Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Forberedelse, rensning og brug af fedtsyre-holdige Liposomer

doi: 10.3791/57324 Published: February 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Liposomer som indeholder single-kæde amphiphiles, udviser især fedtsyrer, forskellige egenskaber i forhold til disse indeholdende diacylphospholipids på grund af de unikke kemiske egenskaber af enkelt kæde amphiphiles. Her beskriver vi teknikker til fremstilling, rensning og brug af Liposomer bestod af en del eller hele af disse amphiphiles.

Abstract

Liposomer som indeholder single-kæde amphiphiles, udviser især fedtsyrer, forskellige egenskaber i forhold til dem, der indeholder diacylphospholipids på grund af de unikke kemiske egenskaber af disse amphiphiles. Især forbedre fedtsyre Liposomer dynamiske karakter, på grund af den relativt høje Opløselighed af single-kæde amphiphiles. Tilsvarende er Liposomer som indeholder frie fedtsyrer mere følsomme over for salt og divalent kationer, på grund af de stærke vekselvirkninger mellem carboxylsyre hoved grupper og metalioner. Her viser vi teknikker til fremstilling, rensning og brug af Liposomer bestod af en del eller hele enkelt kæde amphiphiles (fx, oliesyre syrer).

Introduction

Liposomer, eller blærer – rum afgrænset af tolagede membraner består af amphiphilic lipider - har fundet anvendelse i talrige biomedicinske anvendelser som levering køretøjer for lægemidler, modeller af cellemembraner, og udvikling af syntetisk celler. Vi og andre har også ansat Liposomer som modeller for primitive cellemembraner tidligt i livet. 1 , 2 , 3 , 4 typisk i sådanne systemer, vi ansætter single-kæde amphiphiles indeholder kun en lipid kulbrinte hale (fx, oliesyre), som disse molekyler er enklere at syntetisere uden gavn for kodede protein enzymer moderne celler ansætte.

Liposomer består af enkelt-kæde lipider er lig dem, dannet af diacylphospholipids (f.eks.1-palmitoyl-2-oleoyl -sn- glycero-3-phosphocholine, eller POPC) i, at grænsen er sammensat af tolagede membraner. Liposomer dannet fra enten klasse af lipider kan kan bevare en opløst nyttelast, og nedprioriteret og renset ved hjælp af forskellige teknikker. Flere vigtige forskelle skyldes de unikke kemiske karakteristika for single-kæde lipider. Vesikler dannet af fosfolipider er stabil over en bred pH interval, mens fedtsyre vesikler er kun stabilt på neutral til mildt grundlæggende pH (ca. 7-9), som kræver visse pH buffer for vesikel forberedelse. Det meste af tiden, kan denne buffer også indeholde specifikke opløselige molekyler til vesikel indkapsling, som kan være enten funktionelle materialer (fxRNA) for opdelte biokemiske reaktioner eller simpel fluorescerende farvestoffer (fx, calcein ) til vesikel karakterisering.

Tilstedeværelse af kun en enkelt kulbrinte kæde producerer en membran, der er både mere gennemtrængelig for opløste stoffer, såvel som mere dynamisk. Derudover carboxylsyre hoved gruppen i fedtsyrer resultater i blærer, der er mere følsomme over for tilstedeværelsen af salt og divalent kationer (fx, Mg2 +). Magnesium er et af de vigtigste divalent kationer for katalysere biokemiske reaktioner i protocells for oprindelsen af liv undersøgelser. Tidligt i livet, før udviklingen af avancerede protein enzymer, kan RNA have været den dominerende polymer, på grund af sin dobbelte kapacitet til selvstændig replikere og udføre katalyse. Et repræsentativt eksempel på en magnesium-kræver RNA relateret reaktion er ikke-enzymatiske RNA kopiering, første gang demonstreret i 1960 ' erne. 5 når kemisk aktiveret RNA nukleotider (dvs. 2-methylimidazolide nukleotider) binder sig til en allerede eksisterende primer-skabelon kompleks, 3'-hydroxyl gruppe af primeren angreb 5'-phosphatet af en tilstødende aktiveret monomer at fortrænge den forlader gruppen (dvs. 2-methylimidazole), og former en nye phosphodiester obligation. Denne RNA kopiering kemi kræver en høj koncentration af Mg2 +, som skal være Chelateret for at være kompatibel med fedtsyrer protocells. 6 en anden Mg2 +-afhængig reaktion er der katalyseret af hammerhead ribozym, som måske er de bedst karakteriserede katalytisk RNA. Denne ribozym, som kan være fremstillet af to korte oligonukleotider, udfører en self-kavalergang reaktion, der er praktisk til overvågning af en gel Skift. Som sådan, er det ofte ansat som model ribozymer i livets oprindelse undersøgelser. 7 på grund af et krav af denne ribozym for unliganded magnesium Liposomer er typisk opbygget af en blanding af fedtsyre og fedtsyre glycerol estere, som er mere stabilt at magnesium. 8 , 9 i denne protokol, vi præsenterer teknikker vi har udviklet i forberedelse, manipulation, karakterisering af disse vesikler og demonstrere anvendelsen af disse blærer som protocells til værten ikke-enzymatiske RNA kopiering og hammerhead ribozym katalyse.

