Summary
나 일 빨강 고정된 꼬마 선 충 의 얼룩 조직 중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 기름 빨간 O 얼룩 동안 중립 지질 예금, 양적 측정 하기 위한 방법입니다.
Abstract
꼬마 선 충 은 지질 대사 및 에너지 항상성 공부 하는 뛰어난 모델 유기 체입니다. 그것의 지질 유전자의 많은 인간에서 보존 하 고 대사 증후군 또는 다른 질병와 관련. 이 유기 체에서 지질 축적의 시험 통 염료 또는 레이블 자유로운 방법에 의해 밖으로 수행할 수 있습니다. 통 얼룩 나 일 빨강 좋아하고 기름 빨간 O 양적 지질 수준을 측정 하 고 질적 관찰 지질 분포, 조직에 걸쳐 각각 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 방법이 있습니다. 또한, 이러한 얼룩 다양 한 지질 물질 대사 유전자 및 통로의 높은 처리량 검열을 허용 한다. 또한, 그들의 소수 성 자연 지질 용 해도 용이 하 게, 주변 조직와 상호 작용을 감소 및 용 매로 분리를 방지. 이 메서드는 일반적인 지질 콘텐츠 검사에 효과적, 비록 그들은 화학 성분 및 지질 예금의 다양성에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 이러한 목적으로, GC-MS와 자동차 현미경 같은 레이블 없는 메서드는 더 나은 적합, 불구 하 고 그들의 비용.
Introduction
지질은 생활 필수품입니다. 그들은 세포 막의 필수 구성 요소, 보조 메신저 역할 및 신호 변환기, 그리고 에너지 저장에 중요 한 기능을가지고. 지질 대사 dysregulated 때, 그것은 공중 보건 우려9누르고 비만 타입 II 당뇨병 같은 질병에 이른다. 꼬마 선 충 (C. 선 충)은 상대적으로 짧은 수명 주기, 투명 한 몸, 알려진된 세포 계보와 완전히 시퀀스 된 게놈을가지고 있기 때문에 지질 대사를 공부 하는 우수한 모델 유기 체. 주로 남녀 추 니, C. 선 충 연구자를 인상 isogenic 동물의 많은 짧은 수행할 높은 처리량 앞으로 유전 스크린 다양 한 대사 유전자 및 통로4공부 기간에 있습니다. 이 이렇게 인간, 쥐, 쥐 및 초파리 중 273 선 충 C. 지질 물질 대사 유전자에서 보존의 높은 학위를 공개 했다. 또한, C. 선 충 에서 300 지질 유전자 변화 증후군11에 비관련 질병에 연결 된 인간의 orthologues가 있다. 전통적으로, C. 선 충 에 지질 저장의 검사는 주로 지질 축적에 대 한 강력한 정보를 제공 하는 염료 분류 분석 실험에 의존 했다. 덜 일반적인 조직에 걸쳐 지질 지역화 및 지질 풍부에서 측정 된 차이의 설명 이다. 그러나, 최근 작품은 지질 분포 지질 축적6만큼 중요 있을 수 있습니다 밝혔다.
최근에, 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (HPLC-석사), 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS), 같은 통합 연구 시작 하 고 일관 된 안티-스톡 스 라만 산란 (자동차) 현미경 주소로 얼룩-기반 접근 직접 지질 추출, 특정 지질 분수, 및 지질 예금, 각각10,11의 내용을 분석 하 여 단점 또한, 자동차 현미경 나 일 빨강 수 있습니다만 중요 한 얼룩 리드 오프 대상 자동 형광 세포10의 얼룩에 사용을 위해 통 염료로 사용 하는 경우 지방 축적에 대 한 프록시 역할을 계시 했다. 그러나, 필요한 기술적 전문성과 비용 이러한 크로마토그래피와 관련 된 그리고 현미경 검사 법 방법 활용 그들의 많은 연구 질문에 대 한 점. 이 문서에서 우리는 흥분 시키는 중립 지질 예금 C. 선 충 나 일 빨강을 사용 하 여 얼룩 하 고 기름 빨간 O 지질 풍부 전체 동물에서 및 특정 조직에 구별을 편리 하 고 안정적인 방법 토론.
