Liposomes युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles, विशेष रूप से फैटी एसिड, एक श्रृंखला amphiphiles के अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण diacylphospholipids युक्त उन लोगों की तुलना में विशिष्ट गुणों का प्रदर्शन । यहां हम तैयारी, शुद्धि, और भाग या इन amphiphiles के पूरे में शामिल liposomes के उपयोग के लिए तकनीक का वर्णन ।
Liposomes युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles, विशेष रूप से फैटी एसिड, इन amphiphiles के अद्वितीय रासायनिक गुणों के कारण diacylphospholipids युक्त उन लोगों की तुलना में अलग गुण दर्शाते हैं । विशेष रूप से, फैटी एसिड liposomes गतिशील चरित्र में वृद्धि, एकल श्रृंखला amphiphiles के अपेक्षाकृत उच्च घुलनशीलता के कारण । इसी प्रकार, liposomes युक्त मुक्त फैटी एसिड अधिक नमक और divalent cations के प्रति संवेदनशील हैं, carboxylic एसिड सिर समूहों और धातु आयनों के बीच मजबूत बातचीत के कारण । यहां हम तैयारी, शुद्धि के लिए तकनीक का वर्णन, और भाग या एकल श्रृंखला amphiphiles के पूरे में शामिल liposomes का उपयोग करें (उदा., ओलिक एसिड) ।
Liposomes, या बुलबुले-bilayer amphiphilic लिपिड के शामिल झिल्ली से घिरा डिब्बों फार्मास्यूटिकल्स, सेल झिल्ली के मॉडल के लिए प्रसव के वाहनों के रूप में कई जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोग मिला है, और सिंथेटिक के विकास के लिए कोशिकाओं. हम और दूसरों को भी प्रारंभिक जीवन में आदिम कोशिका झिल्ली के मॉडल के रूप में liposomes कार्यरत है । 1 , 2 , 3 , 4 आमतौर पर, ऐसी प्रणालियों में, हम केवल एक लिपिड हाइड्रोकार्बन पूंछ (जैसे, ओलिक एसिड) युक्त एकल श्रृंखला amphiphiles को रोजगार, के रूप में इन अणुओं कोडित प्रोटीन एंजाइमों आधुनिक कोशिकाओं के लाभ के बिना संश्लेषित करने के लिए सरल कर रहे है रोजगार ।
Liposomes एकल श्रृंखला लिपिड के शामिल diacylphospholipids से गठित उन लोगों के लिए समान हैं (जैसे, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, या POPC) कि सीमा bilayer झिल्ली से बना है. Liposomes लिपिड के या तो वर्ग से गठित एक भंग पेलोड बनाए रखने कर सकते हैं, और आकार छोटा और विभिंन तकनीकों से शुद्ध किया जा सकता है । कई महत्वपूर्ण मतभेद एकल श्रृंखला लिपिड के अद्वितीय रासायनिक विशेषताओं से परिणाम । फॉस्फोलिपिड द्वारा गठित बुलबुले एक व्यापक पीएच रेंज पर स्थिर हैं, जबकि फैटी एसिड बुलबुले तटस्थ में हल्के बुनियादी पीएच (ca. 7-9) के लिए ही स्थिर हैं, जो पुटिका तैयारी के लिए कुछ पीएच बफर की आवश्यकता है । समय के अधिकांश, इस बफर भी पुटिका encapsulation के लिए विशिष्ट घुलनशील अणुओं को शामिल कर सकते हैं, जो या तो कार्यात्मक सामग्री (जैसे, आरएनए) compartmentalized जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं या सरल फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे, calcein के लिए हो सकता है ) पुटिका लक्षण वर्णन के लिए ।
केवल एक एकल हाइड्रोकार्बन श्रृंखला की उपस्थिति एक झिल्ली है कि दोनों solutes को और अधिक पारगंय है, साथ ही अधिक गतिशील पैदा करता है । इसके अतिरिक्त, carboxylic एसिड सिर के बुलबुले में फैटी एसिड परिणाम में मौजूद समूह है कि और अधिक नमक और divalent cations की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील है (जैसे,2 मिलीग्राम +) । मैग्नीशियम की उत्पत्ति के लिए protocells में catalyzing जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए सबसे महत्वपूर्ण divalent cations में से एक है जीवन अध्ययन । प्रारंभिक जीवन में, परिष्कृत प्रोटीन एंजाइमों के विकास से पहले, आरएनए प्रमुख बहुलक हो सकता है, अपनी दोहरी क्षमता के कारण स्वयं को दोहराने और प्रदर्शन catalysis. एक मैग्नीशियम की आवश्यकता होती है आरएनए संबंधित प्रतिक्रिया के एक प्रतिनिधि उदाहरण गैर एंजाइमी आरएनए नकल है, पहले 1960 के दशक में प्रदर्शन किया । 