Protocol

1. vesikel forberedelse

  1. Forberedelse af tynde film
    1. Bruge gas tight sprøjter overføre visse beløb af lipider, som beskrevet i tabel 1.1 til chloroform i et hætteglas.
    2. Resulterende inddampes under en strøm af nitrogen eller argon i stinkskab.
    3. Underlagt den resulterende tynd film house vakuum i mindst 2 timer til at fjerne enhver chloroform rester. Lipid kan stå under vakuum natten på dette punkt.
  2. Rehydrering af vesikler
    1. Forberede 10 mL af 5 mM calcein 250 mM tris-HCl pH 8.0 hydrering buffer ved at opløse 31 mg af calcein pulver i 2,5 mL 1 M tris-HCl pH 8.0 buffer og tilføje en anden 7,5 mL deioniseret vand (DI) vand.
    2. Der afpipetteres 250 µL af ovenfor hydrering buffer i en tomme rør og tilføje 1.875 µL af 10 M NaOH for en endelige 75 mM base (½ svarende til samlede fedtsyrer). Opløsningen overføres til den tynde film af tørre lipid til form vesikler samlede lipid koncentration på 0,15 M.
    3. Brug højhastighedstog (> 3000 rpm) vortexer til vortex den resulterende blanding for 4-5 s.
    4. Forlade lipid-buffer blandingen på en lav hastighed (ca. 30 rpm) roterende shaker at rehydrere, mindst natten over.
  3. Dimensionering af vesikler (valgfri)
    1. Med pincet, anvende et filter støtte til hver indvendige overflade af ekstruder sprøjte havne.
    2. Våd hver filter støtte med 250 mM tris-HCl, pH 8.
    3. Brug af pincet, anvende en track-ætset 100 nm polycarbonat membran på en ekstruder O-ringe og filtrere understøtter. Pasning til ikke rive eller punktere membranen, forsigtigt skubbe membranen i O-ring for at skabe god kontakt mellem de to flader.
    4. Samle ekstruder, pas på ikke for at fortrænge membranen og filter understøtter.
    5. Fyld en ekstruder sprøjte med ca. 0,5 mL 250 mM tris-HCl, pH 8. Indsæt denne sprøjte i den ene side af ekstruder.
    6. Indsæt en tom sprøjte i anden siden af ekstruder.
    7. I hånden, skubbe stemplet sprøjte indeholdende buffer langsomt (≤ 50 µL/s), og kontroller, at modstand er følte, der angiver den spor-ætset membran er på plads og intakt. Det er nyttigt at øve dette trin uden en membran i stedet for at måle det forventede niveau for resistens.
    8. Fjerne og tømme de to sprøjter. Det er ikke nødvendigt at rense de to sprøjter i denne fase, da de indeholder buffer af identisk sammensætning til Liposom forberedelse.
    9. Indlæse Liposom forberedelse i en af de to sprøjter.
    10. Saml ekstruder med sprøjte indeholdende vesikel prøve på venstre side og tomme sprøjte på højre side.
    11. I hånden, skubbe stemplet sprøjte indeholdende vesikel prøve meget langsomt (10-25 µL/s).
    12. Omhyggeligt observere sprøjte på højre side af ekstruder; klart buffer træder i første omgang i højre side af ekstruder (ca. 50 µL, dette skyldes at den indre dødvolumen ekstruder), efterfulgt af en lille plume af ekstruderet Liposomer. Straks stoppe med at skubbe på dette tidspunkt, fjerne sprøjten på højre side af ekstruder, og skille sig af med denne løsning.
    13. Erstatte sprøjten på højre side af ekstruder og presse indtil venstre sprøjten er tom.
    14. Vende retningen af ekstruder, og Gentag trin 13. Fortsæt til det ønskede antal cyklusser (typisk 7, 9 eller 11); et ulige antal bruges altid til at sikre un-ekstruderet Liposomer ikke er indsamlet fra sprøjten i første omgang indeholdende pre reduktions Liposom forberedelse.
    15. Forsigtigt dispensere indholdet af den rigtige sprøjte ind i en Eppendorf-rør og Læg røret på en lav hastighed (ca. 30 rpm) roterende shaker til omkring 0,5 h.
    16. Fortsæt med vesikel rensning, som beskrevet i afsnit 2. Ekstruderet vesikler bør anvendes inden for 24 timer eller re ekstruderet før næste gang brug.

