मिट्टी के नमूनों के बहु-omic िरा के लिए MPLEx प्रोटोकॉल
Summary
एक प्रोटोकॉल एक ही मिट्टी के नमूने से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड निकालने के लिए प्रस्तुत किया जाता है, कम नमूना तैयारी के समय की अनुमति और बहु omic जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण सीमित मात्रा के साथ नमूनों की.
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित एकीकृत metaproteomic, metabolomic, और lipidomic (मल्टी omic) अध्ययन हमारे समझने की क्षमता को बदलने और पर्यावरण और जैविक प्रणालियों में माइक्रोबियल समुदायों की विशेषताएं हैं । ये माप भी जटिल मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों, जो सबसे जटिल माइक्रोबियल तिथि ज्ञात प्रणालियों रहे है की बढ़ाया विश्लेषण सक्षम कर रहे हैं । बहु-omic विश्लेषण, हालांकि, नमूना तैयारी चुनौतियों है, के बाद से अलग निकालने आम तौर पर प्रत्येक omic अध्ययन के लिए आवश्यक हैं, जिससे बहुत तैयारी समय और आवश्यक नमूना की राशि बढ़ाना. इस सीमा को संबोधित करने के लिए, एक ही मिट्टी के नमूने से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड (MPLEx) के एक साथ निष्कर्षण के लिए एक 3-में-1 विधि एक विलायक आधारित दृष्टिकोण ढालने के द्वारा बनाया गया था । यह MPLEx प्रोटोकॉल जटिल मिट्टी के नमूनों की सीमित मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है, यहां तक कि जब कई नमूना प्रकार के लिए दोनों सरल और मजबूत होने के लिए साबित कर दिया है. MPLEx विधि भी बहुत तेजी से बहु-omic प्रत्येक माइक्रोबियल समुदाय के सदस्यों की एक बेहतर समझ हासिल करने की जरूरत माप सक्षम है, जबकि जैविक और पर्यावरणीय perturbations पर जगह लेने के परिवर्तन का मूल्यांकन ।
Introduction
मिट्टी के माइक्रोबियल समुदायों के मूल्यांकन कार्बन साइकिल चालन और जलवायु परिवर्तन को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । हाल के अध्ययनों से इस तरह के विभिंन प्रकार की मिट्टी में microbiota के लिए अनुक्रम जीनोम की कमी के रूप में कठिनाइयों पर प्रकाश डाला है, और पता चला प्रोटीन के कई की अज्ञात समारोह । इन चुनौतियों की वजह से सबसे जटिल माइक्रोबियल समुदाय1,2,3तारीख को जाना जाता है मिट्टी के कारण परिणाम । बहु omic विश्लेषण, जो metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic, और lipidomic अध्ययन से परिणाम गठबंधन, हाल ही में कई मृदा अध्ययन में लागू किया गया है रोगाणुओं वर्तमान में एक बड़ी समझ हासिल है, जबकि आणविक पर्यावरण perturbations1,4,5के कारण जगह ले परिवर्तन के बारे में व्यापक जानकारी प्राप्त करने । बहु के साथ एक चुनौती-omic अध्ययन है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित metaproteomic, metabolomic, और lipidomic माप आम तौर पर प्रत्येक omic के लिए एक विशिष्ट निष्कर्षण प्रक्रिया की आवश्यकता होती है MS संगत6,7 , 8 , 9. ये सटीक प्रक्रिया उनके कार्यांवयन अत्यंत कठिन या असंभव जब केवल एक सीमित मात्रा में नमूना उपलब्ध है बनाते हैं । इन चुनौतियों का एक साथ metabolite, प्रोटीन की जांच करने के लिए हमें प्रेरित किया है, और लिपिड निष्कर्षण (MPLEx) विधि छोटे नमूना मात्रा या द्रव्यमान का उपयोग करने में सक्षम, सटीकता में सुधार, और सभी तीन विश्लेषणों के लिए तेजी से नमूना तैयारियां प्रदान 10. तिथि करने के लिए, वहां कोई वैकल्पिक मिट्टी निष्कर्षण प्रक्रियाओं है कि इन लक्ष्यों के सभी प्राप्त कर सकते हैं ।