5 जब रासायनिक आरएनए न्यूक्लियोटाइड (यानी 2-methylimidazolide न्यूक्लियोटाइड) एक मौजूदा प्राइमर टेम्पलेट जटिल करने के लिए बाइंड, 3 ‘-हाइड्रॉक्सिल समूह प्राइमर हमलों के 5 ‘-फॉस्फेट एक आसंन सक्रिय मोनोमर के विस्थापन के लिए छोड़ने के समूह (यानी 2-methylimidazole), और एक नया phosphodiester बांड रूपों । इस आरएनए नकल रसायन मिलीग्राम की एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता है2 +, जो chelated करने की जरूरत है ताकि फैटी एसिड protocells के साथ संगत हो । 6 एक और मिलीग्राम2 +-निर्भर प्रतिक्रिया है कि हथौड़ा ribozyme, जो शायद सबसे अच्छी विशेषता उत्प्रेरक आरएनए है द्वारा catalyzed है । इस ribozyme, जो दो लघु oligonucleotides से पुनर्गठन किया जा सकता है, एक आत्म-दरार प्रतिक्रिया है कि एक जेल बदलाव से निगरानी करने के लिए सुविधाजनक है करता है । जैसे, यह अक्सर मूल जीवन के अध्ययन में एक मॉडल ribozyme के रूप में कार्यरत है । 7 unliganded मैग्नीशियम के लिए इस ribozyme द्वारा एक आवश्यकता के कारण, liposomes आम तौर पर फैटी एसिड और फैटी एसिड ग्लिसरॉल एस्टर, जो मैग्नीशियम के लिए और अधिक स्थिर है का एक मिश्रण द्वारा निर्माण कर रहे हैं । 8 , 9 इस प्रोटोकॉल में, हम तैयारी, हेरफेर, इन बुलबुले के लक्षण वर्णन और गैर एंजाइमी आरएनए नकल और हथौड़ा ribozyme की मेजबानी करने के लिए protocells के रूप में इन बुलबुले के आवेदन प्रदर्शित करने के लिए विकसित किया है हम वर्तमान तकनीक catalysis.
फैटी एसिड से गठित Liposomes उनके उच्च पारगम्यता और गतिशील गुणों के कारण आदिम कोशिकाओं के लिए संभावित मॉडल के रूप में कई द्वारा सुझाव दिया गया है. एकल चेन फैटी एसिड की carboxylic सिर समूह केवल एक सीमित पीएच रेंज में झिल्ली में आत्म विधानसभा की अनुमति देता है, और जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली लवण की उपस्थिति के लिए काफी संवेदनशील हैं । नतीजतन, फैटी एसिड बुलबुले फॉस्फोलिपिड बुलबुले के साथ तुलना में अलग तैयारी और हैंडलिंग तरीकों की आवश्यकता होती है ।
इस प्रोटोकॉल में, यद्यपि हम liposome गठन के लिए एक उदाहरण के रूप में ओलिक एसिड का उपयोग, अंय लंबी श्रृंखला unसंतृप्त फैटी एसिड (सी14) और उनके डेरिवेटिव (सीए. myristoleic एसिड, palmitoleic एसिड, और इसी शराब और ग्लिसरॉल एस्टर) भी बुलबुले के रूप में पतली फिल्म निर्जलीकरण के रूप में लंबे समय के रूप में कुल लिपिड एकाग्रता सीएमसी के ऊपर है और जलयोजन बफर पीएच झिल्ली के भीतर फैटी एसिड की pKa के करीब है के बाद । tris-HCl बफर के अलावा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया, अंय बफर सिस्टम (ca. bicine, फॉस्फेट, बोराटे) फैटी एसिड पुटिका गठन का समर्थन करने के लिए सूचित किया गया था, हालांकि फॉस्फेट या बोराटे बफर में गठित बुलबुले आमतौर पर काफी टपका हुआ13हैं । निर्जलीकरण के बाद परिणामस्वरूप फैटी एसिड बुलबुले polydisperse और multilamellar हैं, लेकिन आसानी से बाहर निकालना द्वारा वर्णित के रूप में छोटे monodisperse unilamellar बुलबुले में परिवर्तित कर रहे हैं । छोटे बुलबुले पैदा करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में sonication के साथ तुलना में, बाहर निकालना अलग ताकना आकार झिल्ली लागू करने से पुटिका आकार के नियंत्रण के लिए और अधिक विकल्प प्रदान करता है । बाहर निकालना के बाद बुलबुले आम तौर पर झिल्ली ताकना आकार से थोड़ा बड़ा कर रहे हैं, लेकिन बाहर निकालना चक्र की संख्या में वृद्धि से, एक संकरा आकार वितरण के साथ बुलबुले और एक औसत आकार झिल्ली ताकना आकार के करीब प्राप्त किया जा सकता है ।