2. vesikel rensning

  1. Forberedelse af vesikel rensning Mobil fase
    1. Forberede 5 mL 250 mM tris-HCl pH 8 hydrering buffer ved tilsætning af 1,25 mL 1 M tris-HCl pH 8 buffer, 3,75 mL Deioniseret vand til en 15 mL Falcon tube. Derefter tilføje 37,5 µL af 10 M NaOH (½ svarende til base i forhold til unesterified fedtsyre) til hydrering buffer. Der afpipetteres 235 µL af ren oliesyre direkte i Falcon røret resulterer en vesikel løsning med 0,15 M samlede indhold af lipider.
    2. Brug højhastighedstog (> 3000 rpm) vortexer til vortex blanding for 4-5 s, derefter tumler på en lav hastighed roterende shaker i mindst 2 timer. Lipid forberedelse kan stå natten over på den roterende shaker på dette punkt. Filtrere den mobile fase gennem 0,22 μm sprøjte filterenhed før brugen for at fjerne enhver potentiel aggregater.
  2. Rensning af vesikler på Sepharose
    1. Fjerne ca. 5 mL af ethanoliske Sepharose 4B gylle fra flasken ved hjælp af en pipette. Gælde dette for en engangs 10 mL kromatografi kolonne.
    2. Tillad gylle at bosætte sig og ethanol-gennemstrømnings indtil ethanol nærmer sig toppen af harpiks seng.
    3. Anvende 5 mL deioniseret vand til toppen af harpiks og lad gennemstrømnings at vaske væk ethanol rester.
    4. Anvende 250 mM tris-HCl, pH 8 i 1-2 mL portioner til toppen af harpiks, anvende en ny portion hver gang den flydende niveau nærmer sig toppen af harpiks seng. Gentag for 3 - 5 gange.
    5. Klemme kolonnen på retorten stå, så Tilslut spidsen af kolonne med stophane stik og slanger til brøkdel opkøber. Tilføje en anden del af buffer til at skylle slangen, lukke hanen når væskeniveau i kolonne nærmer sig toppen af harpiks.
    6. Anvende de ekstruderet vesikler fra afsnit 1 til toppen af harpiks, der bruger en 200 µL pipette, at tage sig til at anvende vesikel forberedelse så jævnt som muligt til harpiks, uden at røre harpiks seng eller kolonnen væggen.
    7. Åbne hanen for at begynde flowet og begynde at indsamle fraktioner til en 96-brønd plade. Anvende vesikel rensning Mobil fase til toppen af harpiks sengen i 0,5-1 mL portioner som bufferen udtømmer, pas på ikke for at tillade harpiks sengen til at tørre ud. Indsamle i fem-drop fraktioner, indsamle mindst 36 brønde (tre rækker af en 96-brønd plade).
  3. Fluorescens karakterisering af rensning fraktioner
    1. Tage den 96-brønd plade fra forrige afsnit og læse det på en Pladelæser (λex= 485 nm, λem= 515 nm).
    2. Afbilde de resulterende fluorescens data som fluorescens vs brøkdel nummer. Vesikler elueres først, efterfulgt af den unencapsulated fraktion (figur 1).
  4. Repurification af vesikler at overvåge vesikel lækage
    1. Gentag trinene oprensning og karakterisering i afsnit 2.2 og 2.3. Blærer, som har bevaret deres indhold vil udstille ingen top af unencapsulated opløst stof (eller en meget lille en på ca. 5-10% af intensiteten af vesikel peak).

