Summary

मिट्टी के नमूनों के बहु-omic िरा के लिए MPLEx प्रोटोकॉल

Published: May 30, 2018
doi:

Summary

एक प्रोटोकॉल एक ही मिट्टी के नमूने से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड निकालने के लिए प्रस्तुत किया जाता है, कम नमूना तैयारी के समय की अनुमति और बहु omic जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण सीमित मात्रा के साथ नमूनों की.

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित एकीकृत metaproteomic, metabolomic, और lipidomic (मल्टी omic) अध्ययन हमारे समझने की क्षमता को बदलने और पर्यावरण और जैविक प्रणालियों में माइक्रोबियल समुदायों की विशेषताएं हैं । ये माप भी जटिल मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों, जो सबसे जटिल माइक्रोबियल तिथि ज्ञात प्रणालियों रहे है की बढ़ाया विश्लेषण सक्षम कर रहे हैं । बहु-omic विश्लेषण, हालांकि, नमूना तैयारी चुनौतियों है, के बाद से अलग निकालने आम तौर पर प्रत्येक omic अध्ययन के लिए आवश्यक हैं, जिससे बहुत तैयारी समय और आवश्यक नमूना की राशि बढ़ाना. इस सीमा को संबोधित करने के लिए, एक ही मिट्टी के नमूने से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड (MPLEx) के एक साथ निष्कर्षण के लिए एक 3-में-1 विधि एक विलायक आधारित दृष्टिकोण ढालने के द्वारा बनाया गया था । यह MPLEx प्रोटोकॉल जटिल मिट्टी के नमूनों की सीमित मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है, यहां तक कि जब कई नमूना प्रकार के लिए दोनों सरल और मजबूत होने के लिए साबित कर दिया है. MPLEx विधि भी बहुत तेजी से बहु-omic प्रत्येक माइक्रोबियल समुदाय के सदस्यों की एक बेहतर समझ हासिल करने की जरूरत माप सक्षम है, जबकि जैविक और पर्यावरणीय perturbations पर जगह लेने के परिवर्तन का मूल्यांकन ।

Introduction

मिट्टी के माइक्रोबियल समुदायों के मूल्यांकन कार्बन साइकिल चालन और जलवायु परिवर्तन को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । हाल के अध्ययनों से इस तरह के विभिंन प्रकार की मिट्टी में microbiota के लिए अनुक्रम जीनोम की कमी के रूप में कठिनाइयों पर प्रकाश डाला है, और पता चला प्रोटीन के कई की अज्ञात समारोह । इन चुनौतियों की वजह से सबसे जटिल माइक्रोबियल समुदाय1,2,3तारीख को जाना जाता है मिट्टी के कारण परिणाम । बहु omic विश्लेषण, जो metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, और lipidomic अध्ययन से परिणाम गठबंधन, हाल ही में कई मृदा अध्ययन में लागू किया गया है रोगाणुओं वर्तमान में एक बड़ी समझ हासिल है, जबकि आणविक पर्यावरण perturbations1,4,5के कारण जगह ले परिवर्तन के बारे में व्यापक जानकारी प्राप्त करने । बहु के साथ एक चुनौती-omic अध्ययन है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित metaproteomic, metabolomic, और lipidomic माप आम तौर पर प्रत्येक omic के लिए एक विशिष्ट निष्कर्षण प्रक्रिया की आवश्यकता होती है MS संगत6,7 , 8 , 9. ये सटीक प्रक्रिया उनके कार्यांवयन अत्यंत कठिन या असंभव जब केवल एक सीमित मात्रा में नमूना उपलब्ध है बनाते हैं । इन चुनौतियों का एक साथ metabolite, प्रोटीन की जांच करने के लिए हमें प्रेरित किया है, और लिपिड निष्कर्षण (MPLEx) विधि छोटे नमूना मात्रा या द्रव्यमान का उपयोग करने में सक्षम, सटीकता में सुधार, और सभी तीन विश्लेषणों के लिए तेजी से नमूना तैयारियां प्रदान 10. तिथि करने के लिए, वहां कोई वैकल्पिक मिट्टी निष्कर्षण प्रक्रियाओं है कि इन लक्ष्यों के सभी प्राप्त कर सकते हैं ।

