척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식
Summary
Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.
Abstract
척추 신경 부분 모집단의 선택적 조작 주로 두 가지 방법으로 달성 되었다: 1) Intersectional 유전학, 그것에 의하여 이중 또는 삼중 유전자 변형 쥐 기자 또는 이펙터의 선택적 식 달성 하기 위해 생성 됩니다 원하는 척추 인구에서 유전자 (예를 들어, Rosa26 소재 시에서). Cre 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV); 2) intraspinal 주입 여기 선택의 기자 또는 이펙터 유전자에 대 한 코딩 Cre 종속 AAV 벡터는 Cre recombinase 원하는 신경 부분 모집단에 표현 하는 쥐의 척수에 주입 됩니다. 이 프로토콜 Cre 종속 rAAV 벡터를 생성 하는 방법을 설명 하 고 어떻게 신경 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 transduce rAAVs와 L3-L5 세그먼트. 요 추 척추 세그먼트 L3-L5는 hindlimbs에서 감각 정보를 전송 하는 그 주변 감각 뉴런에 의해 innervated 있습니다, 자연 스러운 행동 및 감각 테스트 사출 쪽에 동측 hindlimb에 적용에 대 한 응답 수 있습니다. 감각 처리에 조작된 신경의 기능을 검사 하기 위해 분석. 우리는이 기술을 사용 하 여 유전자를 분석 하는 방법을의 예 정의 척추 신경의 하위 집합을 제공 합니다. Cre 유전자 변형 쥐 클래식 리포터 transgene 마우스 유도 식에 비해 바이러스 중재 transgene 식의 주요 장점은 다음과 같습니다: 1) 다른 Cre 종속 rAAVs 다양 한 기자 또는 effector 단백질 인코딩 될 수 있습니다 주입 한 Cre 유전자 변형 줄, 따라서 여러 여러 유전자 변형 마우스 라인을 만들 필요가 극복 했다. 2) intraspinal 주입 조작 Cre 표현 셀 주사 사이트를 주입 후 시간을 제한합니다. 주요 불리는: 1) 리포터 유전자 발현 rAAVs에서 더 많은 변수 이다. 2) 수술의 척추 신경 transduce 필요 합니다. 두 가지 방법 중 어떤은 더 적절 한 해결을 신경 인구 및 연구 질문에 따라 달라 집니다.
Introduction
등 쪽 척수 주변 신체와 뇌 사이의 정보 교환을 위해 근본적 이다. 열, 감기, 같은 감각 자극, 만지거나 유해 자극 척수의 등 쪽 뿔의 신경 세포에이 정보를 전달 전문된 주변 신경에 의해 감지 됩니다. 여기, 억제 및 흥분 성의 수의 복잡 한 네트워크 변조 하 고 결국 척추 프로젝션 뉴런 supraspinal 통해 릴레이 감각 정보 사이트1,2. 척추에 의해 실시 계산 인터-프로젝션 뉴런 감각 정보, 정보 억제 또는 릴레이 강도에 따라서 결정 문 및. 변화 억제와 흥분, 밸런스 변경된 등 감각 자극의 통합에 과민 증 또는 용어인 (일반적으로 비-고통 스러운 자극 후 고통 스러운 감각) 등 감각 장애를 일으킬 수 있습니다. 이러한 변화는 다양 한 만성 통증의 근본 원인을 상태3,4수 생각 된다. 따라서, 척추 회로 감각 처리에 높은 중요성의 따라서 생물체의 환경 및 자기 인식. 최근 출현 및 분자, 유전자의 조합 및 유전으로 확인 된 척추 신경 부분 모집단의 정확한 조작 하도록 하는 수술 기법, 과학자 들은 이제 이해 하기 시작 기본 척추 회로 고유 감각 modalities의 처리를 담당 합니다.