3. brug af vesikler i overværelse af Magnesium

  1. Brug af unliganded magnesium
    1. Forberede og rense blærer, som beskrevet i afsnit 1, 2.1 og 2.2.
    2. Forberede 1 mL 50 mm MgCl2 løsning i 250 mM tris-HCl pH 8.0 buffer ved at tilføje 250 µL 1 M tris-HCl pH 8.0 buffer og 50 µL 1 M MgCl2 700 µL af DI vand. Vortex at blande godt.
    3. For at give den ønskede magnesiumkoncentrationen 5 mm, bland 0,9 mL renset vesikler og 100 µL af magnesium løsning og omrøres hurtigt for at minimere vesikel forstyrrelser ved forbigående påvirkning af vesikler til høj lokal koncentration af magnesium.
      Bemærk: Hurtig sammenblanding af magnesium løsning er afgørende for vesikel stabilitet. Hvis magnesium og vesikler ikke er hurtigt mixet af umiddelbare vortexing, vil nogle blærer blive udsat for højere koncentrationer af magnesium, hvilket resulterer i inkonsistente resultater fra prøve til prøve.
    4. Forlade vesikel prøven på en tørretumbler i mindst 30 min. før repurification, som beskrevet i punkt 2.4 hen til indskrive nemlig indholdet lækage. Tilføje den samme koncentration af magnesium som vesikel prøve til repurification Mobil fase.
  2. Brug af liganded magnesium
    1. Forberede og rense blærer, som beskrevet i afsnit 1, 2.1 og 2.2.
      Bemærk: Brug ½ tilsvarende KOH i stedet for NaOH til deprotonate fedtsyrer; Det er blevet konstateret, at dette giver mere stabile Liposomer i chelaterede MgCl2 systemer.
    2. Forberede 2M kalium citratopløsning og justere pH til 8,0 med KOH.
    3. Premix MgCl2 og kalium citrat på den angivne ratio (ca. 1:4 for stabilt oliesyre vesikler) i 250 mM tris-HCl pH 8.0 buffer.
    4. Tilføje forblandet magnesium citratopløsning til eksemplet vesikel, kort vortex.
      Bemærk: Altid premix magnesium og ligand løsning. Udsæt aldrig vesikler til unchelated magnesium løsning alene.
    5. Forlade vesikel prøven på en tørretumbler i mindst 30 min. før repurification, som beskrevet i punkt 2.4. Tilføje den samme koncentration af magnesium og citrat som i eksemplet vesikel til repurification Mobil fase.

4. ikke-enzymatiske RNA kopiering i blærer

  1. Forberedelse af monodisperse RNA indkapslet vesikler
    1. Forberede en tør oliesyre film, som beskrevet i afsnit 1.1.
    2. Forberede vesikel rehydrering buffer med 50 µM fluorescerende mærket RNA primer, 150 µM RNA skabelon og 250 mM tris-HCl pH 8.0 indeholder ½ tilsvarende KOH i forhold til oliesyre.
    3. Tilføje 250 µL af rehydrering buffer til filmens lipid og følg trin 1.2.2 og 1.2.3 at gøre vesikler med samlede 0,15 M lipid koncentration.
    4. For at gøre små unilamellar monodisperse vesikler, Følg punkt 1.3 for vesikel ekstrudering.
  2. Magnesium citrate tilsætning og vesikel rensning
    1. Premix magnesium og citrat bestande, og derefter blande det med vesikel prøve til en afsluttende lipid koncentration af 0,1 M.
    2. Rense vesikler på Sepharose 4B størrelse udstødelse kolonne, med 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0,1 M lipider og magnesium og citrat som mobil fase.
    3. Indsamle vesikel fraktioner af følgende punkt 2.3.
  3. Primer udvidelse reaktion
    1. Forberede 200 mM 2-MeImpG (Guanosinmonofosfat 5'-monophosphate 2-methylimidazolide) stamopløsning med 250 mM tris-HCl pH 8.0. (Bemærk: Følg tidligere offentliggjort protokol10 for 2-MeImpG syntese.)
    2. At indlede primer udvidelse reaktion, overføre 150 µL af 2-MeImpG stamopløsning til 450 µL vesikel prøve at nå frem til en endelig koncentration på 50 mM og 75 mM lipid aktiveret monomer. Start timeren og holde reaktionen sample tumbling hele tiden.
    3. (Valgfrit) For løbende friske monomer fodring, overføre 300 µL af reaktion løsning til en afdeling af en lab bygget små-volumen Liposom dialyzer11 og læg 300 µL fodring løsning i andet kammeret. Den fodring løsning bør indeholde alle ingredienser i den samme koncentration som i reaktion løsning, bortset fra udskiftning af RNA indeholdende vesikler med tomme vesikler. Hver runde af dialyse tager 1-24 h, afhængigt af den pågældende analysand og membran bruges.
    4. For kinetiske undersøgelser, tage en 100 µL alikvot på hvert tidspunkt, og repurify alikvot gennem en Sepharose 4B størrelse udstødelse kolonne med 250 mM tris-HCl pH 8.0 som den mobile fase.
    5. Indsamle vesikel fraktioner i 1,5 mL eppendorf rør.
    6. Afpipetteres Triton til vesikel fraktioner til en endelig omkring 0,1% v/v.
    7. Tilsæt 0,5 mL koldt ethanol til røret og inkuberes ved-20 ° C i mindst 2 timer.
    8. Alle prøver på 16,1 × 1000 der centrifugeres genbrugsfibre (16,1 × g) til 10 min og forsigtigt pipette ud væsker. Vask RNA pellets med 70% kolde ethanol og centrifugeres igen i 5 min. skille sig af med væsken og lægge røret med RNA pellets på en 80 ° C varme blok for 2 min til at fordampe resterende ethanol. Opløse pellets i 50 µL af 8 M urinstof med 1xTBE loading bufferen.
  4. SIDERS analyse
    1. Forberede 20% siden gel ved at blande 200 mL af UreaGel system koncentrat, 25 mL af UreaGel system fortyndingsmiddel, 25 mL af 10xTBE buffer, 80 µL af TEMED og 250 mg af ammonium persulfat. Hurtigt hæld gel blandingen mellem fastspændt gel plader (35 cm × 45 cm) og indsætte kammen. Vent i mindst 30 min. indtil komplet polymerisering.
    2. Samle gelpladen på gel fod og udfylde boksene gel med 1xTBE gel kører buffer. Tag kammen og tømme brøndene med sprøjten. Pre-opstille gel med 60 W i 30 min.
    3. Varme prøver på 80 ° C varme blok for 2 min og indlæse 5 µL af hver prøve pr. brønd.
    4. Tænd gel strømforsyning og Indstil gel kører med konstant watt på 60 W for 2,5 h.
    5. Skil gelpladen fra gel stå, tørre rene glas og sætte hele pladen i gel scanner at starte gel scanningen.
    6. Kvantificere gel med ImageQuant TL 1D analyse. Afbilde den naturlige logaritme til forholdet mellem mængden af primer resterende på et givet tidspunkt til det oprindelige beløb af primer vs tid, passer til en linje, og beregne pseudo første ordre reaktionshastigheden (figur 2).

