Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O
Summary
Nilo rosso macchiatura di fisso Caenorhabditis elegans è un metodo per la misurazione quantitativa dei depositi di lipidi neutri, mentre olio rosso O colorazione facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi fra i tessuti.
Abstract
Caenorhabditis elegans è un organismo modello eccezionale in cui studiare il metabolismo dei lipidi e dell’omeostasi energetica. Molti dei suoi geni del lipido sono conservati negli esseri umani e sono associati con la sindrome metabolica o altre malattie. Esame di accumulazione del lipido in questo organismo può essere effettuato da coloranti fissativi o metodi privo di etichetta. Macchie di fissativo come Nilo rosso e olio rosso O sono modi poco costosi, affidabili per misurare quantitativamente i livelli di lipidi e di osservare qualitativamente distribuzione dei lipidi attraverso tessuti, rispettivamente. Inoltre, queste macchie consentono per high throughput screening di vari geni del metabolismo di lipidi e percorsi. Inoltre, loro natura idrofobica facilita la solubilità dei lipidi, riduce l’interazione con i tessuti circostanti e previene la dissociazione in solvente. Anche se questi metodi sono efficaci ad esaminare il contenuto di lipidi in generale, non forniscono informazioni dettagliate circa la composizione chimica e la diversità dei giacimenti del lipido. Per questi scopi, metodi privo di etichetta come microscopia di GC-MS e automobili sono meglio adatto, le spese in deroga.
Introduction
I lipidi sono essenziali per la vita. Essi sono parti integranti delle membrane, fungono da messaggeri secondari e trasduttori del segnale e hanno funzioni cruciali in stoccaggio di energia. Quando il metabolismo dei lipidi è dysregulated, si porta a malattie come obesità e diabete di tipo II, che sono premendo di preoccupazioni di sanità pubblica9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo modello eccellente per studiare il metabolismo dei lipidi perché ha un ciclo di vita relativamente breve, un corpo trasparente, un lignaggio di conosciuti delle cellule e un genoma sequenziato completamente. Principalmente un ermafrodito, c. elegans permette ai ricercatori di raccogliere grandi quantità di animali isogeni in breve periodi di tempo a carryout high throughput avanti schermi genetici per studiare una vasta gamma di geni e vie metaboliche4. Questo approccio ha rivelato un alto grado di conservazione in 273 c. elegans geni di metabolismo lipidico tra gli esseri umani, topi, ratti e della drosofila. Inoltre, oltre 300 geni del lipido in c. elegans hanno orthologues umana che sono associati con le malattie non correlate alla sindrome metabolica11. Esame di immagazzinaggio del lipido in c. elegans ha per lo più tradizionalmente, tingere-contrassegnati saggi, che forniscono informazioni affidabili sull’accumulo di lipidi. Meno comune è una descrizione di dove localizzare i lipidi e le differenze misurate in abbondanza di lipidi attraverso tessuti. Tuttavia, recenti studi hanno rilevato che la distribuzione dei lipidi può essere importante come accumulo di lipidi6.
Ultimamente, gli studi hanno cominciato a integrare metodi come spettrometria liquida di cromatografia-Massachussets ad alte prestazioni (HPLC-MS), spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS), e anti-stokes coerente della microscopia Raman scattering (automobili) all’indirizzo del carenze di approcci basati su macchia analizzando direttamente il contenuto di estratti del lipido, frazioni specifiche del lipido e giacimenti del lipido, rispettivamente10,11. Inoltre, microscopia di automobili ha rivelato che red Nilo può servire solo come un proxy per accumulo di grasso quando viene utilizzato come una fissativo della tintura, per il suo uso come una macchia vitale conduce alla macchiatura fuori bersaglio di auto-fluorescente organelli10. Tuttavia, le competenze tecniche necessarie e i costi associati con questi cromatografia e microscopia Metodi rendono loro uso insostenibile per molte domande di ricerca. In questo articolo, discutiamo un metodo conveniente e affidabile per fissarsi e macchia i depositi di lipidi neutri in c. elegans utilizzando Nilo rosso e olio rosso O per distinguere l’abbondanza del lipido in animali interi e in tessuti specifici.
Rosso del Nilo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, è un colorante benzophenoxazone che prontamente si dissolve in vari solventi organici, ma è praticamente insolubile in acqua. Si tratta di un eccellente lysochrome colorante utilizzato per macchiare lipidi neutri come trigliceridi o esteri del colesterolo perché è dotato di un colore forte, solubilizza bene in lipidi, ha trascurabile interazione con i tessuti circostanti ed è meno solubili in solvente rispetto a lipidi. Ha un’eccitazione e emissione massimi di 450-500 e 520 nm, rispettivamente1. Quando il Nilo rosso-macchiato di c. elegans è visto per fluorescenza verde, corpi discreti del lipido possono essere osservati in tutto l’intestino e altri tessuti o in cluster o uniformemente dispersi, a seconda del genotipo dell’animale o il trattamento sperimentale 7.
Olio rosso O è un lysochrome, liposolubili colorante usato per macchiare i trigliceridi e lipoproteine. Si chiama un colorante azoico perché la sua struttura chimica contiene due gruppi azoici, collegati a tre anelli aromatici. È difficile ionizzare, che lo rende altamente solubili nei lipidi. La macchia di colore è rosso e il massimo di assorbimento della luce è 518 nm 3. C. elegans macchiato con olio rosso O Visualizza le goccioline del lipido rosso che si stagliano contro il corpo trasparente dell’animale, che facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi tra diversi tessuti6.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’aumento dell’obesità e tassi di malattia metabolica rende c. elegans un modello adatto per studiare i meccanismi che regolano l’accumulo di grasso nelle cellule e tessuti. La prova recente suggerisce che i cambiamenti nei livelli di lipidi sono correlati con i processi cellulari che vanno da8, l’attivazione di recettori dell’ormone2, a capacità riproduttiva5di segnalazione dell’insulina. Rispetto ai metodi di cromatografia, Nilo rosso e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile dalla concessione NIH: R01GM109028 (S.P.C)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
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