나 일 빨강, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, benzophenoxazone 염료를 쉽게 다양 한 유기 용 매에 녹이 고 주로 물에 용 해 되지 않습니다 이다. 그것은 우수한 lysochrome 염료 사용 트리 글리세라이드 등 중립 지질 얼룩 또는 콜레스테롤 에스테 르는 강한 색상을 보유 하 고 있습니다. 때문에 지질에 잘 solubilizes, 무시할 상호 주위 조직, 않으며 덜에 보다 용 매에 용 해 지질입니다. 그것은 450-500 및 520 nm, 각각1의 여기 및 방출 맥시 마. 개별 지질 시체를 소장 및 다른 조직에 걸쳐 관찰 중 하나에 클러스터 또는 동물의 유전자 형 또는 실험적인 치료에 따라 균등 하 게 분산 수 있습니다 녹색 형광에 대 한 일 레드 스테인드 C. 선 충 을 볼 때 7.
기름 빨간 O lysochrome, 트리 글리세라이드 및 단백질 얼룩을 사용 하는 지 용 성 염료 이다. 그것은 그것의 화학 구조 포함 3 개의 향기로운 반지에 연결 된 두 개의 아조 그룹 때문에 아조 염료 이라고 합니다. 그것은 어느 지질에서 높게 녹는 렌더링 이온화, 어렵다입니다. 얼룩 색은 빨간색 이며 그것의 빛을 흡수 최대 518 nm 3. C. 선 충 기름 빨간 O 쇼 다른 조직6중 지질 분포의 질적 평가 용이 하 게 동물의 투명 한 바디에 눈에 띄는 빨간 지질 방울 스테인드.
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Protocol
1. 나 일 빨강 (NR) 지질의 얼룩
- 5 mg/mL NR 재고 솔루션의 준비
- 500 mL 병에서 NR 분말의 100 mg 100% 아세톤의 200 mL를 추가 합니다.
- 빛을 모든 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일 병을 커버.
- 사용 하기 전에 어둠 속에서 2 시간에 대 한 솔루션을 저 어.
- 장기 사용에 대 한 어떤 빛 노출 없이 단단히 밀봉된 병에 NR 재고 솔루션을 저장 합니다. 연구의 필요에 따라 NR 재고 솔루션을 확장 합니다. 동일한 재고 솔루션은 일관 된 얼룩 및 이미징 결과 NR 얼룩 실험에서 사용 확인 합니다.
- NR 작업 솔루션의 준비
- 40% 소 프로 파 놀 (v/v)의 모든 1 ml NR 재고 솔루션의 6 µ L를 추가 합니다.
- 각 샘플에 대 한 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 준비 합니다.
참고: 신선한 NR 솔루션 오른쪽 얼룩이 지기 전에 작업을 확인 합니다. NR 재고 솔루션 요구에 따라 15 mL 또는 졸업 50 mL 원뿔 튜브를 사용 합니다.
- NR 지질 얼룩에 대 한 벌레의 준비
- 선 충 류 성장 매체 (NGM) 시드 후반 로그 OP50 대장균과 20 ° C에서 초기 L4 단계에 벌레를 성장.
- 인산 염 버퍼 식 염 수 + 0.01% 트라이 톤 X-100 (PBST) 솔루션 x 1의 1 mL와 함께 접시에서 벌레를 세척 하 고 웜 현 탁 액 1.5 mL microfuge 관에 넣어.
- 560 x g 1 분에 벌레 제거 반복 대장균 까지이 단계를 삭제 하 고 상쾌한 현 탁 액에서 원심 분리기.
- 웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 100 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.
- 560 x g 1 분 동안에 벌레를 원심 고 웜 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.