एक एकल मिट्टी के नमूने के वैश्विक बहु-omic विश्लेषण को सक्षम करने के लिए, एक कार्बनिक विलायक निष्कर्षण प्रोटोकॉल क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल पर आधारित है, और जल जुदाई10का उपयोग किया गया था । इस विधि मूल रूप से कुल लिपिड निकालने के लिए विकसित किया गया था9,11 और अधिक हाल ही में एक एकल नमूना12से चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड के एक साथ निष्कर्षण के लिए संशोधन किया गया था,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, कम नमूना मात्रा को सक्षम करना और प्रायोगिक परिवर्तनशीलता10। MPLEx प्रोटोकॉल में, क्लोरोफॉर्म पानी के साथ मिश्रणीय नहीं है, जो विशिष्ट भागों में नमूना घटकों के triphasic रासायनिक जुदाई के लिए आधार प्रदान करता है । शीर्ष जलीय चरण इसलिए हाइड्रोफिलिक चयापचयों, एक प्रोटीन डिस्क के बाद, और फिर नीचे क्लोरोफॉर्म चरण में एक लिपिड परत (चित्रा 1) शामिल हैं । जब MPLEx सबसे मिट्टी के लिए लागू किया जाता है, मलबे कण नमूना ट्यूबों के बहुत नीचे जमा हो जाती है और सभी परतों एकत्र कर रहे है के बाद छोड़ दिया जा सकता है । प्रत्येक प्रकार की मिट्टी अलग हो सकता है, तथापि, और अत्यधिक कार्बनिक मिट्टी में ऐसे पीट के रूप में, मिट्टी के मलबे के बीच परत में रहता है और नमूना ट्यूब के नीचे करने के लिए गिर नहीं है । MPLEx ऐसे 1 के रूप में एक ही नमूना से कई अणु प्रकार अलग जब कई लाभ प्रदान करता है) छोटे नमूना मात्रा बहु omic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 2) एक ही नमूना कमी समग्र प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता से बहु omic निकालने, और 3) नमूनों की अधिक से अधिक संख्या उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए बहुत तेजी से तैयार किया जा सकता है10. एक साथ इन लाभों मिट्टी के नमूनों और उनके जटिल माइक्रोबियल समुदायों के मूल्यांकन के लिए बेहतर माप क्षमताओं को उपलब्ध कराने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि नहीं सभी प्रयोगशालाओं एक ही उपलब्ध उपकरण तो कुछ तरीकों होगा, उदाहरण के लिए lysis कदम, अनुकूलित किया जा सकता है । यहाँ हम भंवर और sonicating का उपयोग करें, लेकिन एक बड़ी ५० मिलीलीटर मनका ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आंकड़े तैयार करने में उनकी सहायता के लिए लेखक नाथन जॉनसन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस शोध के द्वारा समर्थित किया गया पैन-ओमिक्स प्रोग्राम है कि अमेरिका के ऊर्जा विभाग द्वारा वित्त पोषित है जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय (जीनोमिक विज्ञान कार्यक्रम), संक्रमण में Microbiomes (मिंट) प्रयोगशाला के अनुसंधान विकास का निर्देशन प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला में पहल, साथ ही साथ स्वास्थ्य राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (R01 ES022190) और NIH (P42 ES027704) के राष्ट्रीय संस्थानों । KEBJ वित्तीय सहायता के लिए R21 HD084788 का विकास और उपंयास बहु omic निष्कर्षण तकनीकों को मांय करने के लिए धंयवाद देना चाहूंगा । यह काम डब्ल्यू आर विले पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला (EMSL), प्रशांत नॉर्थवेस्ट राष्ट्रीय प्रयोगशाला (PNNL) में एक डो राष्ट्रीय वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधा में प्रदर्शन किया गया । PNNL एक बहु कार्यक्रम राष्ट्रीय प्रयोगशाला अनुबंध DE-AC06-76RL01830 के तहत डो के लिए बैटल द्वारा संचालित है ।
Materials
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V | |
References
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