Quantifizierung der Lipid-Fülle und Bewertung von Lipid Verteilung in Caenorhabditis Elegans von Nil-rot und Öl rot O Färbung
Summary
Nil rote Färbung der festen Caenorhabditis Elegans ist eine Methode zur quantitativen Messung der neutral Lipid Ablagerungen, während Öl rote Färbung O qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den Geweben ermöglicht.
Abstract
Caenorhabditis Elegans ist eine außergewöhnliche Modellorganismus in der Lipidstoffwechsel und Energie-Homöostase zu studieren. Viele seiner Lipid-Gene sind beim Menschen konserviert und metabolisches Syndrom oder anderen Krankheiten zugeordnet werden. Prüfung der Lipid-Akkumulation in diesem Organismus kann durch Fixativ Farbstoffe oder markierungsfreie Methoden durchgeführt werden. Fixativ Flecken wie Nil rot und rot O Öl sind preiswerte, zuverlässige Methoden zur Messung quantitativ Blutfettwerte und qualitativ Lipid-Verteilung über Gewebe, bzw. zu beobachten. Darüber hinaus erlauben diese Flecken für Hochdurchsatz-Screening von verschiedenen Lipid-Stoffwechsel-Gene und Wege. Darüber hinaus ihre hydrophoben Natur erleichtert Lipid Löslichkeit, Interaktion mit der umgebenden Gewebe reduziert und Dissoziation in das Lösungsmittel verhindert. Obwohl diese Methoden effektiv bei der allgemeinen Fettgehalt zu prüfen sind, bieten sie keine detaillierte Informationen über die chemische Zusammensetzung und Vielfalt der Lipid-Ablagerungen. Für diese Zwecke markierungsfreie Methoden wie GC-MS und CARS-Mikroskopie besser geeignet, deren Kosten trotz.
Introduction
Lipide sind lebensnotwendig. Sie sind integrale Bestandteile von Membranen, fungieren als sekundäre Botenstoffe und signal-Wandler und haben wichtige Funktionen der Energiespeicherung. Wenn Fettstoffwechsel Dysregulated ist, führt dies zu Krankheiten wie Adipositas und Diabetes Typ II, die öffentliche Gesundheit Bedenken9drücken. Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist eine ausgezeichnete Modellorganismus in der Fettstoffwechsel zu studieren, weil es eine relativ kurze Lebensdauer, ein transparenter Körper, eine bekannte Zelle Abstammung und ein vollständig sequenzierte Genom hat. In erster Linie ein Hermaphrodit, C. Elegans erlaubt es den Forschern zu zahlreicher isogenen Tiere in kurzen Zeiträume Mitnahmeservice Hochdurchsatz-vorwärts genetischer Bildschirme, eine breite Palette von metabolischen Gene und Wege4zu studieren. Dieser Ansatz hat ein hohes Maß an Schutz in 273 C. Elegans -Lipid-Stoffwechsel-Genen zwischen Menschen, Mäuse, Ratten und Drosophila ergeben. Darüber hinaus haben mehr als 300 Lipid-Gene in C. Elegans menschlichen Orthologe, die mit Krankheiten, die in keinem Zusammenhang mit metabolischem Syndrom11verbunden sind. Prüfung der Lipid-Lagerung in C. Elegans hat traditionell meist auf Farbstoff-markierten Assays, gestützt, die robuste über Lipid-Ansammlung Auskunft. Seltener ist eine Beschreibung von Lipiden wo lokalisieren und gemessenen Unterschiede in Hülle und Fülle Lipid über Gewebe. Neuere Arbeiten ergaben jedoch, dass Lipid Verteilung genauso wichtig wie Lipid Ansammlung6sein kann.
In letzter Zeit Studien haben begonnen, Integration von Methoden wie hohe Leistung flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und kohärente Anti-stokes Raman-Streuung (Autos) Mikroskopie an Adresse der Mängel der Fleck-basierte Ansätze direkt analysiert den Inhalt der Lipid-Extrakte, spezielle Lipid Brüche und Lipid Ablagerungen, bzw.10,11. Darüber hinaus hat CARS-Mikroskopie ergeben, dass Nils rot nur als Proxy für Fettansammlung Verwendung als Fixativ Farbstoff, für den Einsatz als ein wichtige Fleck zum Ziel-Färbung des Auto-fluoreszierende Organellen10 führtdienen kann. Jedoch die erforderliche technische Know-how und Kosten im Zusammenhang mit diese Chromatographie und Mikroskopieverfahren nutzen ihre unhaltbar für viele Fragestellungen. In diesem Artikel besprechen wir eine bequeme und sichere Methode zum fixieren und neutral Lipid-Ablagerungen in C. Elegans mit Nil rot färben und Öl rot O um Lipid Fülle in ganze Tiere und in bestimmten Geweben zu unterscheiden.
Nil-rot, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, ist ein Benzophenoxazone Farbstoff, der leicht löst sich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, aber meist in Wasser unlöslich. Es ist eine ausgezeichnete Lysochrome Farbstoff verwendet, neutralere Lipiden wie Triglyceride zu beflecken oder Cholesterin Ester da freuen Sie sich auf eine starke Farbe solubilisiert gut in Lipiden, hat vernachlässigbare Interaktion mit umgebenden Gewebe und ist weniger löslich im Lösungsmittel als in Lipide. Es verfügt über eine Anregung und Emission Maxima von 450-500 und 520 nm, bzw.1. Bei Nil rot gefärbten C. Elegans für grüne Fluoreszenz angezeigt wird, können diskrete Lipid Körper beobachtet in den Darm und anderen Geweben entweder in Clustern oder gleichmäßig verteilt, je nach Genotyp oder experimentelle Behandlung des Tieres 7.
Öl rot O ist ein Lysochrome, fettlösliche Färbemittel verwendet, Triglyceride und Lipoproteine zu beflecken. Es ist eine Azo-Farbstoff genannt, weil seine chemische Struktur zwei azo Gruppen an drei aromatischen Ringen befestigt enthält. Es ist schwer zu ionisieren, das macht es sehr löslich in Lipiden. Seine Fleck Farbe ist rot und seine maximale Lichtabsorption 518 nm 3. C. Elegans gebeizt mit Öl rot O zeigen rote Lipid-Tröpfchen, die sich gegen das Tier durchsichtigen Körper, die qualitative Bewertung der Lipid-Verteilung zwischen den verschiedenen Geweben6erleichtert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Anstieg der Adipositas und metabolische Krankheit Preise macht C. Elegans ein geeignetes Modell, die Mechanismen zu studieren, die Fettansammlung in Zellen und Geweben zu regulieren. Aktuelle Hinweise darauf, dass die Änderungen im Blutfettwerte mit zellulärer Prozesse von Insulin Signalisierung8, die Aktivierung der Hormon-Rezeptoren als2Reproduktionsleistung5korreliert sind. Im Vergleich zu markierungsfreie Mikroskopie und Chromatogr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde ermöglicht durch den NIH-Zuschuss: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
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