5. hammerhead RNA Self kavalergang i blærer

  1. Forberedelse og rensning af ribozym indkapslet i blærer
    1. Forberede en lipid tynd film (OA: GMO = 9:1) som i afsnit 1.1 med komponenter som i tabel 1.2. Bemærk: varm GMO til mindst 60 ° C til fuldstændig smeltning før brug.
    2. Forberede vesikel rehydrering buffer med 5 µM hver hammerhead ribozym strand og 250 mM tris-HCl pH 8.0.
    3. Tilføje 250 µL af rehydrering buffer til filmens lipid og følg trin 1.2.2 og 1.2.3 at gøre vesikler med 0,15 M total lipid koncentration.
    4. For at gøre små unilamellar monodisperse vesikler, Følg punkt 1.3 for vesikel ekstrudering.
    5. Rense vesikler på en Sepharose 4B størrelse udstødelse kolonne, med 250 mM tris-HCl pH 8.0, 0,15 M blandet lipider som mobil fase.
  2. Hammerhaj ribozym self-kavalergang reaktion
    1. Forberede magnesium løsning og bland med renset blærer, som beskrevet i afsnit 3.1 at indlede self-kavalergang reaktion.
    2. For kinetiske undersøgelser, tage 100 µL af blandingen på hvert tidspunkt og direkte repurify denne delprøve gennem en Sepharose 4B størrelse udstødelse kolonne med 250 mM tris-HCl pH 8.0 som mobil fase. Indsamle vesikel brøkdel.
  3. SIDERS analyse
    1. Følg trin 4.3.6 til 4.3.8 for at forberede RNA lastning prøve.
    2. Placer kommercielt støbt 15% TBE-Urea gel i gel boks og udfylde boksen gel med 1xTBE gel kører buffer.
    3. Varme prøver på 80 ° C varme blok for 1 min og indlæse 5 µL af hver prøve pr. brønd.
    4. Kør gelen med konstant 200 V for omkring 1 h.
    5. Skan gel.
    6. Kvantificere gel med en analyse software, ligesom ImageQuant TL 1D, til at måle omfanget af kavalergang ved at sammenligne intensiteten af resterende substrat RNA band og kløvet RNA fragment band (figur 3).