एक एकल मिट्टी के नमूने के वैश्विक बहु-omic विश्लेषण को सक्षम करने के लिए, एक कार्बनिक विलायक निष्कर्षण प्रोटोकॉल क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल पर आधारित है, और जल जुदाई10का उपयोग किया गया था । इस विधि मूल रूप से कुल लिपिड निकालने के लिए विकसित किया गया था9,11 और अधिक हाल ही में एक एकल नमूना12से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड के एक साथ निष्कर्षण के लिए संशोधन किया गया था,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, कम नमूना मात्रा को सक्षम करना और प्रायोगिक परिवर्तनशीलता10। MPLEx प्रोटोकॉल में, क्लोरोफॉर्म पानी के साथ मिश्रणीय नहीं है, जो विशिष्ट भागों में नमूना घटकों के triphasic रासायनिक जुदाई के लिए आधार प्रदान करता है । शीर्ष जलीय चरण इसलिए हाइड्रोफिलिक चयापचयों, एक प्रोटीन डिस्क के बाद, और फिर नीचे क्लोरोफॉर्म चरण में एक लिपिड परत (चित्रा 1) शामिल हैं । जब MPLEx सबसे मिट्टी के लिए लागू किया जाता है, मलबे कण नमूना ट्यूबों के बहुत नीचे जमा हो जाती है और सभी परतों एकत्र कर रहे है के बाद छोड़ दिया जा सकता है । प्रत्येक प्रकार की मिट्टी अलग हो सकता है, तथापि, और अत्यधिक कार्बनिक मिट्टी में ऐसे पीट के रूप में, मिट्टी के मलबे के बीच परत में रहता है और नमूना ट्यूब के नीचे करने के लिए गिर नहीं है । MPLEx ऐसे 1 के रूप में एक ही नमूना से कई अणु प्रकार अलग जब कई लाभ प्रदान करता है) छोटे नमूना मात्रा बहु omic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 2) एक ही नमूना कमी समग्र प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता से बहु omic निकालने, और 3) नमूनों की अधिक से अधिक संख्या उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए बहुत तेजी से तैयार किया जा सकता है10. एक साथ इन लाभों मिट्टी के नमूनों और उनके जटिल माइक्रोबियल समुदायों के मूल्यांकन के लिए बेहतर माप क्षमताओं को उपलब्ध कराने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

Protocol

नोट: बहुत गीली मिट्टी निष्कर्षण की प्रभावशीलता को हानि के बिना निष्कर्षण करने से पहले lyophilized जा सकता है । गीली मिट्टी भी इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन जब विशिष्ट अनुपात में एजेंट जोड़ने पर विचार किया जा?…

Representative Results

जब MPLEx प्रोटोकॉल कैनसस देशी prairie मिट्टी (एक Mollisol मिट्टी) से अणुओं को निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया था, तपसिल विश्लेषण ३३७६ पेप्टाइड्स, १०५ लिपिड, और १०२ ध्रुवीय चयापचयों (सभी अद्वितीय पहचान) क?…

Discussion

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि नहीं सभी प्रयोगशालाओं एक ही उपलब्ध उपकरण तो कुछ तरीकों होगा, उदाहरण के लिए lysis कदम, अनुकूलित किया जा सकता है । यहाँ हम भंवर और sonicating का उपयोग करें, लेकिन एक बड़ी ५० मिलीलीटर मनका ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

आंकड़े तैयार करने में उनकी सहायता के लिए लेखक नाथन जॉनसन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस शोध के द्वारा समर्थित किया गया पैन-ओमिक्स प्रोग्राम है कि अमेरिका के ऊर्जा विभाग द्वारा वित्त पोषित है जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय (जीनोमिक विज्ञान कार्यक्रम), संक्रमण में Microbiomes (मिंट) प्रयोगशाला के अनुसंधान विकास का निर्देशन प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला में पहल, साथ ही साथ स्वास्थ्य राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (R01 ES022190) और NIH (P42 ES027704) के राष्ट्रीय संस्थानों । KEBJ वित्तीय सहायता के लिए R21 HD084788 का विकास और उपंयास बहु omic निष्कर्षण तकनीकों को मांय करने के लिए धंयवाद देना चाहूंगा । यह काम डब्ल्यू आर विले पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला (EMSL), प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला (PNNL) में एक डो राष्ट्रीय वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधा में प्रदर्शन किया गया । PNNL एक बहु कार्यक्रम राष्ट्रीय प्रयोगशाला अनुबंध DE-AC06-76RL01830 के तहत डो के लिए बैटल द्वारा संचालित है ।

