Summary
心外膜在心脏的发育和修复中起着至关重要的作用, 它为心肌壁提供细胞和生长因子。在这里, 我们描述了一种培养人原发性心外膜细胞的方法, 能够对它们的发育和成人特征进行研究和比较。
Abstract
心外膜是一种覆盖心肌的上皮细胞层, 在心脏发育过程中, 以及在缺血性损伤后心脏的修复反应中具有重要作用。当激活时, 心外膜细胞经历了称为上皮间质转移的过程, 为再生心肌提供细胞。此外, 心外膜通过分泌基本的分泌因子而做出贡献。为了充分了解心外膜的再生潜能, 需要一个人类细胞模型。在这里, 我们概述了一个新的细胞培养模型, 从人类成年和胎儿心脏组织中提取原发性心外膜衍生细胞 (EPDCs)。为了分离 EPDCs, 心外膜从心脏标本的外部进行解剖, 并处理成单个细胞悬浮。其次, EPDCs 被镀和培养在 EPDC 培养基含有5激酶抑制剂 SB431542 保持其上皮表型。TGFβ刺激诱发急诊。这种方法首次能够在控制的环境中对人心外膜急诊的过程进行研究, 并有助于在 EPDCs 的 secretome 中获得更多的洞察力, 从而有助于心脏再生。此外, 这种统一的方法可以直接比较成人和胎儿的心外膜行为。
Introduction
心外膜, 一个单细胞上皮层, 信封心脏, 是至关重要的心脏发育和修复 (在史密特et 。1). 发育, 心外膜产生于 proepicardial 器官, 一个小结构位于发展的心脏基地。在发展天 E9.5 在老鼠和4星期以后构想在人, 细胞开始从这个花椰菜结构迁移并且包括开发的心肌2。一旦形成单个上皮细胞层, 心外膜细胞的一部分就会进行上皮间质的转移 (急诊室)。在急诊室, 细胞失去了上皮特征, 如细胞粘连, 并获得一个间充质表型, 使他们有能力迁移到发展中的心肌。经形成的心外膜衍生细胞 (EPDCs) 可分化为多种心肌细胞类型, 包括成纤维细胞、平滑肌细胞和潜在心肌细胞和内皮干细胞3, 虽然后两个细胞的分化人口仍需进行辩论 (在史密特等) 中进行审查。4). 此外, 心外膜提供了指导分泌信号的心肌调节其生长和血管化5,6,7,8。多项研究表明, 心外膜形成受损导致心肌发育缺陷9,10, 血管11, 传导系统12, 强调至关重要的心外膜对心脏形成的贡献。
虽然在成人心脏心外膜是存在作为休眠层数, 它在缺血13以后变得激活。心外膜重新激活损伤后概括为心脏发育, 包括增殖和急诊14所描述的几个过程, 尽管效率较低。有趣的是, 虽然确切的机制还没有完全理解, 但通过治疗可以改善心外膜对修复的贡献,例如, 胸腺素β415或修改 VEGF-mRNA16, 从而改善心脏心肌梗死后功能。因此, 心外膜被认为是一个有趣的细胞来源, 以加强内源性修复受伤的心脏。
心脏发育的机制经常概括在损伤期间, 虽然以一种较不有效的方式。为了寻找心外膜激活剂, 我们可以确定和比较胎儿和成人心外膜的全部容量, 这是至关重要的。此外, 从治疗的角度来看, 重要的是, 除了动物实验外, 我们还要对人类心外膜的反应提供知识。在这里, 我们描述了一种方法, 以分离和培养人成体和胎儿心外膜衍生细胞 (EPDCs) 在上皮细胞样的形态学和诱发急诊。本模型旨在探讨和比较成人和胎儿心外膜细胞的行为。
该协议的主要优点是使用了人的心外膜材料, 尚未深入研究。重要的是, 所描述的隔离和细胞培养协议提供了一个统一的方法来获得胎儿和成人鹅卵石 EPDCs, 使这两个细胞来源的直接比较。此外, 由于心外膜是根据其位置隔离的, 因此确保单元格实际上是 epicardially 派生的17。
虽然以前已经建立了人类的 EPDC 隔离方法, 但它们大多依赖于将心脏或心外膜组织镀到细胞培养皿18,19的生长协议。这种方法可以专门为部分丧失其上皮表型的细胞进行移植, 更容易接受自发的急诊急救。在当前的协议中, 心外膜首先被处理成一个单一的细胞溶液, 允许隔离的 EPDCs 保持其上皮状态。因此, 该方法提供了一个固体的体外模型来研究心外膜急诊。
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Protocol
所有人体组织标本的实验均由莱顿大学医学中心伦理委员会批准, 并符合赫尔辛基宣言。所有步骤都用无菌设备在细胞培养流柜中进行。
1. 筹备工作
- 在1:1 的比例下, 将 Dulbecco 修饰的鹰培养基 (DMEM 低葡萄糖) 和中 199 (M199) 混合, 制备 EPDC 培养基。添加10% 热灭活胎牛血清 (血清, 热灭活25分钟在56摄氏度), 并补充 100 U/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素。预热的 EPDC 介质在37°c 水浴。
- 预热胰蛋白酶 0.25%/EDTA (1:1) 在37°c 水浴。
- 用明胶涂水井。将0.1% 的明胶/PBS 添加到每一个井中, 在37摄氏度时至少15分钟孵化出板材。在表 1中总结了所需的单元格区域性板的准则。在电镀细胞之前小心地去除所有液体。
- 准备一个10毫米 SB431542 (锑) 的库存溶液, 稀释在亚砜 (谨慎)。使50µL 整除数在锥形底部聚丙烯离心管, 如离心管, 并存储在-20 摄氏度。请注意, 某人整除数只能解冻一次。
2. 成人和胎儿心脏标本的检索和贮存
- 在50毫升的15毫升高葡萄糖 DMEM 的外科手术中, 直接储存成人耳部, 含10% 只血清, 100 毫升青霉素, 100 毫克/毫升链霉素, 4 摄氏度。标本一般 3-5 厘米的大小, 可以储存最多48小时后解剖。
- 储存胎儿心脏从选择性流产材料获得的 EPDC 培养基在4°c, 24 小时后隔离。对于本协议, 请在 12-22 周之间使用妊娠期样本。请注意, 整个心脏可以用来隔离心外膜。
3. 心外膜层的隔离
- 在层流柜中, 用 pbs 准备一个100毫米的细胞培养皿, 并在盖子上放置一个单独滴 (~ 200 µL) 的 pbs。填充15毫升管与5毫升预热 EPDC 培养基。
- 将组织放在充满 PBS 的细胞培养皿中。在手术过程中要确保组织经常湿润。
- 使用显微镜, 从组织样本中取出尽可能多的心外膜层, 用镊子将其剥离。
注意: 心外膜可以被识别为非常薄, 透明的层紧密附着在心脏的外部 (图 1A)。尽量避免与心外膜脂肪组织和血管的污染, 因为这将阻碍隔离。 - 在盖上的 PBS 液滴上收集心外膜组织的部分。
- 使用手术刀 (图 1B) 将心外膜组织切成小块 (0.5 毫米3), 或者使用小钳的锋利尖。请注意, 这些片断应该能够通过 P1,000 吸管提示 (步骤 3.6)。
- 将1毫升的胰蛋白酶加入到心外膜组织中, 用 P1,000 吸管尖端收集切片和胰蛋白酶。将组织转移到1.5 毫升锥形离心管 (图 1C)。
- 在37摄氏度的水浴中孵化出10分钟的管子, 同时晃动在60转每分钟。
- 从水浴中取出管子, 用70% 乙醇清洗管子的外部。
- 允许组织下沉到管的底部 (图 1D), 并小心地将含有心外膜细胞的上清液转移到含有5毫升 EPDC 培养基的15毫升管中, 以使胰蛋白酶失效。
- 用1毫升胰蛋白酶补充锥形离心管中剩余的组织, 并通过轻轻吹打上下混合。
- 重复步骤3.7 至3.10 两次。在最后一步, 在总共30分钟的胰蛋白酶孵化后, 将上清和其余的心外膜组织转移到含有 EPDC 培养基的管内。
- 当所有细胞以 EPDC 培养基收集时, 通过10毫升的注射器轻轻地将悬浮液通过一个19口径的针头插入一个新的15毫升管, 机械地分离细胞 (图 1E)。
注: 在通过针头通过溶液前, 一定要融汇吹打的悬浮液, 以防止针头被堵塞。 - 要进一步离解细胞, 重复步骤3.12 与21口径针。
- 将100µm 细胞过滤器放在50毫升管的顶部, 用10毫升吸管将含有心外膜细胞的培养基转移到滤网上, 以除去所有剩余的团簇 (图 1F)。
- 通过吹打5毫升 EPDC 培养基将过滤器清洗到过滤器上以收集残余细胞。
- 吸管细胞悬浮从50毫升管变成15毫升管。由于细胞下沉到管底部, 在吹打前轻轻摇动溶液。
注意: 虽然这一步是不必要的, 一个较小的管有助于可视化颗粒后离心。 - 离心机在室温下为 200 x 克5分钟 (图 1G)。
- 在 EPDC 介质 (表 1) 的所需卷中, 移除上清和并用重悬单元格颗粒(图 1H)。
注: 对于胎儿 EPDCs, 直接使用含有10µM ALK5 激酶抑制剂 (EPDC + 锑) 的 EPDC 培养基。在第一段中, 成人细胞在没有某人的情况下可以被电镀。 - 板上的细胞悬浮在明胶涂层培养板 (图 1I)。井的大小取决于心外膜组织样本的大小 (表 1)。注意低融合会诱发急诊的发生。
- 将单元格放在孵化器中至少48小时, 在37摄氏度, 5% CO2 , 以允许单元格附加到培养板上。
4. EPDCs 文化
- 至少每3天补充一次 EPDC。
- 使用显微镜至少每3天检查一次细胞。当单元格达到融合时,即, 当培养板完全覆盖单元格时, 通过1:2 表面比的单元格。请注意, 到达融合可能需要 5-10 天。
- 使用吸管或吸入系统 (如, 例如) 将玻璃吸管吸出介质。
- 通过将 PBS 添加到细胞中, 仔细冲洗细胞。轻轻地旋转盘子, 吸入 PBS。
- 在盘子里加入胰蛋白酶。用胰蛋白酶轻轻旋转盘子覆盖所有细胞, 在37摄氏度时将板材孵化1分钟。
注: 尽可能少使用胰蛋白酶 (指示: 200 µL 每井6井板) - 轻敲盘子, 机械地从盘子的底部分离出细胞。使用显微镜目视检查细胞是否已分离。如果没有, 孵化细胞培养板多一分钟。
- 将所需的 EPDC + 锑培养基添加到细胞中, 并用重悬吹打向上和向下, 并将细胞悬浮液转移到新的明胶涂层培养板上。
注意: 一般情况下, 细胞可以保持在鹅卵石形态, 直至8。
5. 在 EPDCs 中诱导急诊医师
- 为了诱导急诊医师, 将细胞与胰蛋白酶分离, 将细胞转移到 EPDC + 锑培养基中1:2 表面比的新明胶涂层井, 如4所述, 在37摄氏度、5% CO2上孵育至少24小时。
- 检查融合是否为 50-70%, 如果 EPDCs 有鹅卵石形态。
注意: 融合影响 EPDCs 接受急诊医师的能力。 - 从细胞中吸取培养基, 用 PBS 仔细冲洗细胞 (见步骤 4.2.1-4.2.2)。
- 在 EPDC 培养基中刺激 1 TGFβ3/毫升的细胞, 并将它们放在孵化器中37摄氏度, 5% CO2 5 天。注意, 在刺激过程中, 不需要补充含有 TGFβ3的 EPDC 培养基。
- 每天监视单元格。5天后, 接受急诊的细胞由纺锤形形态学 (图 2A) 识别。
- 培养纺锤形 EPDCs 根据4描述的方法, 不添加某人或 TGFβ到 EPDC 培养基。请注意, 一般情况下, 主轴形状的 EPDCs 可以培养到20通道。
- 用抗体对间充质标志物αSMA 或波形或罗丹明检测 F 肌动蛋白应激纤维 (图 2B) 的形成, 或使用 qRT PCR 技术对急诊患者相关基因进行免疫荧光染色, 验证其发生情况 (例如, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, n-钙黏蛋白, MMP3, 蜗牛, 蛞蝓) (图 2C和表 2)。
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Representative Results
在这里, 我们概述了一个简单的协议, 以隔离 EPDCs 从人类成人和胎儿心脏组织 (图 1)。此协议利用心外膜在心脏外部的易于访问的位置 (图 1A)。解剖后的心耳廓染色表明, WT1+ 心外膜被删除, 而基础心外膜下细胞外基质和心肌组织保持不变 (图1J)。以前已经进行了广泛的描述, 表明 EPDCs 表达的心外膜标记,例如, ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 和缺乏其他心脏常驻细胞类型的表达,例如, PECAM1, ISL1, CD34 和 TNNT2。17
成人 (图 1K) 和胎儿 (图 1L) EPDCs 在 ALK5 激酶抑制剂的存在下培养 SB431542 显示鹅卵石形态学。然而, 根据捐赠者和文化条件, 胎儿 EPDCs 可以接受急诊医师, 尽管有某人在场。这可能导致鹅卵石单元格中的纺锤形细胞 (参见图 1L中的箭头)。请注意, 从胎儿组织中分离出鹅卵石状细胞并不总是可行的, 可能导致大部分纺锤形细胞的衍生。由于这些细胞生长更快, 他们将迅速 overgrow 其他细胞类型。
在成人和胎儿细胞中, 可通过 TGFβ320孵化5天诱发急诊医师, 这是由纺锤形细胞的明显形态学转变 (图 2A) 所证明的。与未经治疗的控制 ("空") 显示, 胎儿 EPDCs 将接受自发的急诊手术后, 移除某人, 而成年 EPDCs 将只接受急诊医师的刺激与 TGFβ3。为验证急诊医师, EPDCs 是 immunostained 与阿尔法平滑肌肌动蛋白 (αSMA), 一个间充质标记 (图 2B)。此外, 在成人 EPDCs 中证实了急诊医师使用 qRT PCR 显示下调的心外膜标记 WT1 和上调的间充质标记 POSTN, αSMA, 胶原蛋白 1A1, MMP3 和 n-钙黏蛋白 (图 2C)。关于成人和胎儿心外膜急诊的综合实验发表在17之前。
| 组织 | 井型 | 细胞生长区 (cm2) | 介质容积 (毫升) | 增加某人 |
| 胎儿 | 24 | 1。9 | 0。5 | 直接 |
| 成人小 (< 4 厘米) | 12 | 3。8 | 1 | 1st通道后 |
| 成人大 | 6 | 9。6 | 2 | 1st通道后 |
| (> 4 厘米) |
表 1: 选择适当的细胞培养板的指南.所需的井径取决于所分离的心外膜细胞的数量。这些指南可以作为一个经验法则来选择合适的细胞培养板。
| 基因 | 序列 |
| WT1 转发 | GAA TGC ATG ACC TG |
| WT1 反转 | GGC 的 GC |
| n-钙黏素向前 | ACC 和瑞声 AGC |
| n--钙黏蛋白反转 | AGG 的抗体 |
| POSTN 转发 | GGA GGC AAA 级 GT |
| POSTN 反转 | GGC TGA GGA AGG TGC TAA 股份公司 |
| SMA 向前 | CCG GGA GAA |
| SMA 反转 | GAA GGA 海湾合作委员会动漫委员会 AG |
| MMP3 转发 | TGG ATG CCG 猫 ATG AAG |
| MMP3 反转 | TGG AAA 级 |
| COL1A1 转发 | GAA GAA 猫 CAG |
| COL1A1 反转 | CGC 猫法 GGG |
| GAPDH 转发 | GCT ATC C |
| GAPDH 反转 | 海合会民航局 |
| B2M 转发 | CCC CT |
| B2M 反转 | GCT 交 ATG |
表 2: 用于验证 EPDCs 中的急诊医师的底漆序列.qRT PCR 的正向和反向引物序列, 用于测定成人 EPDCs 中几种急诊相关基因的表达。
图 1: 对心外膜派生单元的隔离 (EPDCs).(A) 描述的是从人的心脏去除的成人耳廓与一个稀薄的外层膜层, 心外膜, 被去除。黑色箭头指向心外膜。(B I)EPDCs 隔离方法的可视化表示。黑色箭头指向单元格颗粒。(J) 对心外膜的无解剖的心耳廓进行免疫荧光染色。缩放栏:50 µm. (K) 两个不同的成人 EPDC 隔离的代表性图片 (L) 两个不同的胎儿 EPDC 隔离培养的代表图片黑色箭头表示胎儿间充质样细胞EPDC 文化。刻度条: 200 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 验证成人和胎儿心外膜衍生细胞 (EPDCs) 中的急诊医师.成人和胎儿 EPDCs 培养与某人, 不治疗 (空) 或刺激与 TGFβ3 5 天。(A) 代表明亮的字段图片。缩放栏: 200 µm (B) 染色 DAPI 和αSMA。刻度条: 100 µm (C) 与急诊医师相关基因的 mRNA 水平, 用 qRT PCR 法测定成人 EPDCs。测量值被规范化为 GAPDH 和 B2M 表达式。值被描述为平均值 + SD 2 ^-ΔΔct (n = 2)。缩写: WT1:Wilms ' 肿瘤 1, MMP3: 基质金属蛋白酶 3, POSTN: Periostin, αSMA: 阿尔法平滑肌肌动蛋白, Col1A1:Collagen 1A1。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以隔离和培养从人类成年和胎儿心脏的原发性心外膜细胞。这些单元格的广泛描述以前已发布17。我们已经表明, 两种细胞类型可以保持作为上皮鹅卵石样细胞, 当培养与 ALK5 激酶抑制剂 SB431542。在发育和损伤后反应过程中, 急诊急救是心外膜激活的体内的一个组成部分。通过添加 TGFβ, 可以对急诊医师进行研究。重要的是, 我们以前观察到, 当某人被移除时, 胎儿 EPDCs 迅速接受自发急救, 而成年 EPDCs 只在刺激17时接受急诊医师。研究胎儿 EPDCs 的这些过程有助于了解如何在损伤后最佳激活成人心外膜。
所提出的方法依赖于患者的材料, 这是在手术中得到的。因此, 人们可以期待在材料的状态的一些变化, 这是由于病人的变异性或在操作剧场收集材料的速度。这种变异可以解释过程中的差异: 1) 如何容易从心肌解剖心外膜, 2) 黏附的孤立细胞的板, 3) 的能力, 以预防或接受急诊医师, 4) 增殖速度。一般来说, 快速隔离是更好的细胞生存。主要的关键点是从心肌中剥离心外膜。如果心外膜是强烈坚持的基础组织, 15 分钟前治疗心脏组织与胰蛋白酶可以帮助消除心外膜更容易。此外, 胰蛋白酶治疗的功效取决于多种因素, 包括胰蛋白酶活性和组织组成。因此, 如果观察到低产量, 可以调整胰蛋白酶的潜伏期。此外, 如果在向下旋转后没有可见的单元颗粒, 则在运行筛选器之前, 该解决方案可能没有完全分离。在通过注射器或使用额外的小注射器之前, 将溶液混合在一起, 可能有助于分离细胞。应仔细考虑播种 EPDCs 的井径, 使细胞保持其上皮状态。表 1给出了一个指示, 但如果只有一小部分胎儿心脏可以使用, 并且在较小的井中电镀更方便, 则可以偏离本指南。
由于胎儿细胞将立即接受急诊医师没有某人17, 胎儿 EPDCs 应始终与某人镀。然而, 成年 EPDCs 倾向于保持他们的上皮形态学, 因此可以在第一段的前48小时内没有某人被镀, 以促进细胞黏附。在第一个段落以后, 成人和胎儿 EPDCs 连续培养与某人防止自发急诊医师。此外, 低细胞密度是急诊急救的重要诱因。因此, EPDCs 不应培养在50% 融合以下。另一方面, 如果需要急救, 请确保 EPDCs 的种子不太密, 并且保持在70% 融合以下。虽然这个协议使用 TGFβ3, 刺激与 TGFβ1和-2 可能导致急诊医师在 EPDCs 并且 (未发表的观察)。
在本协议中, 细胞直接分裂而不向下旋转, 因为我们在使用离心机时观察到较低的细胞存活率。因此, 在添加含血清的培养基时, 使用低容量的胰蛋白酶来保证其失活是至关重要的。
经过 6-8 通道, EPDCs 与上皮形态学将停止生长或将接受急诊医师自发。因此, 在实验中, 我们用鹅卵石 EPDCs 在通道3和通道6之间。相比之下, EPDCs 与骨髓间质形态学的脆弱程度较低, 可以培养到20通道。然而, 在实验中, 我们从来没有在 10th通道后使用主轴 EPDCs。
由于心外膜位于心脏的外侧, 很容易与底层组织分离, 因此细胞的真实性很明显, 严重污染的几率很低。虽然脂肪组织或血管有时会粘在单独的心外膜层, 但大多数细胞在隔离过程中不会通过过滤器, 否则在 EPDC 细胞培养中无法存活。此外, 如前所述, 使用人体材料提供了一个独特的模型来调查人的心外膜细胞行为.人们知道, 例如, 心外膜脂肪组织不同物种之间, 强调人类心外膜细胞模型的必要性21。
应注意的是, 心脏耳廓是在病人的心脏手术期间获得的, 因此, 在疾病, 使用药物, 年龄和性别的差异, 捐献者可能影响的重现性实验。因此, 应在几个隔离上进行实验, 以获得有效的结果, 并允许得出坚实的结论。此外, 根据研究问题, 人们可以专门选择只使用心外膜的患者的缺血性疾病或患者的非缺血性瓣膜病, 这是预期的行为不同。
提示心房心外膜可能有不同的特点从脑室心外膜2, 从而质疑, 如果心外膜从心房心脏耳廓提供了一个有效的模型的心外膜行为。在这方面, 必须指出, 我们不能发现胎儿心房和心室衍生 EPDCs (未发表的数据) 之间的差异。然而, 使用心外膜从成人心室将是最终的细胞来源, 以验证这一点。然而, 采集成人心室大样本 EPDC 隔离对患者具有很强的侵入性, 因此目前在本院尚不可行。
我们观察到, 某人并不总是足以防止急救, 主要是在胎儿 EPDCs。当胎儿 EPDCs 在某人面前接受急诊医师的时候, 我们将他们排除在实验之外。因此, 用于实验的细胞被选择以保持上皮表型的能力来回应某人。我们推测胎儿细胞在急救过程中已经超出了一定的阈值, 而与某人的抑制无法阻止。
这个心外膜细胞模型有几个应用, 因为开发和成人心外膜可以被调查。在我们的实验室中, 我们专注于改善心脏损伤后的心外膜再生反应。成人 EPDCs 可用于检测诱发急诊的化合物, 目的是寻找一种潜在的治疗药物, 改善心外膜的再生反应。此外, 还可以测量 EPDCs 分泌的因素, 以理解分泌信号对 (再) 生成心肌的影响。此外, 由于我们观察到胎儿 EPDCs 比成人 EPDCs 更容易接受急诊手术, 我们调查胎儿和成人 EPDCs 之间的差异。确定增加胎儿活化的基础机制, 可以为改善成人心脏的心外膜活化提供线索。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了荷兰科学研究组织 (NWO) (VENI 016.146.079) 的支持, 还有一个 LUMC 研究金与 AMS, LUMC Bontius Stichting (MJG)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
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