कार्यात्मक protocells को संश्लेषित करने के लिए, फैटी एसिड बुलबुले के लिए विशिष्ट जैव-रासायनिक आरएनए या अन्य इमारत ब्लॉकों के encapsulation के परिणामस्वरूप प्रतिक्रियाओं की मेजबानी की जरूरत है । पतली फिल्म निर्जलीकरण विधि एक आसान तरीका है वांछित encapsulated सामग्री युक्त बुलबुले के रूप प्रदान करता है । हालांकि, encapsulation दक्षता अपेक्षाकृत कम है और शाही सेना के रूप में कीमती सामग्री का एक बड़ा अंश आम तौर पर शुद्धि प्रक्रिया के दौरान खो रहे हैं । कुछ मामलों में encapsulation दक्षता बाहर निकालना से पहले दोहराया फ्रीज-गल चक्र द्वारा मामूली सुधार किया जा सकता है । उच्च फॉस्फोलिपिड liposomes की उपज की तैयारी के लिए Microfluidic तरीके लगभग १००% encapsulation दक्षता के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन अनुरूप तरीके अभी तक फैटी एसिड बुलबुले के लिए विकसित नहीं किया गया है ।
जब या तो chelated या नि: शुल्क मिलीग्राम2 +के साथ protocells हैंडलिंग +, मैग्नीशियम समाधान इसके अलावा और प्रत्येक समय बिंदु से पहले शोधन के बाद शुद्धिकरण की लीक encapsulated सामग्री है कि प्रतिक्रिया की दर की सटीकता को प्रभावित कर सकता है को हटाने सुनिश्चित करता है बुलबुले के अंदर माप । के बाद से प्रत्येक शुद्धि के लिए अच्छा जुदाई को प्राप्त करने के लिए और पुटिका भागों को इकट्ठा करने के लिए ंयूनतम 10 मिनट लगते हैं, तेजी से प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण मुश्किल है, और प्रतिक्रिया स्तंभ शोधन से पहले बंद कर दिया जाना चाहिए ।
प्रोटोकॉल हम यहां मौजूद फैटी एसिड liposomes के निर्माण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि मेजबान उन है कि आदिम कोशिकाओं में हो सकता नकल उतारना प्रतिक्रियाओं । हमारे प्रोटोकॉल भी जैव चिकित्सा वितरण प्रणालियों और अंय जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया के विकास में संभावित अनुप्रयोगों को सक्षम करें ।
The authors have nothing to disclose.
J.W.S. हावर्ड ह्यूजेस आयुर्विज्ञान संस्थान के जांचकर्ता हैं । यह काम एक अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था (२९०३६३) शमौन फाउंडेशन से J.W.S. के लिए दोनों A.E.E. और K.P.A. मिनेसोटा प्रारंभमें कोष के विश्वविद्यालय से समर्थन स्वीकार करते हैं ।
sephorose 4B | SIGMA-ALDRICH INC | 4B200 | |
calcein | SIGMA-ALDRICH INC | C0875-10G | |
tris-HCl pH8.0 1M | LIFE TECHNOLOGIES CORP | AM9851 | |
citric acid | SIGMA-ALDRICH INC | 251275-500G | |
sodium hydroxide | SIGMA-ALDRICH INC | 71690-250G | |
potassium hydroxide | Sigma | 30614 | |
oleic acid | Nu-Chek | U-46-A | |
glycerol monooleate | Nu-Chek | M-239 | |
Liss Rhodamine-PE | LIFE TECHNOLOGIES CORP | L1392 | |
magnesium chloride | Fisher/Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
sequagel concentrate | National Diagnostics | EC-830 | |
sequagel DILUENT | National Diagnostics | EC-840 | |
15% TBE-UREA GEL | Thermo Fisher Scientific | EC68852BOX | |
urea | Sigma Aldrich | U6504-500G | |
titon-100x | SIGMA-ALDRICH INC | T9284-100ML | |
RNA primer | IDT | 5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG | |
RNA template | IDT | 5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC | |
hammerhead substrate strand | IDT | 5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC | |
hammerhead ribozyme strand | IDT | 5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG | |
vesicle extruder set | AVANTI POLAR LIPIDS | 610000 | |
fraction collector | Gilson, Inc. | 171041 | |
96-well plates | Fisher | NC9995941/675 | |
plate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3 | |
confocal microscope | Nikon | Nikon A1R MP Confocal | |
gel scanner | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon 9410 scanner |