야생-타입 또는 유전자 변형 쥐에 rAAV의 intraspinal 주입 크게 기여한 조작, 분석, 및 척추 신경5,6,7, 의 특정 하위 집합의 기능 이해 8 , 9 , 10 , 11.이 기술은 마커 단백질의 배달을 허용 (GFP 등 / GFP 융해 단백질), 기자 단백질 (예: GCaMP), 또는 effector 단백질 (예: 세균 독 소, channelrhodopsin, 또는 pharmacogenetic 수용 체)는 공간 척추 신경에 제한 된 방식 으로입니다. Cre recombinase 척추 신경의 특정 하위 집합에서을 표현 하는 유전자 변형 쥐로 Cre 종속 rAAVs의 로컬 주입 각각 신경 인구의 특정 분석을 허용 한다. 우리는 라벨, ablate, 억제 또는 척추 glycinergic 뉴런을 보여주는 그들은 척추 게이트 통증 제어의 필수적인 부분입니다 및 전송7을 렵 게 활성화에이 기술을 채용 했습니다. 이 실험에서 intraspinal 주입 Cre 종속 rAAV GlyT2::Cre 쥐 요 추 척수 신경 세포 glycinergic의 선택적 조작 사용할 수 있습니다. 따라서, glycinergic 신경 동물의 생존에 대 한 중요 한 포함 하는 supraspinal 회로의 동시 조작 피할 수 있습니다.
RAAVs의 intraspinal 주사 주입의 사이트에 감염 제한, 하는 동안 로컬 뉴런에서 뿐만 아니라 axonal 예측을 통해 사출 사이트에 연결 하는 신경 세포에 바이러스 성 변환 발생할 수 있습니다. 후자는 자주 사용 한다 특정 핵은 뇌에서 신경 입력을 제공 하는 추적 CNS 영역에. 그러나 Axonal 예측의 감염,, 수도 있습니다 혼동 요인의 정의 된 인구는 특정 사이트에서 공부 한다. 이러한 문제를 해결 하기 위해 우리가 최근에 AAV serotypes serotypes 및 발기인 최소화 또는 최대화 역행 변환 하는 데 사용할 수 있는 식별 식 카세트의 포괄적인 분석을 실시 했습니다. 척추 회로에서이 특정 연구의 맥락에서 우리 retrogradely transduce 지 루트 신경 절 (DRG), rostral ventromedial 모 수 (호), 및 somatosensory 피 질 뉴런에 다른 serotypes 및 발기인의 능력 분석 12.이 프로토콜에서 설명 하는 기술을 사용할 수 있습니다 따라서 척추 신경 주사 사이트에서 분석 하거나 투영 신경 척수의 삽입 된 사이트에 입력을 제공 하는 분석. 여기에 설명 된 프로토콜에서 요 추 척수의 왼쪽에 rAAV의 3 개의 주사 3 허리 세그먼트 (L3-L5)에서 뉴런의 변환 수 있도록 수행 됩니다. L3-L5 세그먼트는 사출 사이트에 hindlimb 동측에서 감각 입력의 대부분을 받습니다. 시연 L3-L5 유전자 레이블이 뉴런의 기능 조작 이다 강력한 행동 변화를 연상 하기에 충분 따라서 유전자 레이블이 신경 하위의 회로 기능에 대 한 기능 증거를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intraspinal 주입 AAVs의 강력한 기술 연구 실험실에서 척추 세포 높은 시간적 및 공간 솔루션의 분석을 사용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 세 가지 주요 척추 세그먼트는 hindlimb 그들의 주변 축 삭을 확장 하는 감각 뉴런에 의해 innervated 변환 수 있습니다. 3 개의 세그먼트를 시험 강력 하 고 재현할 수 행동 데이터를 생성 합니다. 그것은 또한 하나의 intraspinal 주입 후 가능한 보다 큰 감각 영역의 테…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 마 지 못해이 일을 지원 하기 위한 한스 울 리 히 Zeilhofer를 감사 합니다. 헨드릭 Wildner 올가 Mayenfisch 재단에 의해 지원 되었다. 우리는 Lmx1b 항 체에 대 한 카르멘 Birchmeier 감사합니다.
Materials
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) | Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
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