Een protocol wordt gepresenteerd voor gelijktijdig metabolieten, eiwitten en lipiden extraheren uit een één bodemmonster, waardoor deelmonster bereidingstijden en multi-dienst spectrometrische analyse van monsters met een beperkte hoeveelheden inschakelen.
De Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde geïntegreerde metaproteomic, metabolomic en lipidomic (multi-dienst) studies zijn het omzetten van ons vermogen om te begrijpen en karakteriseren van microbiële gemeenschappen in milieu en biologische systemen. Deze metingen zijn zelfs inschakelen uitgebreide analyses van de microbiële gemeenschappen complexe bodem, dat de meest zijn complexe microbiële systemen bekend tot op heden. Multi-dienst analyses hebben echter monster voorbereiding uitdagingen, aangezien afzonderlijke extracties zijn meestal nodig voor elk onderzoek van de dienst, daardoor aanzienlijk versterken de voorbereidingstijd en de hoeveelheid monster nodig. Om deze beperking, is een 3-in-1-methode voor de gelijktijdige winning van metabolieten, eiwitten en lipiden (MPLEx) uit de dezelfde bodemmonster gemaakt door aanpassing van een aanpak op basis van oplosmiddel. Dit protocol MPLEx heeft bewezen om zowel eenvoudig en robuust voor vele types van de steekproef, zelfs wanneer gebruikt voor beperkte hoeveelheden van complexe bodemmonsters. De MPLEx methode ingeschakeld ook sterk de snelle multi-dienst metingen die nodig zijn voor een beter begrip van de leden van elke microbiële Gemeenschap, tijdens het evalueren van de veranderingen die plaatsvinden op biologische en ecologische verstoringen te krijgen.
Evaluatie van bodem microbiële gemeenschappen heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van carbon fiets- en klimaat-verandering. Recente studies hebben echter gewezen op problemen, zoals het ontbreken van gesequenceerd genomen voor microbiota in verschillende bodemtypes en de onbekende functie van veel van de eiwitten opgespoord. Het resultaat van deze uitdagingen als gevolg van de bodem wordt van de meest complexe microbiële Gemeenschap bekend tot op heden1,2,3. Multi-dienst analyses, die resultaten van metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic en lipidomic studies combineren, werden onlangs geïmplementeerd in talrijke studies van de bodem een groter inzicht in de microben aanwezig, terwijl uitgebreide informatie over de moleculaire veranderingen die plaatsvinden als gevolg van milieu verstoringen1,4,5te verkrijgen. Een uitdaging met multi-dienst studies is dat de Spectrometrie van de massa (MS)-gebaseerde metaproteomic, metabolomic en lipidomic metingen vergen doorgaans een specifieke extractieproces voor elke dienst als MS compatibel6,7 , 8 , 9. deze precieze procedures maken de uitvoering ervan bijzonder moeilijk of niet onmogelijk wanneer slechts een beperkte hoeveelheid van het monster beschikbaar is. Deze uitdagingen hebben gevraagd ons te onderzoeken van een gelijktijdige metaboliet, eiwitten en lipiden (MPLEx) extractiemethode staat met behulp van kleinere steekproef volumes of massa’s, verbetering van de nauwkeurigheid en snellere staalvoorbereiding voor alle drie analyses 10. tot op heden zijn er geen alternatieve bodem extractie procedures die al deze doelen kunnen bereiken.
Opdat de globale multi-dienst analyses van een één bodemmonster, was een organische oplosmiddelen extractie-protocol gebaseerd op chloroform, methanol en water scheidingen benutte10. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor totale lipide extracties9,11 en meer recentelijk is gewijzigd voor de gelijktijdige winning van metabolieten, eiwitten en lipiden uit een monster12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, waardoor minder hoeveelheid monster en experimentele variabiliteit10. In het MPLEx protocol is chloroform niet mengbaar zijn met water, die de basis voor de triphasic chemische scheiding van monster bestanddelen in verschillende fracties vormt. De top van de waterige fase bevat daarom de hydrofiele metabolieten, gevolgd door een eiwit-schijf, waarna een lipide-laag in de bodem chloroformfase (Figuur 1). Wanneer MPLEx wordt toegepast op de meeste bodems, afvaldeeltjes hoopt zich aan de onderkant van de bemonstering buizen en kan worden verwijderd nadat alle lagen worden verzameld. Elk bodemtype kan verschillen, echter, en in zeer organische bodem zoals turf, het puin van de bodem blijft in de middenlaag en niet vallen aan de onderkant van de buis van de bemonstering. MPLEx biedt verschillende voordelen wanneer meerdere molecuul isoleren uit hetzelfde monster soorten zoals 1) kleinere hoeveelheden van het monster kunnen worden gebruikt voor multi-dienst analyses, 2) multi-dienst extracties uit de dezelfde daling van steekproef algemeen experimentele variabiliteit, en 3) grotere aantallen monsters kan veel sneller worden voorbereid voor hogere doorvoer studies10. Samen deze voordelen zijn van vitaal belang voor het verstrekken van betere meting vermogens voor de evaluatie van bodemmonsters en hun complexe microbiële gemeenschappen.
Het is belangrijk op te merken dat niet alle laboratoria dezelfde beschikbare apparatuur hebben zal, zodat bepaalde methoden, bijvoorbeeld de lysis stap, kunnen worden aangepast. We gebruiken hier vortexing en sonicating, maar het gebruik van een groot 50 mL kraal beater zou werken. Als een lyophilizer met een verzamelaar temperatuur staat-105 ° C niet beschikbaar is, kunnen dan monsters worden gedroogd onder een stikstof-stream. Ook bodemtypes variëren sterk en zand, silt, klei, Veen en leem (enz.) kunnen opn…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank Nathan Johnson voor zijn hulp bij de voorbereiding van de cijfers. Dit onderzoek werd gesteund door de Pan-omics-programma dat wordt gefinancierd door het Amerikaanse Department of Energy Office van biologische en milieuonderzoek (Genomic Science Program), de Microbiomes in overgang (MinT) laboratorium gericht onderzoek ontwikkeling Initiatief op de Pacific Northwest National Laboratory, evenals de nationale instituten van gezondheid National Institute of Environmental Health Sciences (R01 ES022190) en NIH (P42 ES027704). KEBJ bedank R21 HD084788 voor financiële steun aan de ontwikkeling en validering van nieuwe multi-dienst extractie technieken. Dit werk werd uitgevoerd in de W. R. Wiley milieu Molecular Sciences Laboratory (EMSL), een faciliteit nationale wetenschappelijke gebruiker DOE op de Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is een multi programma nationaal laboratorium Exploitatiedoor Battelle voor het DOE onder Contract DE-AC06-76RL01830.
Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
-20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
-80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
Waters vial | Waters | 186002805 | |
Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V |