참고: 경우 판에서 벌레를 세척 하는 PBST의 높은 볼륨 사용 큰 접시를 사용 하 여 또는 접시 당 더 많은 벌레를 얼룩. PBST에서 보다 더 15 분 샘플 고정 전에 벌레를 씻지 않는. 수행 추가 세척은 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. Nutator 또는 로커를 사용 하 여 40% 소 프로 파 놀에 보육을 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.
- Nr 얼룩 지질
- 어둠 속에서, 각 샘플에 NR 작업 솔루션의 600 µ L를 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 NR 솔루션에서 벌레를 완벽 하 게 혼합.
- 2 시간에 대 한 실 온에서 어둠 속에서 샘플을 회전 합니다.
- 외피, 다음 1 분 동안 560 x g 에서 벌레를 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- PBST의 600 µ L을 추가 하 고 30 분 초과 NR 얼룩 제거에 대 한 어둠 속에서 샘플을 품 어.
- 560 x g 1 분에 샘플 원심 고 상쾌한의 약 50 µ L를 제외한 모든 제거 하십시오.
참고: NR 인큐베이션 동요를 필요 하지 않습니다. 벌레의 정착은이 단계 동안 일반적 이다.
- 현미경 이미징에 대 한 슬라이드의 준비
- 나머지 상쾌한에 웜 펠 릿을 resuspend.
- 현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L을 놓고 신중 하 게 트래핑 어떤 공기 방울을 피하기 위해 하는 coverslip 넣어 합니다.
- 벌레를 이미징 하기 전에 매니큐어와 coverslip 인감.
- 한 번에 단지 몇 가지 슬라이드를 준비 합니다. 이렇게 하면 NR 이미징 일정 하 게 유지 샘플에서. NR 스테인드 이미지의 품질에는 6 헤 이산 지질 방울 관찰 하기 곤란 하다 며 배경 형광, NR 신호 검출을 방해는 감소 한다.
- NR 얼룩진 벌레의 이미징
- 보기의 필드 당 여러 동물을 잡으려고 5 배 확대에 벌레 이미지.
- 개별 벌레의 더 나은 정량화에 대 한 10 배 확대로 전환.
- FITC/GFP 채널을 사용 하 여 이미지 NR 스테인드 웜 및 정량화에 대 한 최적의 조건을 결정 하기 위해 다른 노출 시간을 시도.
- 압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식으로 파일을 저장 합니다.
참고: 일반적인 노출 시간 100-1000 양 최적의 노출 시간에 이르기까지, 모든 샘플에 대 한 그것을 사용 하 여 이미징 일관성을 유지 하.
- NR 얼룩 이미지 정량화
- ImageJ를 현미경을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.
- 스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.
- 같은 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택의 밝기/대비를 조정 하 고 적용을 클릭 하 여 모든 이미지에 변경 내용을 전파 합니다.
- 각 이미지 웜 윤곽을 그리 다 하는 NR에서 방출 되는 형광 강도 계량 분석 풀 다운 메뉴에서 측정 함수를 사용 하 여 다각형 선택 도구를 사용 합니다.
- 각 이미지에 대 한 5 개의 배경 위치를 측정 하 고 평균 배경 형광 강도 계산 합니다.
- 수식 N을 사용 하 여 각 이미지 웜으로부터 배경 형광 강도 빼기 = G-(A x B), N 순 형광, 총 형광에 대 한 G, 총 웜 지역 A와 B 평균 배경 형광에 대 한 의미.
- 웜 크기에 의해 형광 강도 정상화 하려면 각 벌레의 전체 면적에 의해 net 형광을 나눕니다. 결과 형광 강도, 픽셀 당 임의의 단위 (거리)으로 보고 됩니다.