6. kæmpe fedtsyre vesikler til mikroskopi

  1. Forberedelse af gigantiske fedtsyre vesikler
    1. Følg punkt 1.1 og tabel 1.3 at forberede en oliesyre tyndfilm med 0,2 mol % af fluorescently mærket lipid for bedre membran observation.
    2. Rehydrere lipid film med 500 µL 250 mM tris-HCl pH 8.0 til gøre vesikel prøve 10 mM lipider i alt. Bufferen kan indeholde fluorescerende farvestoffer eller RNA molekyler, hvis det ønskes. Forlade vesikel prøve tumbling natten over.
    3. Forberede 150 mL ren fedtsyre dialyse buffer med 10 mM samlede indhold af lipider ved at blande 470 µL af oliesyre og 150 mL 250 mM tris-HCl pH 8.0 indeholder ½ tilsvarende NaOH.
    4. Presse vesikel prøven gennem en 10 µm polycarbonat membran til at fjerne store aggregater.
    5. Overføre vesikel prøven i 1 µm store pore dialyse kassette, som tidligere beskrevet. 12
    6. Placer dialyse kassette i et 100 mL bægerglas indeholdende 30 mL dialyse buffer. Agitere bægerglas forsigtigt på en tabel-top shaker på 80-100 rpm.
    7. Ændre dialyse buffer hvert 30 min til 5 gange for at fjerne frie farvestoffer eller RNA og små vesikler.
    8. Fjern forsigtigt vesikel prøven fra dialyse kassette med en sprøjte og overførsel til en Eppendorf-rør.
  2. Mikroskopi Observation
    1. Tilsæt 10 µL af vesikler på en ren standard objektglas og placere et glas dækning glide over prøven. Seal dække glas med gennemsigtig neglelak.
    2. Observere vesikler med en 60 X olie-spredning eller lignende mål af Konfokal mikroskopi ved hjælp af passende Laserkilde til fluorescently mærket membran, RNA eller indkapslede farvestof (figur 4).

Representative Results

Vi udfører typisk Liposom purifications på størrelse-udelukkelse kolonner. Typiske Liposom præparater indeholder en fluorophore af en slags. Når Liposomer er genereret og ekstruderet, er arter at være indkapslet til stede både i og uden for Liposomer. Ved at rense Liposomer på en størrelse-udelukkelse harpiks (Sepharose 4B), bevares unencapsulated opløste stoffer inden for porer af harpiks, mens de større Liposomer er ikke og elueres første (figur 1A). Indsamling fraktioner og plotte fluorescens vs brøkdel nummer (figur 1B) typisk giver en to-peak spor, med de tidlige eluerer fraktioner svarende til Liposomer, der derefter indsamles og anvendes i efterfølgende ansøgninger.

Vi undersøger ofte nonenzymatic primer udvidelse reaktioner, som var et sandsynligt middel til RNA replikering før fremkomsten af ribozymer og protein-baserede RNA polymeraser. Disse reaktioner anvender typisk en fluorescently mærket primer (figur 2A), som er udvidet med aktiveret monomerer. Disse reaktioner kan overvåges af gelelektroforese (figur 2B) og den resulterende elektroferogrammer integreret for at opnå sats konstanter for en given reaktion tilstand (figur 2 c).

For at demonstrere, at RNA kunne fungere inde i protocells, ansætter vi hammerhead ribozym self-spaltning (figur 3A) som model RNA katalytisk reaktion. Denne reaktion kræver gratis Mg2 + at lette katalyse, og derfor vi brugte OA/GMO vesikler, da de er stabile i overværelse af 5 mM Mg2 +. Lig primer udvidelse reaktioner, Hammerhaj ribozym self-kavalergang reaktion kan også være overvåget af gelelektroforese (figur 3B) og senere analyseret for at erhverve konstanten under særlige betingelser (figur 3 c).

Vi image Liposomer beskæftiger både fluorescens og gennemfaldende lys. Liposomer kan mærkes ved hjælp af fluorescerende lipider, som giver en membran etiket (figur 4A), eller en fluorescerende opløst inden for deres lumen (figur 4B). Gennemlysning kan også bruges til at observere vesikler (også vist i figur 4B).

Tabel 1.1 pure oliesyreindhold i chloroform
Komponent Stock Beløb
Oliesyre > 99% 11.7 ΜL
Chloroform 1 mL
Tabel 1.2 oliesyre og glycerol monooleate (9:1) i chloroform
Komponent Stock Beløb
Oliesyre > 99% 10.5 ΜL
Glycerol monooleate > 99% 1.4 ΜL
Chloroform 1 mL
Tabel 1.3 oliesyre med 0.2mol% rodamin-PE i chloroform
Komponent Stock Beløb
Oliesyre > 99% 1.6 ΜL
Rodamin-PE i chloroform 10 mM 20 ΜL
Chloroform 1 mL

Tabel 1. Fedtsyre chloroform løsninger.

