra blåsor värden specifika biokemiska reaktioner som följd av inkapsling av RNA eller andra byggstenar. Tunn film rehydrering metoden ger ett enkelt sätt att bilda blåsor som innehåller önskad inkapslade material. Dock inkapsling effektivitet är relativt låg och en stor del av dyrbara material såsom RNA förloras vanligtvis under reningsprocessen. I vissa fall kan inkapsling effektiviteten förbättras blygsamt genom upprepad frysning-tining cykler innan extrudering. Mikroflödessystem metoder för hög kapacitet beredning av fosfolipid liposomer tillåter nästan 100% inkapsling effektivitet, men liknande metoder inte har ännu utvecklats för fettsyra blåsor.
När hantering protocells med antingen kelaterade eller gratis Mg2 +, rening efter magnesium lösning tillägg och repurification innan varje tidpunkt garanterar avlägsnande av läckt inkapslade material som kan påverka precisionen av reaktionshastigheten mätningar inuti vesiklar. Eftersom varje rening tar minst 10 minuter att uppnå bra separation och samla vesikler fraktioner, analys av snabba reaktioner är svårt, och reaktionen måste stoppas innan kolumnen repurification.
Det protokoll som vi presenterar här är väl lämpad för byggandet av fettsyra liposomer som värd reaktioner härma dem som kan uppstå i primitiva celler. Våra protokoll kan också potentiella tillämpningar i utvecklingen av biomedicinska leveranssystem och bioreaktorer för andra biokemiska reaktioner.
The authors have nothing to disclose.
J.W.S. är en utredare för Howard Hughes Medical Institute. Detta arbete stöds delvis av bidrag (290363) från stiftelsen Simons till J.W.S. Både A.E.E. och K.P.A. bekräftar stödet från University of Minnesota start fonderna.
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |