הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה
Summary
תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.
Abstract
מניפולציה סלקטיבי של עמוד השדרה subpopulations עצביים בעיקר הושגה על ידי שתי שיטות שונות: 1) גנטיקה Intersectional, לפיה העכברים הטרנסגניים כפולים או משולשים נוצרים על מנת להשיג ביטוי סלקטיבי של הכתב או אפקטור . ג’ין (למשל, ממיקומה Rosa26) באוכלוסייה הרצוי בעמוד השדרה. 2) הזרקה תוך ב- Cre תלוית רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV); כאן וקטורים תלויי-Cre AAV קידוד הגן כתב או אפקטור להתמקד מוזרקים לתוך חוט השדרה של עכברים לבטא recombinase Cre ב subpopulation עצביים הרצוי. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור וקטורים rAAV תלויי-Cre, כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני מגזרים L3-L5 עם rAAVs. כמו הקטעים בעמוד השדרה המותני L3-L5 הם innervated על ידי אלה החישה הניריונים היקפיים, המעבירים מידע חושי hindlimbs, ניתן הספונטניות, תגובות החישה בדיקות ליישם את hindlimb חולשת לצד הזרקה נותחו על מנת לחקור את הפונקציה של הנוירונים מניפולציה בעיבוד חושי. אנו מספקים דוגמאות כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לנתח גנטית מוגדרת על ידי קבוצות משנה של נוירונים בעמוד השדרה. היתרונות העיקריים של וירוס בתיווך transgene ביטוי Cre העכברים הטרנסגניים בהשוואה העיתונאי הקלאסית transgene העכבר-induced ביטוי הן הבאות: 1) rAAVs תלויי-Cre שונים קידוד חלבונים כתב או אפקטור שונים יכול להיות מוזרק Cre הטרנסגניים שורה אחת, ובכך להתגבר על הצורך ליצור עכבר הטרנסגניים מרובים במספר שורות. 2) הזרקה תוך מגביל מניפולציה של התאים לבטא-Cre ההזרקה, הפעם לאחר ההזרקה. החסרונות העיקריים הם: 1) כתב ביטוי גנים של rAAVs הוא משתנה נוסף. 2) הניתוח נדרש מגלי הנוירונים בעמוד השדרה של עניין. וזה מתאים יותר משתי השיטות תלוי נוירון האוכלוסייה ומחקר השאלה יש לטפל.
Introduction
חוט השדרה הגבי חיוני חילופי מידע בין הפריפריה של הגוף והמוח. גירויים כגון חום, קור, מגע, או גירויים יתמודד מזוהים על ידי נוירונים היקפיים מיוחדים, אשר מעבירים את המידע הזה נוירונים של הקרן הגבי של חוט השדרה. . הנה, רשת מורכבת של interneurons מעכבות, מעוררים שמחליש, בסופו של דבר ממסרי מידע חושי באמצעות הקרנה בעמוד השדרה נוירונים כדי supraspinal אתרים1,2. חישובי שביצעו השדרה אינטר-הקרנה נוירונים בשער המידע החושי, ובכך לקבוע איזה מידע הוא לדכא או מועבר בעוצמה אילו. שינויים קליטת גירויים, כגון איזון שונה בין עיכוב ו עירור, עלולים לגרום תפקוד חושי כגון רגישות יתר או allodynia (כואב תחושות לאחר גירוי שאינו מכאיב בדרך כלל). שינויים אלה הם חשבו להיות שהגורם הבסיסי של כאב כרוני שונים קובע3,4. לפיכך, מעגלים בעמוד השדרה הם בעלי חשיבות גבוהה בעיבוד חושי ומכאן בתפיסת העצמי וסביבה של אורגניזם. עם כניסתו האחרונה, שילוב של מולקולרית, גנטי, ואת טכניקות ניתוחיות המאפשרות מניפולציה מדויק של נוירון בעמוד השדרה גנטית מזוהה subpopulations, מדענים עכשיו מתחיל להבין את המעגלים בעמוד השדרה הבסיסית אחראי על העיבוד של שיטות חושית ברורים.
הזרקה תוך של rAAV לתוך עכברים פראי-סוג או הטרנסגניים תרם באופן משמעותי אל מניפולציה, ניתוח, הבנה של הפונקציה של הנדונים של נוירונים בעמוד השדרה5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. טכניקה זו מאפשרת המסירה של סמן חלבונים (כגון GFP / GFP פיוז’ן חלבונים), כתב חלבונים (כגון GCaMP), או אפקטור חלבונים (כגון חיידקים רעלים, channelrhodopsin או קולטני pharmacogenetic) ב במרחב באופן מוגבל את הנוירונים בעמוד השדרה. הזרקה מקומית של rAAVs תלויי-Cre לתוך העכברים הטרנסגניים לבטא Cre recombinase בקבוצת משנה ספציפית של נוירונים בעמוד השדרה מאפשר ניתוח מסוים של האוכלוסייה עצביים בהתאמה. לנו המועסקים טכניקה זו תווית, ablate, לעכב או להפעיל את glycinergic בעמוד השדרה נוירונים והוכח כי הם חלק חיוני של השער בעמוד השדרה שולט כאב, גירוד שידור7. בניסויים אלה, תוך הזרקה של rAAV תלויי-Cre לתוך GlyT2::Cre עכברים להפעיל מניפולציה סלקטיבי של glycinergic הנוירונים בחוט השדרה המותני. ובכך, ניתן להימנע מניפולציה סימולטני של מעגלים supraspinal המכילים glycinergic נוירונים קריטי להישרדותה של החיה.
בזמן זריקה תוך של rAAVs מגביל זיהום לאתר של הזרקת, התמרה חושית ויראלי יכול להתרחש לא רק בנוירונים המקומי, אלא גם בנוירונים להתחבר ההזרקה דרך עצב תחזיות. האחרון משמש לעתים קרובות לאזורים CNS מעקב לספק קלט עצביים גרעין מסוים במוח. הזיהום של תחזיות עצב, עם זאת, ניתן גם גורם מבלבלים כאשר אוכלוסיה מוגדרים של נוירונים להילמד באתר מסוים. כדי לטפל בבעיות אלה, לאחרונה ערכנו ניתוח מקיף של AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם, קסטות הביטוי לזהות אשר נגרמו מהזנים אליהם ואת היזמים יכול לשמש כדי להקטין או להגדיל את התמרה חושית רטרוגרדית. בהקשר של מחקר ספציפי זה ב מעגלים בעמוד השדרה, ניתחנו את היכולת של שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם, היזמים retrogradely מגלי נוירונים של גרעיני הבסיס העזוב (DRG), rostral ventromedial לשד (RVM) ו קליפת המגע 12. לכן ניתן להשתמש בטכניקה המתוארות ב פרוטוקול זה לנתח נוירונים בעמוד השדרה במקום ההזרקה או לנתח נוירונים הקרנה לספק קלט לאתר מוזרק של חוט השדרה. בפרוטוקול המתוארים כאן, כולל שלוש זריקות של rAAV בצד השמאלי של עמוד השדרה המותני מבוצעות כדי לאפשר התמרה חושית של נוירונים לשלושה חלקים המותני (L3-L5). המקטעים L3-L5 לקבל את רוב הקלט החושי hindlimb חולשת באתר הזרקת. נדגים כי מניפולציה פונקציונלי של נוירונים גנטית שכותרתו ב L3-L5 מספיקה לעורר שינויים התנהגותיים חזקים, ובכך לספק ראיות פונקציונלי עבור הפונקציה מעגל של כזה תת סוג תווית גנטית נוירון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזרקה תוך של AAVs עשויה להפוך טכניקה חזקה במעבדת מחקר, המאפשר הניתוח של תאים בעמוד השדרה עם פתרון זמני מרחבית גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר את התמרה חושית המקטעים בעמוד השדרה המרכזית שלוש innervated על ידי נוירונים סנסוריים הארכת שלהם אקסונים היקפיים כדי hindlimb. Transducing לשלושה חלקים מייצר ועמיד לשחזור נ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים האנס אולריך Zeilhofer על בנדיבות התומכים עבודה זו. הנדריק Wildner נתמכה על ידי קרן אולגה Mayenfisch. אנו מודים כרמן Birchmeier על הנוגדן Lmx1b.
Materials
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) | Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