참고: JPEG 형식으로 이미지를 수출 하지 마십시오. 압축 파일 저장을 더 관리 하면,이 형식에 의해 데이터 무결성 손상 됩니다. 모든 이미지 수정 및 동일 하 게 분석 다는 것을 확인 하십시오. 제대로 다른 배율에서 크기를 평가 하는 눈금 막대를 포함 하도록 하십시오. ImageJ를 사용 하 여 형광 강도 차이 더 나은 시각화 하려면 8 비트 RGB에서 이미지 형식을 전환 하 고 이미지 룩 업 테이블 (LUT) 메뉴에서 화재를 선택 합니다. 이 증가 색상 밝기 증가 형광 강도 상관 열 맵 이미지를 만듭니다.
2. 석유 지질 빨간 O 얼룩 (오로)
- 오로 재고 솔루션의 준비
- 250 mL 병에서 100% 소 프로 파 놀의 100 mL를 오로 가루 500 밀리 그램을 추가 하 고 잘 혼합.
- 일단 준비, 단단히 빛 노출 없이 밀봉 하는 솔루션을 저장 합니다.
- 오로 작업 솔루션의 준비
- 60% 소 프로 파 놀에 물 (3:2) 오로 재고 솔루션을 희석.
- 사용 하기 전에 작업 오로 솔루션 0.2 µ m 셀 루 로스 아세테이트 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링.
참고: 최상의 솔루션 품질을 위해 준비 작업 오로 솔루션 하루 전에, 그리고 섞어 하룻밤 보자. 그러나 솔루션은 필요한 같은 날, 희석과 혼합 사용 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 로커에 오로 솔루션. 락, 전에 오로 솔루션의 누설을 피하기 위해 파라핀 테이프에 원뿔 튜브 포장.
- 벌레의 오로 지질 얼룩을 위한 준비
- 선 충 류 성장 매체 (NGM) 원하는 생활 단계에 늦게 로그 OP50 대장균 으로 시드에 20 ° C에서 벌레를 성장.
- 접시에 PBST 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 모든 벌레는 접시에서 때까지 소용돌이. 접시를 기울기와 PBST의 1 mL와 함께 그것을 씻어. 1.5 mL microfuge 관 벌레 중지 전송.
- 원심 분리기 560 x g 1 분에 벌레 제거는 상쾌한 펠 릿 및 세척 단계 PBST의 1 mL와 함께 세 번 반복을 방해 하지 않고. 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.
- 웜 펠 릿을 40% 소 프로 파 놀의 600 µ L을 추가 하 고 3 분 동안 실내 온도에 바위.
- G 30 s 및 모든 표면에 뜨는 제거 하지만 100 µ L x 560에서 웜 웜 펠 렛을 방해 하지 않고 원심.
참고: PBST의 높은 볼륨을 사용 하 여 높은 처리량 얼룩 하 고 접시에서 벌레를 씻어. 웜 PBST에 보다 더 많은 샘플 고정 이전 15 분 세척 하지 마십시오. 추가 세척 할 상쾌한 박테리아의 지워지지 않습니다. 40% 소 프로 파 놀 nutator 또는 로커를 사용 하 여 부 화를 실시 합니다. 항상 전체 샘플 동요 발생 되도록 튜브 모니터링 합니다.
- 오로와 얼룩 지질
- 각 샘플에 600 µ L 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 반전 튜브 세 번 하 고 오로에서 벌레를 섞으십시오.
- 실 온에서 2 h 30 rpm에서 샘플을 회전 합니다.
- 1 분 동안 560 x g 에서 샘플 원심 고 모든 표면에 뜨는 하지만 100 µ L을 제거 합니다.
- PBST의 600 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 30 분 초과 오로 얼룩 제거 30 rpm에서 튜브를 회전.
- 샘플 1 분 560 x g 에서 원심 하 고 상쾌한의 50 µ L를 제외한 모든 제거.
- 더 나은 동물의 생식과 창 자 세포의 위치를 구별할,의 1 µ L을 추가 하 여 핵을 얼룩 (2-(4-amidinophenyl)-1 시간-indole-6-carboxamidine) (DAPI) 오로 작업 솔루션의 모든 1 ml. 이미징에 대 한 슬라이드를 장착 하기 전에 DAPI를 추가 2 h에 대 한 얼룩 오로 실시 합니다. 장 핵 크기에 더 큰 고 생식 개발 생식 세포에 의해 구별 된다.
참고: 후 오로 얼룩, 웜 수 있습니다 microfuge 관의 양쪽에 준수 고 눈에 띄는 펠 릿을 형성 하기 위하여 실패. 이 경우, 다시 벌레를 원심 하거나 적어도 10 분 동안 중력에 의해 침전 하는 벌레를 허용 합니다.
- 웜 이미징에 대 한 슬라이드의 준비
- 나머지 상쾌한에 벌레를 resuspend 하 고 솔루션을 잘 섞는다.
- 현미경 슬라이드에 벌레 서 스 펜 션의 5 µ L를 넣고 공기 폼 거품 확보는 coverslip 신중 하 게, 장소.
- 매니큐어와 이미지 웜 coverslip 인감.
참고: 고정 하 고 얼룩, 후 웜 매우 견고 하 고 플라스틱 하기 어려운 수 있습니다. 회피, 그들의 끝을 절단 하 여 넓은 구멍 펫을 확인 합니다. - 안 착 직후 이미징 하는 경우 24 h까지 4 ° C에서 마이크로 원심 분리기 랙에 슬라이드를 저장 합니다.
- 오로 얼룩진 벌레의 이미징
- 색상 가능 카메라 이미지 오로 얼룩진 벌레를 사용 하 여.
- 5 배 확대를 사용 하 여 이미지 보기의 한 필드에 여러 가지 벌레를.
- 개별 벌레의 더 나은 시험 10 배 확대로 전환.
- 압축으로 인해 데이터 손실을 방지 하려면 TIF 형식에서 이미지를 내보냅니다.
참고: 경우 오로 + DAPI 얼룩, 형광을 캡처할 수 있는 하나에 색상 가능 카메라를 전환.
- 오로 얼룩진 벌레의 이미지 분석
- ImageJ를 micrograph(s)을 업로드. 플러그인 풀 다운 메뉴에서 이미지 파일 인식 되지 않으면 바이오 형식 함수를 사용 합니다.
- 스택 함수에서 이미지 풀 다운 메뉴에서 이미지 스택 사용 하 여 여러 현미경을 비교 하면 이미지 스택을 만듭니다.
- 지질 작은 물방울의 가시성을 개선 하기 위해 동일한 풀-다운 메뉴에서 밝기/대비를 조정 합니다.
- 특정 조직 또는 동물의 체 내 지질 축적에 따라 이미지를 분류할 수 있습니다.
- 지질 지역화의 더 나은 평가 및 일반적인 이미지 유물 ImageJ를 사용 하 여 식별 이미지 풀 다운 메뉴에서 색상 기능을 선택 하 고 표시 각 RGB 구성 요소의 신호를 RGB로 스택 클릭 합니다.
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Representative Results
SKN-1은 bZip, cytoprotective 전사 요소는 포유류 NRF2와 상 동을 공유 하 고 지방산 산화를 중재에 표시 되었습니다. 그들의 식단에 포도 당 농도 따라 웜 constitutively 활성화 skn 1 대립 유전자와 다른 지질 수준 나 일 빨강7물 때를 표시 합니다. 그림 1A -C 표시 활성화 skn-1 동물 지질 수준을 증가 하는 조건에 노출 됩니다. NR 형광 FITC/GFP 채널을 사용 하 여 캡처한 소장, 따라 유명 하지만 머리, 꼬리, 창 자 루멘에 주차. 지질 수준 증가, 개별 NR 스테인드 입자는 더 분별, 어렵다는 낮은 노출 시간을 할 거 수 있습니다. 이 방법은 양적 프록시 형광 강도 사용 하 여 지질 축적에 대 한, 비록 지방 매장 되지 않은 세포 구조의 난다 얼룩 구별에 적절 한 고 신호 장 자동에서 간섭 하는 경향이 형광입니다. 따라서, 대체 레이블 및 레이블 비 방법을 해야 합니다 사용할 수 동시에 명확 하 게 동물10중립 지질 계량.
연령에 따라 체세포 고갈의 지방 (Asdf)는 생식 세포 지질 유지 변경된6세 벌레 동물 표시 하는 면에서 발생 하는 표현 형 체세포 지질을 감소. 기름 빨간 O 얼룩 하지 안정적으로 지질 수준, 단정 하지만 지질 지역화를 시각화에 대 한 우수한 이며 벌레에 Asdf 같은 지방 소모 고기를 결정 하기 위한 유용한 방법입니다. Asdf의 유무에 따라 벌레를 분류 하는 것이 쉽습니다, 그것은 중간 지방 손실 (그림 2A) 동물을 식별 하기 어려운 수 있습니다. 몇 반투명 영역 (그림 2B)와 몸 전체 얼룩 밝은 레드 쇼, 비 Asdf 동물에 비해 Asdf 벌레 창 자 세포 (그림 2C)에 눈에 띄는 지방 소모를 전시 한다. 종종 Asdf (그림 2D)를 개발 하는 과정에서 동물 표시 반투명 명소 대부분 뚱뚱한 손실 결국 발생 합니다. 또한, Asdf 벌레는 여전히 밝은 빨간색 얼룩이 머리와 꼬리 영역에서 표현 형 완전 한 체세포 뚱 땡이 손실, 하지만 비 세 (비-Asdf) 동물에 상대적으로 광범위 한 지방 소모에 의해 정의 되지 않은 때문에 기능이 있습니다. 기름 빨간 O, 얼룩이 지기의 사용은 따라서, 지질 지역화의 질적 결정 하 고 실질적으로 벌레에서 지방 예금 변경 고기 식별 수 있습니다.
그림 1: 나 일 무엇이 여 지질 얼룩 나 일 빨강의 얼룩 skn-1 돌연변이 증가 지질 축적 (A-C)을 유도 하는 조건 하에서 활성화. 함수 skn 1 긴장의 이득 (lax188) constitutively 활성 SKN-1을 렌더링 하는 E237K 아미노산 대체 항구. L4-단계 웜 0, 15 그리고 30 J/m2 기간 다음에 12-h 복구 unseeded NGM 접시에 NR 얼룩 및 이미징 하기 전에 자외선에 노출 되었다. 표시 된 이미지는 표현 형의 대표. 지질 정량화 섹션 1.7에서에서 언급 한 대로 수행 되었다. 불은 형광 이미지 사이의 강도 차이 보여 주는 열 이미지를 만드는 데 사용 되는 테이블 (LUT) 조회 ImageJ. 병합이 보여줍니다 FITC/GFP와 DIC 결합. 각 이미지에 대 한 형광 강도의 정량화 이미지 몽타주의 하단에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 붉은 O. 석유 지질에 의해의 얼룩이 기름 빨간 O 얼룩의 Asdf 표현 형 (A-D)의 유무를 보여주는 skn-1 돌연변이 (lax188) 활성화. A & D 쇼 동물 중간 Asdf 고기. B & C 오로 얼룩 반대 표시. B 비 Asdf 동안 C Asdf 표현 형을 정의 하는 생식 지방 축적에 수 반하는 증가 함께 실질적인 체세포 지방 소모를 보여줍니다. 벌레 144 이미징 뒤 오로 물 했다 hafter L1 동기화 동물 OP50 박테리아와 시드 NGM 미디어에 배치 했다. 표시 된 이미지는 Asdf 형 없이 동물의 대표. 삽입 된 만화 린, 외 에서 수정 6 부재 (B) 또는 체세포 지방 소모의 존재 (C)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
비만 및 대사 질환에서 상승 선 충 C. 세포와 조직에 지방 축적 조절 메커니즘 연구에 적합 한 모델을 만든다. 최근의 증거는 지질 수준에 변화는 인슐린 신호8, 호르몬 수용 체2, 생식 출력5의 정품 인증에서에서 배열 하는 세포질 과정에 대 한 상관을 제안 합니다. 레이블 없는 현미경 검사 법 및 크로마토그래피 방법, 나 일 빨강 및 오일에 비해 붉은 O 되며 벌레에 중립 지질을 지속적으로 얼룩에 사용 하는 상대적으로 저렴 한 염료 reproducibly10,,1213. 두 번째는 hypodermis, 소장, 생식 선 등 조직 중 지질 분포의 평가 용이 하 게 하는 동안 첫 번째 총 지질 수준의 정량화에 대 한 수 있습니다. 함께 사용 하면 NR와 오로 어떻게 유전자와 환경 변화에 영향을 미치는 지질 축적 하 고 있는 벌레에서 이러한 변경이 발생 하 고 결정 하기 위해 연구원은 가능 합니다.
이러한 염료, 그럼에도 불구 하 고, 할 하지 직접 평가 지질 축적 같은 비-침략 적 방식으로 자동차 현미경12. 따라서, 그들은 고정 하는 동안 오류가 발생 하는 경향이 고 얼룩, 측정 정확도13를 손상 될 수 있는. 또한, 이러한 염료 실수로 상호 작용 lipofuscin와 장 립,10,14저장 세포내 중성 지방 무관 형광의 결과로. 또한, 경우 지질 수준 낮은, 나타나는 NR 및 오로 얼룩 수 없습니다 구별 결과 침투성 문제에서 결과 또는 뚱뚱한 축적을 감소 하는 경우. 또한, 빛이 얼룩의 감도 저하 및 표백 사진 저장 및 활성 처리를 제한 하는 동안 특별 한 조치가 필요 합니다. 그러나, 수행 하 고 레이블 기반 분석 실험, NR에서에서 그림 결론 주의 행사는 고 오로 얼룩이 지는 우수한 지질 물질 대사 경로 연구 하 고 다른 생리와 그들의 상호 작용을 검사를 앞으로 유전 스크린의 기능입니다. Daf-2 및 지방 6 벌레의 사용 증가 및 감소 지질 축적의 상대적 비교를 각각 확인 하는 것이 좋습니다. 세척 단계 NR 및 오로 대 한 편집증 비슷합니다 얼룩 및. 따라서, 둘 다 같은 날에 수행할 수 있습니다. 그러나, NR 얼룩이 일치 하지 않습니다 후 6 h 때문에 나중에 이미징에 대 한 오로 얼룩진 벌레로만 슬라이드를 저장할 수 있습니다. 세척, 동안 포함 트리톤 100 X NR 및 오로, 투과율 향상 뿐만 아니라 plasticware 과도 한 준수 인 웜 손실을 방지 하기 위해 중요 하다. 또한, 벌레 각 얼룩을 최대 침투성을 위해 착 색 하기 전에 30 분 미만 세척 될을 해야 합니다. NR과 오로 부 화 시간 1 h 30 분 각각 감소 될 수 있습니다, 하는 동안 그것은 더 일관 된 얼룩 및 이미징 결과 대 한이 문서에서 제안 하는 시간에 따라 권장 합니다. 빛과 오로 솔루션 사용 배경 형광 이미징 동안 증가 하기 전에 필터링 하려면 실패에 NR 솔루션의 장기간된 노출. 이러한 얼룩 프로토콜 수행 3-4 h 이미징 시간 이외에 필요 합니다. 얼룩 인큐베이션 단계 사이 일시 중지의 대부분에서 2 h 제공, 하지만 좋습니다는 프로토콜 수행 됩니다 적은 중지로 지질 정량화의 모든 염료 기반 방법에 내재 된 오류의 많은 소스를 줄이기 위해 가능한 고 시험입니다.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품 NIH 교부 금에 의해 가능 하 게 되었다: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , BIOS Scientific Publishers. (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