Materials

Chloroform Sigma-Aldrich 650498 Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.
Purified water from Millipore Milli-Q Water purification system.
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L6026 !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.
Soil protein extraction kit MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen 30000-20
DL-dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815
1M Trizma HCL Sigma-Aldrich T2694
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699 !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.
Urea Sigma-Aldrich 208884 !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses
Ammonium bicarbonate Fluka 09830
Trypsin Promega V528A 20µg vials
Bicinchoninic acid protein assay kit Pierce 23227
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 09735
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998 !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904 !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Pyridine Sigma-Aldrich 270970 !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane Sigma-Aldrich 69478 !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Milli-Q water purification system Millipore model MPGP04001
Vortex Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Probe sonicator FisherBrand model FB505
Refrigerated centrifuge Eppendorf model 5810R
50mL tube swinging bucket rotor Eppendorf A-4-44
50mL fixed angle rotor Eppendorf FA-45-6-30
Balance OHAUS model V22PWE150IT
Serological pipette controller Eppendorf 12-654-100
10mL, 25mL glass serological pipettes FisherBrand 13-678-27F, 13-678-36D
Thermomixer with Thermotop Eppendorf 5382000015, 5308000003
0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads NextAdvance SSB14B
0.15 mm garnet beads MoBio 13122-500
Magnetic stir plate FisherBrand 11-100-16SH
Magnetic stir bar FisherBrand 14512130
pH paper strips, pH range 0–14 FisherBrand M95903
15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube Genesee Scientific 21-103 21-108 chloroform compatible
50mL vortex attachment MoBio 13000-V1-50
Ice bucket FisherBrand 02-591-44
27.25x70mm glass vials FisherBrand 03-339-22K
Breathe Easier plate membranes Midwest Scientific BERM-2000
Alcohol wipes Diversified Biotech BPWP-1000
Heater shaker incubator Benchmark, Incu-Shaker Mini
Analog rotisserie tube rotator SoCal BioMed, LLC 82422001
Filter-Aided-Sample-Prep kit FASP; Expedeon 44250
Microplate reader Biotek, EPOCH
-20 Degree Celsius Freezer Fisher 13986149
-80 Degree Celsius Freezer Stirling Ultracold SU78OUE
Q-Exactive ion trap mass spectrometer Thermo Scientific
Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer Agilent Technologies, Inc.
LTQ-Orbitrap Velo Thermo Scientific
Waters NanoEquityTM UPLC system Millford, MA
250mL media bottle FisherBrand 1395-250
Waters vial Waters 186002805
Glass MS sample vial and inserts MicroSolv 9502S-WCV, 9502S-02ND
Glass HPLC vial and snap caps MicroSolv 9512C-0DCV, 9502C-10C-B
HPLC 96-well plate Agilent 5042-6454
Large glass vial 27.25x70mm FisherBrand 03-339-22K
Lyophilizer Labconco 7934021
Polished stainless steel flat head spatula Spoonula; FisherBrand 14-375-10
Kim wipes Kimberly-Clark 34721
XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column Waters 186003117, 186003064
Agilent 1100 series HPLC system Agilent Technologies G1380-90000
1.7mL centrifuge tube Sorenson 11700
Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL Hamilton 81517, 80975, 81175
Pasteur Pipettes FisherBrand 13-678-20A
Pasteur Pipette Bulbs Sigma-Aldrich Z111597
Bath Sonicator Branson 1800 Ultrasonic Cleaner
Vacuum Centrifuge Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System
MicroSpin Columns, C18 Silica The Nest Group SEM SS18V

References

  1. Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
  2. White, R. A., et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
  3. White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
  4. Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
  5. Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
  7. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
  8. Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , (2012).
  9. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
  10. Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
  11. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
  12. Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
  13. Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
  14. Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
  15. Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
  16. Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
  17. Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
  18. Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
  19. Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
  20. Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
  21. Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
  22. Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
  23. Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
  24. Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
  25. Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
  26. Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
  27. Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
  28. Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
  29. Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
  30. Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
  31. Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
  32. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
  33. Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
  34. Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
  35. Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
  36. Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
  37. Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
  38. Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
  39. Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).

Play Video

Cite This Article
Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343, doi:10.3791/57343 (2018).

View Video