Figure 1
Figur 1. Vesikel rensning og fluorescens karakterisering af rensning brøkdel. A. adskillelse af vesikler indeholdende calcein fra gratis calcein på en Sepharose 4B kolonne. B. vesikel og gratis calcein peak påvisning af plotte fluorescens i hver brønd vs godt nummer efter brøkdel samling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Ikke-enzymatiske RNA replikering inde OA vesikler. A. ordning af ikke-enzymatiske RNA primer forlængelse. B. sidebillede af en primer udvidelse reaktion inde ren oliesyre vesikler, med betingelser som i punkt 4. C. lineær passer af den naturlige logaritme til forholdet mellem mængden af primer resterende på givet tidspunkt til det oprindelige beløb af primer vs tid over 30 h. reaktionshastigheden, beregnet fra hældningen af ln (P/P0) vs tid, er 0.058 h-1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Hammerhaj ribozym kavalergang i OA/GMO vesikler. A. ordning af hammerhead ribozym spaltning af fluorescently mærket substrat strand (øverst). B. sidebillede af hammerhead ribozym kavalergang inde OA/GMO vesikler med 5 mM Mg2 +. C. ribozym aktivitet inde vesikler. Lineær pasform af naturlige logaritme til forholdet mellem mængden af substrat resterende på givet tidspunkt til det oprindelige beløb af substrat vs tid i første 4 h. reaktion sats, beregnes ud fra ln (s/s0) vs tid, hældning er 0,36 h-1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Kæmpe fedtsyre vesikler til mikroskopi. A. Konfokal mikroskopi billede af en rodamin PE mærket oliesyre vesikel, skala bar 10 μm. B. Konfokal mikroskopi billede af oliesyre vesikel indeholdende Alexa488 mærket RNA med membran vist i overførte detektor (TD) kanal, skala bar 5 μm.

Discussion

Liposomer dannet fra fedtsyrer er blevet foreslået af mange som mulige modeller for primitive celler på grund af deres høje permeabilitet og dynamiske egenskaber. Enkelt kæde fedtsyrer carboxylic hoved gruppen kun tillader samlesæt til membraner i en begrænset pH interval, og de resulterende membraner er meget følsomme over for tilstedeværelsen af salte. Som et resultat, kræver fedtsyre vesikler forskellige forberedelse og håndtering af metoder i forhold til phospholipid vesikler.

I denne protokol, selv om vi bruger oliesyre som forbillede for Liposom dannelse, andre lange kæde umættede fedtsyrer (C14) og derivater deraf (ca. myristoleic syre, palmitoleic syre, og de tilsvarende alkoholer og estere, glycerol) også danne blærer efter tyndfilm rehydrering metode, så længe den samlede lipid koncentrationen er over cmc og hydrering buffer pH er tæt på pKa fedtsyre i membranen. Andre end tris-HCl buffer anvendes i denne protokol, blev andre buffersystemer (ca. bicine, fosfat, Borat) rapporteret at støtte fedtsyre vesikel dannelsen, selvom vesikler dannet i fosfat eller Borat buffer er normalt ret utæt13. De resulterende fedtsyre vesikler efter rehydrering er polydisperse og multilamellar, men er let konverteres til små monodisperse unilamellar blærer ved ekstrudering, som beskrevet. Sammenlignet med sonikering som en alternativ metode til at generere små blærer, giver ekstrudering flere muligheder for kontrol af vesikel størrelse ved at anvende forskellige pore størrelse membraner. Vesikler efter ekstrudering er som regel lidt større end membran porestørrelse, men ved at øge antallet af ekstrudering cyklusser, vesikler med en smallere størrelse distribution og en gennemsnitlig størrelse tæt på membranen porestørrelse kan opnås.

For at syntetisere funktionelle protocells, skal fedtsyre vesikler vært specifikke biokemiske reaktioner som følge af indkapsling af RNA eller andre byggesten. Tyndfilm rehydrering metode giver en nem måde at form vesikler indeholdende ønskede indkapslede materialer. Men indkapsling effektivitet er relativt lav og en stor del af kostbare materialer såsom RNA er typisk tabt i rensningsprocessen. I nogle tilfælde kan indkapsling effektiviteten forbedres beskedent ved gentagne fryse-tø cykler inden ekstrudering. Mikrofluid metoder til højtydende forberedelse af fosfolipid Liposomer mulighed for næsten 100% indkapsling effektivitet, men lignende metoder ikke har endnu blevet udviklet for fedtsyre vesikler.

Da håndtering protocells med enten chelaterede eller gratis Mg2 +, rensning efter magnesium løsning ud og repurification før hvert tidspunkt sikrer fjernelse af lækket indkapslet materiale, der kan påvirke nøjagtigheden af reaktionshastigheden målinger inde vesikler. Da hver rensning tager mindst 10 min. til at opnå god adskillelse og samle vesikel fraktioner, analyse af hurtige reaktioner er vanskelig, og reaktionen skal stoppes før kolonne repurification.

Den protokol, vi præsenterer her er velegnet til opførelse af fedtsyre Liposomer, der fungerer som værter reaktioner efterligne dem, der kan opstå i primitive celler. Vores protokoller også aktivere potentielle anvendelser i udviklingen af biomedicinske fremføringsmidler og bioreaktorer til andre biokemiske reaktioner.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

J.W.S. er en Investigator af Howard Hughes Medical Institute. Dette arbejde blev støttet i en del af en bevilling (290363) fra Simons Foundation til J.W.S. Både A.E.E. og K.P.A. anerkender støtte fra University of Minnesota start midler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sephorose 4B SIGMA-ALDRICH INC 4B200
calcein SIGMA-ALDRICH INC C0875-10G
tris-HCl pH8.0 1M LIFE TECHNOLOGIES CORP AM9851
citric acid SIGMA-ALDRICH INC 251275-500G
sodium hydroxide SIGMA-ALDRICH INC 71690-250G
potassium hydroxide Sigma 30614
oleic acid Nu-Chek U-46-A
glycerol monooleate Nu-Chek M-239
Liss Rhodamine-PE LIFE TECHNOLOGIES CORP L1392
magnesium chloride Fisher/Thermo Fisher Scientific AM9530G
sequagel concentrate National Diagnostics EC-830
sequagel DILUENT National Diagnostics EC-840
15% TBE-UREA GEL Thermo Fisher Scientific EC68852BOX
urea Sigma Aldrich U6504-500G
titon-100x SIGMA-ALDRICH INC T9284-100ML
RNA primer IDT 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA template IDT 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
hammerhead substrate strand IDT 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
hammerhead ribozyme strand IDT 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
vesicle extruder set AVANTI POLAR LIPIDS 610000
fraction collector Gilson, Inc. 171041
96-well plates Fisher NC9995941/675
plate reader Molecular Devices SpectraMax i3
confocal microscope Nikon Nikon A1R MP Confocal
gel scanner GE Healthcare Life Sciences Typhoon 9410 scanner

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanczyc, M. M., Fujikawa, S. M., Szostak, J. W. Experimental Models of Primitive Cellular Compartments: Encapsulation, Growth, and Division. Science. 302, 618-622 (2003).
  2. Mansy, S. S., Schrum, J. P., Krishnamurthy, M., Tobé, S., Da Treco,, Szostak, J. W. Template-directed synthesis of a genetic polymer in a model protocell. Nature. 454, (7200), 122-125 (2008).
  3. Apel, C. L., Deamer, D. W., Mautner, M. N. Self-assembled vesicles of monocarboxylic acids and alcohols: conditions for stability and for the encapsulation of biopolymers. Biochim. Biophys. Acta. 1559, (1), 1-9 (2002).
  4. Walde, P., Wick, R., Fresta, M., Mangone, A., Luisi, P. L. Autopoietic Self-Reproduction of Fatty Acid Vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116, (26), 11649-11654 (1994).
  5. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E., Todd Miles, H. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadenylates on a Polyuridylic Acid Template. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 59, (3), 726-733 (1967).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic template-directed RNA synthesis inside model protocells. Science. 342, (6162), Science. New York, N.Y. 1098-1100 (2013).
  7. Uhlenbeck, O. C. A small catalytic oligoribonucleotide. Nature. 328, (6131), 596-600 (1987).
  8. Chen, I. A., Salehi-Ashtiani, K., Szostak, J. W. RNA catalysis in model protocell vesicles. J. Am. Chem. Soc. 127, (38), 13213-13219 (2005).
  9. Adamala, K. P., Engelhart, A. E., Szostak, J. W. Collaboration between primitive cell membranes and soluble catalysts. Nat. Commun. 7, 1-7 (2016).
  10. Joyce, G. F., Inoue, T., Orgel, L. E. RNA Template-directed Synthesis on Random Copolymers. J. Mol. Biol. 176, 279-306 (1984).
  11. Adamala, K., Engelhart, A. E., Kamat, N. P., Jin, L., Szostak, J. W. Construction of a liposome dialyzer for the preparation of high-value, small-volume liposome formulations. Nat. Protoc. 10, (6), 927-938 (2015).
  12. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Preparation of large monodisperse vesicles. PloS one. 4, (4), e5009 (2009).
  13. Zhu, T. F., Budin, I., Szostak, J. W. Vesicle extrusion through polycarbonate track-etched membranes using a hand-held mini-extruder. Methods Enzym. 533, Elsevier Inc. (2013).
Forberedelse, rensning og brug af fedtsyre-holdige Liposomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).More

Jin, L., Engelhart, A. E., Adamala, K. P., Szostak, J. W. Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes. J. Vis. Exp. (132), e57324, doi:10.3791/57324 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter