Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Dobbelt-strenget RNA Oral leveringsmetoder til at fremkalde RNA-interferens i Phloem og plante-sap-fodring Hemipteran insekter

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Denne artikel viser romanen teknikker udviklet til oral levering af dobbelt-strenget RNA (dsRNA) gennem de kardiovaskulære væv af planter til RNA-interferens (RNAi) i phloem sap fodring insekter.

Abstract

Phloem og plante sap fodring insekter invadere integriteten af afgrøder og frugter til at hente næringsstoffer, i at beskadige fødevareafgrøder. Hemipteran insekter tegner sig for en antallet af økonomisk betydelig skadegørere på planter, der forårsager skader på afgrøder ved at fodre på phloem sap. Brun marmorated stank bug (BMSB), Halyomorpha halys (tæger: Pentatomidae) og den asiatiske citrus psyllid (AVS), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) er hemipteran skadedyr indført i Nordamerika, hvor de er en invasiv landbrugs skadedyr af høj værdi speciale, træk, og korte afgrøder og citrusfrugter samt en gene skadedyr, når de samlede indendørs. Insekticidresistens hos mange arter har ført til udviklingen af alternative metoder til pest forvaltningsstrategier. Dobbelt-strenget RNA (dsRNA)-medieret RNA-interferens (RNAi) er en genhæmning mekanisme for funktionelle genomisk undersøgelser, der har potentielle anvendelsesmuligheder som et værktøj til styring af skadedyr. Eksogent syntetiserede dsRNA eller små interfererende RNA (siRNA) kan udløse højeffektive genhæmning gennem nedbrydningen af endogene RNA, som er homolog til der præsenteres. Effektiv og miljømæssig anvendelse af RNAi som Molekylær biopesticider for biocontrol af hemipteran insekter kræver i vivo levering af dsRNAs gennem fodring. Her vi vise metoder til levering af dsRNA til insekter: Ilægning af dsRNA i grønne bønner ved nedsænkning, og absorbere af gen-specifikke dsRNA med oral levering gennem indtagelse. Vi har også skitseret ikke-transgene planter levering metoder ved hjælp af Blandtegning sprays, roden gennembløde, trunk injektioner samt ler granulat, som kan være afgørende for vedvarende frigivelse af dsRNA. Effektiv levering af oralt indtaget dsRNA blev bekræftet som en effektiv dosis til at fremkalde et betydeligt fald i udtryk for målrettede gener, som unge hormon syre O-methyltransferase (JHAMT) og vitellogeninproduktion (Vg). Disse innovative metoder repræsenterer strategier for levering af dsRNA til brug i plantebeskyttelsesmidler og overvinde miljømæssige udfordringer for Plantebeskyttelse og skadedyr.

Introduction

Hemipteran insekter omfatter nogle af de mest økonomisk betydningsfulde skadedyr af agriculturebecause af deres evne til nå forhøjede befolkningstilvækst og sprede sygdomme i planter. BMSB, H. halys Stål, er en invasiv skadedyr, der indførtes ved et uheld i den vestlige halvkugle i Allentown, Pennsylvania fra Asien (Kina, Taiwan, Korea og Japan) med den første observation rapporteret i 19961. Siden introduktionen, BMSB er blevet opdaget i 43 stater, med de højeste populationer i Midtatlanten (DE, MD, PA, NJ, VA, og WV) samt i Canada og Europa, og repræsenterer en potentiel trussel mod landbrug2. Som en polyphagous pest, kan BMSB tilskynde til skader på ca. 300 identificerede plante værter herunder høj værdi afgrøder såsom æbler, druer, prydplanter, frøafgrøder, sojabønner og majs. Skader skyldes primært skyldes tilstanden af fodring, kendt som lacerate og flush, hvor dyret gennemborer vært afgrøde med sit nål-lignende stylet til at få adgang til næringsstofferne fra kardiovaskulære væv2,3. BMSB er også en indendørs skadedyr, som de kan finde residence i levende områder såsom skoler og huse i løbet af efteråret-vinter2. Kemikalier og aeroallergens udgivet af BMSB blev rapporteret til ulovlig allergisk reaktion i frugt afgrøde arbejdstagere. BMSB kan også bidrage til allergisk sygdom fører til kontakteksem, konjunktivitis og rhinitis i følsomme individer4,5. En anden hemipteran insekt, ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), er et alvorligt skadedyr af citrusfrugter og transmitterer phloem-limited bakterier (blev Liberibacter asiaticus) forårsager Huanglongbing (HLB), bedre kendt som citrus grønnere sygdom6,7. HLB blev først rapporteret fra det sydlige Kina og har spredt sig til 40 forskellige asiatiske, Afrika, Oceanien, syd- og nordamerikanske lande7. Citrus grønnere er et verdensomspændende problem med truende økonomiske og finansielle tab som følge af citrusfrugter tab; forvaltningen af AVS-anses derfor, af allerstørste betydning for forebyggelse og bekæmpelse af HLB.

Foranstaltninger til effektiv bekæmpelse af disse skadedyr normalt kræver anvendelse af kemiske pesticider, der er relativt korte levede. Kemiske insekticid kontrolstrategier ofte mangler sikkert miljøforvaltning strategier eller faldet modtagelighed af pesticid modstand i pest populationer8,9. Derfor, biologisk bekæmpelse af skadedyr med molekylær biopesticider er en potentiel alternativ, men dets brug forbliver globalt beskedent, og forskellige arter af parasitoider (f.eks. Trisolcus japonicus) kan også være effektive som naturlige biologiske kontrol. RNAi er en potentiel emerging teknologi til styring af invasive skadedyr med molekylær biopesticider10. RNAi er en godt beskrevet gen reguleringsmekanisme, der letter effektiv posttranskriptionelle genhæmning af endogene samt invaderer dsRNAs i en sekvens-specifikke måde, der i sidste ende fører til regulering af genekspression på mRNA niveau11,12. Kort, når eksogene dsRNA er internaliseret i en celle, det er forarbejdet til siRNAs af et medlem af bidentate nukleasen RNase III superfamilien, kaldet Dicer, som er evolutionært bevaret i worms, fluer, planter, svampe og pattedyr13, 14 , 15. disse 21-25 nukleotid siRNA dobbelthuse er derefter afvikles og integreret i RNA-induceret silencing complex (RISC) som guide RNA'er. Dette RISC-RNA kompleks tillader Watson-Crick base parring til den supplerende målrette mRNA; Dette fører i sidste ende til spaltning af Argonaute proteinet, en multi-domæne protein som indeholder et RNase H-lignende domæne, som nedbryder den tilsvarende mRNA og reducerer protein oversættelse, hvilket førte til posttranskriptionelle genhæmning16 , 17 , 18.

RNAi for Plantebeskyttelse og skadedyr kræver indførelse af dsRNA i vivo til tavshed gen af interesse, hvorved aktivering siRNA pathway. Forskellige metoder, der har været brugt i dsRNA levering til insekter og insekt celler til at fremkalde systemisk RNAi omfatter fodring10,19, iblødsætning20,21, mikroinjektion22, luftfartsselskaber som Liposomer 23, og andre teknikker24. RNAi blev først demonstreret i Caenorhabditis elegans til tavshed unc-22 genekspression af brand og Mello25, efterfulgt af knockdown i udtryk for de frizzled gener i Drosophila melanogaster26. Indledende funktionelle studier udnyttet mikroinjektion for at levere dsRNA i insekter, som Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30, og Lepidoptera insekter (gennemgået af Terenius et al. 31). mikroinjektion er fordelagtigt at levere en nøjagtig og præcis dosis til webstedet af interesse i insektet. Omend sådanne septisk punkteringer kan fremkalde udtryk for immun relaterede gener på grund af traumer32, derfor udelukke dets praktiske i landbruget biopesticider udvikling.

En anden metode i levere dsRNA i vivo er ved opblødning, som indebærer indtagelse eller absorption af dsRNA ved inddragelse af dyr eller celler generelt i ekstracellulær medium indeholdende dsRNA. Iblødsætning har været anvendt til effektivt fremkalde RNAi i Drosophila S2 vævskultur celler til at hæmme Downstream-af-Raf1 (DSOR1) mitogen-aktiveret protein kinase kinase (MAPKK)20samt i C. elegans til tavshed i pos-1 gen33. Men dsRNA leveres ved hjælp af iblødsætning er mindre effektiv til at fremkalde RNAi sammenlignet med mikroinjektion20. RNAi medieret tavshed i en chewing insekt blev første gang vist i vestlige majs-rodorm (VIF) (Diabrotica virgifera virgifera) ved infusion af dsRNA i en kunstig agar kost10. Tidligere rapporter har opsummeret metoder til at levere dsRNA infunderes i naturlig kost specifikke for leddyr34. Disse leveringsmetoder blev yderligere fast besluttet på at være forholdsvis effektiv til kunstige midler til levering; som sagen om tsetsefluen (Glossina morsitans morsitans), hvor lig knockdown af en immun-relaterede gen blev observeret, da dsRNA blev leveret enten gennem blod måltid eller microinjected35. Ligeledes levering af dsRNA gennem dråberne i lys brun æble moth (Epiphyas postvittana)36, diamondback moth (Plutella xylostella) larver37, såvel som honning bier38,39 induceret effektiv RNAi. Mest effektive RNAi eksperimenter i hemipteran har udnyttet injektion af dsRNA40 , fordi oral levering af dsRNA i hemipteran insekter er vanskelig, da det skal være leveret gennem anlægget vært kardiovaskulære væv. Effektiv RNAi blev også observeret i AVS-landene og glasagtig-vinget skarpskytte leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA blev leveret gennem citrus og vinstokke, der havde absorberet dsRNA i kardiovaskulære væv gennem rod gennembløde, bladgødning sprøjtemidler, trunk injektioner eller absorption af stiklinger41,42,43,44,45,46. Dette resulterede også i det første patent for dsRNA mod AVS-landene (2016, os 20170211082 A1). Levering af siRNA og dsRNA ved hjælp af luftfartsselskaber som nanopartikler og Liposomer bibringer stabilitet, og stigninger i leverede dsRNA effektivitet er hurtigt på vej23,47,48,49 ,50. En ny klasse af nanopartikler-baserede levering køretøjer til nukleinsyrer for in vitro- og i vivo der blev opsummeret specielt til terapeutiske applikationer kan give enorme potentiale som egnet levering vektorer51. Nanopartikler som fremføringsmiddel for dsRNA kan have ulemper herunder opløselighed, hydrophobicity eller begrænset bioakkumulering52, men en egnet polymer medvirken levering kan opveje disse ulemper. Udvikling og anvendelse af selvstændige levere nukleotider også nye kaldet 'antisense oligonukleotider', som er enkelt strandede RNA/DNA dobbelthuse46.

Vitellogenesen i leddyr er en nøglen proces kontrol reproduktion og reguleret af juvenile hormon (JH) eller ecdysone, som er de vigtigste induktorer af Vg syntese af kropsfedt; Vg tages i sidste ende op af den udvikle oocyt via Vg receptor medieret endocytose53. VG er en gruppe af polypeptider syntetiseret extraovarially, som er afgørende for udviklingen af store æg æggeblomme protein, vitellin54,55, og derfor er det vigtigt i reproduktion og aldring56. VG har været succesfuldt tavshed i nematoder57 samt i honningbi (Apis mellifera) hvor RNAi medieret nedbrydning af Vg blev observeret i voksne og æg22. RNAi medieret posttranskriptionelle genhæmning af Vg blev testet, fordi man troede dens udtynding ville føre til en observerbar fænotypiske effekt som nedsat fertilitet og frugtbarhed, potentielt støtte i BMSB kontrol. JHAMT genet, der koder til S-adenosyl-L-methionin (SAM)-afhængige JH syre O-methyltransferase, katalyserer det sidste trin af JH biosyntese pathway58. I denne vej farnesyl omdannes pyrofosfat (FPP) sekventielt fra farnesol, at farnesoic syre efterfulgt af konvertering af methyl farnesoate til JH af JHAMT. Denne vej er bevaret i insekter og leddyr specielt til forvandling, en proces, der reguleres udviklingshæmmede af hormoner59,60,61. I B. morityder JHAMT genekspression og JH biosyntetiske aktivitet i Corpora allata på, at det transkriptionel undertrykkelse af JHAMT -genet er afgørende for opsigelse af JH biosyntesen58. Derfor, JHAMT og Vg generne blev udvalgt til målrettede nedbrydningen ved hjælp af RNAi. RNAi blev også testet i citrus træer for kontrol af AVS- og GWSS. Citrus træer blev behandlet med dsRNA gennem rod gennembløde, dæmme op for hanen (trunk injektioner), samt blade spray med dsRNAs mod insekt specifikke arginin kinase (AK) udskrifter42,44. Den topikal applikation af dsRNA blev registreret over baldakinen af citrus træer, der angiver effektiv levering gennem planter kardiovaskulære væv, og resulterede i øget dødelighed i AVS-landene og GWSS41,42, 45.

I den aktuelle undersøgelse, har vi identificeret en naturlig kost leveringsmetode for behandlinger som dsRNA. Dette nyudviklede teknik blev senere brugt til silencing JHAMT og Vg mRNA ved hjælp af genet specifikke dsRNAs i BMSB nymfer som vist tidligere62. Disse nye levering protokoller demonstreret her erstatter konventionelle RNA leveringssystemer, der bruger aktuelt sprays eller microinjections. Grøntsager og frugter, stilken tap, jord drenching og ler absorptionsmidler i kan bruges til levering af dsRNA, som er afgørende for den fortsatte udvikling af biopesticide pest og patogen ledelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BMSB opdræt

  1. Bageste BMSB insekter som standard lab praksis og tidligere beskrevne63.
  2. Hæve ACP (D. citri) insekter på Citrus macrophylla i et drivhus (22 ° C) og naturligt lys. Brug adult AVS, på ca. 5-7 dage post eclosion.

2. udvælgelse af genet regioner og In Vitro syntese af dsRNA

  1. Vælg gener bestemt til BMSB fra tidligere udgivne transkriptom profiler32.
  2. Sikre regioner af interesse valgt varierer fra 200 til 500 basepar.
  3. Udføre polymerase kædereaktion (PCR) ved hjælp af de betingelser, der er beskrevet nedenfor til at generere fragmenter, der er tilknyttet den valgte gen af interesse fra genomisk DNA. Se tabel 1 for gen-specifikke oligonukleotider.
    1. PCR reaktion: I en 0,25 mL PCR rør, kombinere 5 µL af 10 X PCR Buffer, 4 µL af dNTP blanding (2,5 mM), 2 µL af DNA skabelon (50 ng/µL), 2,5 µL af primere 1 og 2 (10 µM), 0,25 µL DNA polymerase (5 U/µL) , og DNase/RNase gratis vand op til 50 µL.
    2. PCR betingelse: cyklus PCR reaktion for at forstærke regionen af interesse ved 95 ° C i 3 min efterfulgt af 30 cyklusser af 98 ° C til 10 s, 55 ° C til 30 s, 72° C i 1 min. Incubate reaktion ved 72 ° C i en yderligere 10 min. rense PCR reaktion ved hjælp af en rensning kit.
  4. Forstærke de opnåede PCR fragmenter yderligere med gen specifikke primere flankeret med T7 RNA polymerase promotor sekvens (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') som nævnt tidligere62.
  5. Bruge LacZ genet som en negativ kontrol (mock) for RNAi.
    Bemærk: LacZ er et gen, der koder β-galactosidase amplificeret fra Escherichiacoli genomisk DNA (primere bruges er angivet i tabel 1).
  6. Udføre i vitro transskription for at give dsRNA som beskrevet tidligere62.
  7. Opløse og resuspend de resulterende dsRNA i 150 µL DNase/RNase gratis vand, måle koncentrationen, og opbevares ved-80 ° C til fremtidig brug.

3. levering af dsRNA brug af grønne bønner

  1. Vælg tidligt 4th instar BMSB nymfer udklækket fra det samme æg masse og sulte dem i 24 timer inden dsRNA fodring.
  2. Vælg slank certificeret økologisk grønne bønner (Phaseolus vulgaris L.) og vask med 0,2% natriumhypochlorit løsning i 5 min.
    Bemærk: Slank grønne bønner blev markeret, så bønnerne kan nemt blive indkvarteret i 2 mL microcentrifuge rør.
  3. Vask 3 gange med ddH2O og lad lufttørre.
  4. Trim de grøn bønner fra blomsterbægeret udgangen til en samlet længde på 7,5 cm ved hjælp af en ren barberblad.
  5. Fordybe de vasket og trimmet grønne bønner i en cap-mindre 2 mL microcentrifuge rør indeholdende 300 µL af styringsløsning (1:10 fortynding grøn frugtfarve (ingredienser: vand, propylenglykol, Fd & C gul 5, Fd & C blå 1 og Propylparaben som konserveringsmiddel)).
  6. Gøre fortyndinger af in vitro- syntetiseret LacZ, JHAMT eller Vg dsRNAs ved at fortynde 5 µg eller 20 µg i 300 µL af RNase/DNase gratis vand til at give endelige koncentrationer på 0,017 µg/µL eller 0.067 µg/µL, henholdsvis.
  7. Fordybe de vasket og trimmet grønne bønner i en cap-mindre 2 mL microcentrifuge rør indeholdende 300 µL af dsRNA løsning (fra trin 3.6).
  8. Wrap og forsegle kanterne af de microcentrifuge rør omslutter nedsænket bønner at undgå fordampning af dsRNA løsning og at forhindre dyrene i at indtaste microcentrifuge rør.
  9. Placer disse rør i en opretstående måde ved stuetemperatur til 3 h til den dsRNA opløsning skal indlæses i hele grønne bønner af kapillaritet.
  10. Placer disse rør i ren kultur fartøjer (polypropylen). Sted tre sultet 4th instar BMSB nymfer i kultur fartøjer.
  11. Behandle tre dyr pr. kultur fartøj hver indeholder tre grønne bønner med grøn mad farve eller dsRNA løsning. Vedligeholde insekter ved 25 ° C og 72% relativ luftfugtighed, under en 16 L: 8 d lysperiode i en inkubator.
  12. Tillad insekter til foder på de grønne bønner (nedsænket og optaget med dsRNA) i 5 dage men genopbygge med frisk kost af dsRNA behandling grønne perler efter 3 dage.

4. real-time kvantitativ (qPCR) analyse af udtrykket følgende RNAi medieret genhæmning i BMSB

  1. Måle effekten af RNAi på niveauer af udskrift udtryk af qPCR.
  2. Isolere den samlede RNA fra dsRNA behandlet dyr og syntetisere cDNA62.
  3. Setup qPCR reaktioner ved hjælp af en real-time PCR-system og de primere, der er anført i tabel 1. Brug følgende qPCR cykling betingelse: 95 ° C i 10 min efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s, 60 ° C i 1 min., sammen med dissociation trin herunder 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min., 95 ° C i 15 s , og 60 ° C i 15 s.
  4. Bestemme qPCR standarder: bruge seriel fortynding af cDNA forberedt fra total RNA isoleret fra en normal dyr som en referencestandard for kvantificering.
  5. Brug BMSB 18s RNA som en intern standard til at korrigere for forskelle i RNA recovery fra væv32.

5. Blandtegning Spray anvendelse i store potteplanter Citrus træer og planter

Bemærk: Planter af citrus kultivar 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), blev opretholdt i et drivhus under naturligt lys og temperatur, dyrket i 1,2 L containere. Planterne blev konstant beskæres for at fremme væksten af nye Blandtegning skud, kaldet 'flush'. ACP foretrækker at foderstof- og oviposition på den nye vækst af citrus64.

  1. Vælg planter eller stiklinger og ikke vande dem i 2-3 dage før at bruge til at lade jorden udtørre fugtig, men ikke helt tørt.
  2. Brug en hånd pumpe sprayflaske gælder en 200 mL af dsRNA opløsning (0,5 mg/mL) for de lavere baldakin (figur 4A).
    Bemærk: Forberede den ovenfor nævnte dsRNA løsninger i DNase/RNase gratis vand.
  3. Efter spray overførelse, tillade den anvendte dsRNA løsning til at være fuldstændig absorberet af bladene.
    Bemærk: Citrustræer absorberet den anvendte dsRNA, og derefter bladene fra enten nye vækst eller grene, der var dækket før ansøgning, blev udvundet; dsRNA blev påviselig ved hjælp af qPCR og viste systemisk bevægelse i træet top baldakin blade i 3-4 h44,45,46.
  4. Prøve den nye vækst fra tidligere toppet træer efter 25-40 dage ved at indsamle ca 10 blade fra spidsen af fire grene. Uddrag den samlede RNA og analysere det ved reverse transkription PCR (RT-PCR) og qPCR for tilstedeværelsen af udløseren anvendt dsRNA ved hjælp af primere i tabel 1 anførte og tidligere beskrevet metoder46.
    Bemærk: Prøvetagning, total RNA isolering, RT-PCR, og qPCR blev udført som tidligere beskrevet46.
  5. Ligeledes topisk spray 10 mL dsRNA til den nedre region i en sætteplante eller små potteplanter træ blade.
    Bemærk: Hemipteran insekter (AVS-landene og GWSS) blev givet fodring adgang normalt på 24 h, post behandlinger på ny vækst (blade) der ikke havde været direkte sprøjtes, eller som voksede uger senere, eller hele planter. Dette produceret insekter som testet positiv for dsRNA på 3, 6 og 10 dage, bogføre fodring.

6. jord/Root gennembløde anvendelse i store eller små potteplanter Citrus træer og planter

  1. Vælg planter eller stiklinger og ikke vande dem i 2-3 dage før du bruger til at lade jorden tørrer ud til fugtig men ikke helt tør (dette skaber luftrum for at holde den flydende løsning skal anvendes).
  2. Tilføje 1 L dsRNA løsning (0,2 mg/mL) til jorden af store potteplanter (ca 2,5 m) og tilføje 1 L vand (chaser) efter 1 h.
  3. Anvend 100 mL dsRNA løsning (1,33 mg/mL) til jorden af 1 m høje potteplanter træer i delvist tør jord.
  4. For små frøplanter, anvende 10 mL af dsRNA løsning (1 mg/mL) til jorden i kegler eller til de nøgne rødder (figur 4B, C).
  5. Tillad de planter, der modtager dsRNA løsningen anvendes som en jord gennembløde til at suge i 30 min. Derefter anvende almindeligt vand kun behandling for at støtte absorption af rødder (20 mL for planter i gul containere) eller 100 mL, hvis større urtepotter er > 1 gallon.
    Bemærk: Topikalt dsRNA til løv resulterede i afsløring på mest distale spidserne af grene inden for 3-6 h post behandlinger, viser systemisk bevægelse gennem træerne. Nye vækst grene testet positiv for dsRNA på 60-90 dage post behandlinger. Stiklinger leveres til insekter (AVS-landene og GWSS) i en dsRNA fodring bioassay44.

7. stilken Tap (Tree Trunk injektion) anvendelse i store potteplanter Citrus træer og planter

  1. Vælg citrus kimplanter, nye, eller ca 3,5 år gamle planter til indsprøjtning dsRNA ved hjælp af stilken tryk (trunk injektioner) metode.
  2. Bore huller i citrus planter ved hjælp af en boremaskine og en 10 mm borehoved, pas på ikke for at overstige 2 cm, eller omkring en halv diameter af stilken.
  3. Wrap kobber spidsen af hver injektor 4 - 6 gange med en 0,6 cm (¼ tommer) bred strimmel af forsegling film for at forhindre lækage nær spidsen.
  4. Fylde træ trunk injektorer med 6 mL (1,7 mg/mL) dsRNA opløsning fortyndes i DNase/RNase gratis vand (betegnes her som farvede løsning).
  5. Injicere løsningen ind i stammen af træet og forlade injektoren i bagagerummet for 6-10 h at tillade optagelsen af dsRNA løsning. Tillad insekter til foder på stiklinger fra behandlet træer 3, 10 og 30 dage post behandling.
    Bemærk: DsRNA injiceres ved hjælp af trunk injektion metoden varet i træerne i en periode på 30-60 dage41,42,44. Validering for RNAi blev udført af qPCR ved hjælp af primere, der er anført i tabel 1.

8. dsRNA behandles ler granulat til levering til insekter gennem jord

  1. Udøse ler absorberende ind i en 50 mL konisk rør til 35 mL mærket (ca. 30 g ler absorberende) på røret.
  2. Hæld 20 mL af dsRNA opløsning fortyndes i DNase/RNase gratis vand (100 µg/mL) i røret til våd alle absorberende. Cap de koniske rør, tip rør til at fjerne luft og cap røret.
  3. Røret anbringes oprejst og lad det stå i 1-2 min for ler partikler til at absorbere løsningen.
  4. Tilføj nok dsRNA-gennemblødt ler i jorden blandingen til at fylde en 1 gallon kande.
  5. Bland og slå jorden med hånden for at blandes grundigt dsRNA-gennemblødt ler i jorden.
  6. Brug denne jord til repot frøplanter valgt til dsRNA behandling.
  7. Vand jorden med 200 mL postevand uden dsRNA. Efter 30 min. til 1 time, Følg med 100 mL postevand. Efter 24 timer, skal du sætte anlægget på en normal vanding tidsplan.
  8. Test 4-6 blade på de behandlede potteplanter med ler absorptionsmidler og dsRNA hver måned indlæg behandling for dsRNA ved at indsamle de mest apikale blade af nye plantevækst.
    Bemærk: Planter eller stiklinger fra disse behandlede planter er fodret med insekter helst efter 24 h post behandling og har været i stand til levering RNAi for op til et år til insekter (ikke-offentliggjorte data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vegetabilske medieret dsRNA levering gennem fodring i BMSB 4th instar nymfer blev testet for udvikling af molekylære biopesticider ved hjælp af RNAi for invasive skadedyr. BMSBs foder ved hjælp af deres nål-lignende stylets af en mekanisme, der er kendt som lacerate og skyl, som forårsager betydelig skade på afgrøder. Slank økologisk grønne bønner, P. vulgaris L., blev brugt til at teste, hvis næringsstoffer eller dsRNA kunne leveres i vivo til BMSB gennem fodring3. Segmenter af grønne bønner var nedsænket i DNase/RNase gratis vand eller en opløsning af vand og grøn frugtfarve til at teste levering i BMSB (figur 1A). Grøn frugtfarve blev brugt som en visuel indikation til at efterligne dsRNA. Karvæv af de grønne bønner var mættet med grøn frugtfarve på grund af strømmen af grøn farvet løsning gennem phloem af kapillaritet62. BMSB nymfer blev set, fodring på segmenter af grønne bønner ved at indsætte deres stylets i kardiovaskulære væv af grønne bønner (figur 1B). Grøn farvet ekskrementer dråber blev observeret efter dage 2 og 3 i insekter, der blev fodret på bønner mættet med grøn mad farvelægning med angivelse af det leverede materiale havde indtaget oralt og passeret gennem tarmen før udskillelse (figur 1 c, D ).

Efterfølgende testede vi hvis betydelig udtynding af målrettede genekspression blev udført ved hjælp af grønne bønner medieret levering af BMSB specifikke dsRNA via indtagelse i BMSB. Grønne bønner segmenter var nedsænket og optaget en opløsning af enten 0.067 µg/µL (20 µg i 300 µL DNase/RNase gratis vand) eller 0,017 µg/µL (5 µg i 300 µL DNase/RNase gratis vand) af in vitro syntetiseret dsRNA bestemt til BMSB JHAMT og Vg , henholdsvis. Grønne bønner var også nedsænket i vand alene, 0.067 µg/µL eller 0,017 µg/µL LacZ dsRNA (Mock) som respektive kontrolelementer. Udskrift niveauer blev evalueret ved hjælp af qPCR angiver dette udtryk af JHAMT og Vg mRNA blev markant reduceret i vivo af næsten 4,5 - og 2.2-fold, henholdsvis (figur 2A, B). Derfor viser resultaterne, at dsRNA kan leveres gennem kardiovaskulære væv af grønne bønner til at fremkalde vellykket RNAi.

En anden hemipteran pest, Harlekin bug (HB) (Murgantia histrionica), der forårsager skader på cole afgrøder blev også testet hvis vellykket levering af næringsstoffer eller dsRNA behandlinger kan leveres ved hjælp af vegetabilsk medieret levering. 4th instar HB nymfer var tilladt at fodre på baby collard greens (Brassica oleracea varians. viridis) nedsænket i vand eller en opløsning af vand med grøn frugtfarve. Resultaterne viste, at HB fodret og indtages den grøn frugtfarve, som fremgik af deres grønne farvede ekskrementer, i forhold til HB, der indtages grøntsager nedsænket i vand, der havde klart ekskrementer (figur 3).

Supplerende teknikker for forbigående levering af dsRNA af sprøjtning eller rod/jord iblødsætning resultater i dsRNA udbredelse i alle plante væv65,66. Spraybare RNAi-baserede produkter er under udvikling og kan være tilgængelig snart afventer godkendelse. Levering af dsRNA i felterne ved hjælp af spray eller rod gennembløde kan støtte i håndtering af invasive insekter42,67. Fuld størrelse citrus træer og planter blev udsat for dsRNA af Blandtegning spray, eller af jord eller nøgne rod drenching, henholdsvis (figur 4). Resultater viste, at dsRNAs leveret af enten sprays eller jord/nøgne rod gennembløde kunne påvises i Citrus planter (2,5 m høj) for 7 uger indlæg en enkelt eksponering af 2 g af dsRNA42. Levering og indtagelse af psyllid dsRNA-AK (20 ng/µL) steget 30-45% (figur 4D)42psyllid dødelighed.

In vitro transskriberet dsRNA effektivt kan leveres til polyphagous insekter ved hjælp af stamceller hane (trunk injektioner) i genet specifikke dsRNA direkte i kardiovaskulære væv af anlægget, som kan erhverves af insekter, når preying på sådanne planter44 (Figur 5). For citrus træer, der var udsat for dsRNA af stammen injektioner, kunne dsRNA påvises i alderen citrus planter (ca 1 m høj) for 7 uger sende en enkelt eksponering ved hjælp af 6 mL af 1,7 mg/mL af dsRNA i en opløsning af DNase/RNase gratis vand (figur 5A B). Phloem-fodring hemipteran insekter fik derefter lov til at fodre på disse værtsplanter, behandlet med dsRNA. Det antages at dsRNA med succes blev infunderet og bevægede sig gennem det vaskulære system af citrus planter for indtagelse af AVS, som demonstrerede dødelighed når fodret på dsRNA-AK42.

Bioassays er udviklet fra 2008 til 2012, blevet screenet på tværs af en bred vifte af potteplanter og vist sig at give dsRNA levering på en måde, som planter kan absorbere og translocate dsRNA for systemisk dsRNA formidling41,42 . Én metode bruger en ler absorberende komponent med dsRNA adsorption til matrixen ler; Dette omfatter en bred vifte af ler, Valkejord, blegejord, zeolit og andre, som godt som andre absorberende materiale, cellulose, agars, bioplastics, etc. ler partikler er støv gratis nukleinsyre luftfartsselskaber, der kan bruges til at levere aktive ingredienser som dsRNA til jord for plante optagelse og i sidste ende levering til insekter (figur 6). Ler komplekse kan også konfigureres kemisk for at frigive dsRNA under specifikke pH eller ionisk betingelser. Ler leveringsmetoder af dsRNA i planter har vist sig at give dsRNA til potteplanter citrus træer og andre planter i over 14 måneder (data ikke vist). Denne levering system kan bruges til at ændre plante træk, såsom blomst farver, plantehøjde (dwarfing) eller andre. I øjeblikket er den primære anvendelse af denne metode til udvikling af en effektiv insekt skadedyr og patogener (virus) kontrol eller forvaltning. Metoden kan være omkostningseffektive for planteskoler og boligejere, og er en ikke-transgene metode.

Figure 1
Figur 1 . Levering af næringsstoffer eller dsRNA gennem grønne bønner. (A) segmenter af slank økologisk grønne bønner var nedsænket og absorberes løsning i et 2 mL microcentrifuge rør indeholdende 300 µL af enten ddH2O alene eller ddH2O med grøn frugtfarve til 3 h. Tre 4th instar BMSB nymfer blev sultet for 24 h og placeret i kultur, der sammen med 3 grønne bønner pr. fartøj. (B) BMSB feed på segmenter af grønne bønner nedsænket i vand ved piercing gennem de grønne bønner til at nå næringsstofferne med deres stylets. (C) dag 2 af BMSB fodring bioassay, pile betegne ekskrementer. (D) dag 3; Øget BMSB ekskrementer (angivet med pil) observeret post indtagelse af en opløsning af Hedeselskabet2O og grøn frugtfarve gennem grønne bønner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Kvantitativ RT-PCR analyser til at måle niveauet af afskriften efter RNAi-medieret nedbrydning af JHAMT og Vg i BMSB. Total RNA fra 3 individuelle BMSB 4th instar nymfer fodret på JHAMT (A) 20 µg (0.067 µg/µL), og Vg (B) 5 µg (0,017 µg/µL) dsRNAs i 300 µL af Hedeselskabet2O leveret gennem segmenter af grønne bønner, var isolerede og den udskrift niveauer blev målt ved qPCR. LacZ dsRNA (Mock) fungerede som en negativ kontrol. BMSB 18s RNA blev brugt som en intern standard til at korrigere for forskelle i RNA recovery fra væv. Resultaterne rapporteres fra tre biologiske replikater, og fejllinjer angive SEM. En envejs variansanalyse (ANOVA) blev udført for at teste for Statistisk signifikans af data, p < 0,0001. Resultaterne er gengivet fra Ghosh et al. 62 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Oral levering af behandling i Harlekin bug (M. histrionica ) ved hjælp af baby collard greens. Økologisk baby collard greens blev vasket med 0,2% natriumhypochlorit, trimmet og nedsænkes i et 2 mL cap-mindre microcentrifuge rør indeholdende 300 µL opløsning af (A) DNase/RNase gratis ddH2O, eller (B) DNase/RNase gratis ddH2 O løsning med grøn frugtfarve, for en periode af 3 h. Tre 4th instar HB nymfer blev sultet i 24 timer og derefter placeret i kultur fartøjer og tilladt at fodre på disse collard greens i 3 dage. Hvide pile angiver ekskrementer observeret på dag 3 indlæg fodring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Blandtegning spray og root gennembløde ansøgning i citrus træer og planter. Udvalgte planter eller stiklinger forudgående at bruge er ikke vandes for 2-3 dage til at lade jorden udtørre fugtig, men ikke helt tørt. (A) træerne blev først toppet og 200 mL af dsRNA opløsning (0,5 mg/mL) i DNase/RNase gratis vand blev anvendt i hånden pumpe sprayflaske til den lavere baldakin. (B) 100 mL dsRNA løsning (1 mg/mL) i DNase/RNase gratis vand blev anvendt til jorden af kimplanter i delvist tør jord. (C) 100 mL dsRNA opløsning (1 mg/mL) i DNase/RNase gratis vand blev anvendt til de nøgne rødder af plantemateriale til ca 3 h. (D) ACP fodring på frøplanter, der havde absorberet dsRNA af de nøgne rødder, viste øget ACP dødelighed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Citrus sætteplante tree trunk injektion. Citrus planter ca 1 m høje blev sprøjtet med 1,7 mg/mL af dsRNA. (A) bore huller i citrus planter ved hjælp af en 10 mm diameter borehoved for at indsætte injektoren i stængel af planten. Udsatte kobber spidsen af hver injektor blev omviklet med en 0,6 cm (¼ tommer) bred strimmel af forsegling film for at forhindre lækage. (B) injektorer fyldt med 6 mL af farvede løsning blev anvendt på stilk (trunk) af planter. Injektorer blev efterladt på stedet for ca. 6-10 h for fuldstændig optagelse af løsningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Ler jord ændringsforslag levering af dsRNA i planter gennem jorden. En ny linje for at levere materiale: ler, der er støv gratis nukleinsyre bærer til brug i at levere aktive ingredienser som dsRNA til jord for optagelse i planter og i sidste ende til insekter. (A) behøver ler og (B) bagt ler skildrer tolerance/væskeophobning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Potentielle H. halys target gener
Tiltrædelse Størrelse Gen navn/homologi
XP_014293026.1 491 Vitellogeninproduktion-A1-lignende (Vg) (Mulige isoformer: vitellogeninproduktion-2-lignende isoform X1 XP_014291483.1; vitellogeninproduktion-2-lignende isoform X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Juvenile hormon syre O-methyltransferase-lignende (JHAMT) (Mulige homolog: juvenile hormon syre O-methyltransferase XP_014283772.1).
Primere
PCR
Gen navn/homologi Primer navn Sekvens
VG BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG BMSB Vitellog P2 Rasmussen CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 RASMUSSEN GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 Rasmussen GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 RASMUSSEN GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi Rasmussen GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
VG RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG RT Vitellog P2 Rasmussen TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 RASMUSSEN ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18S BMSB 18S F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18S BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS NORMAL GOD LANDBRUGSPRAKSIS-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK quant-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK quant-Rasmussen GTGGTAGATACCGCGACCAG
en balje a-balje-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
en balje a-balje-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Tabel 1. Oligonukleotid sekvenser for RNAi. Er anført de gener og oligonukleotider bruges til at generere PCR fragmenter, dsRNA og qPCR primere til at analysere udskrift niveauer.

Supplerende Video 1: Agars og geler som absorptionsmidler for levering og vedvarende frigivelse af dsRNA. Hydreret syntetiske eller naturlige agars og geler med dsRNA løsning, der kan bruges som lokkemad eller kost til forskellige leddyr. Venligst klik her for at downloade denne video

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAi har vist sig for at være et vigtigt redskab til at udforske gen biologiske funktion og regulering, med stort potentiale til at blive udnyttet til styring af skadedyr19,68,69,70, 71. design og valget af en passende molekylærgenetisk for genhæmning i en given insektarter og metode til levering af den tilsvarende dsRNA(s) til insekt er begge af allerstørste betydning. Den optimale metode til at levere dsRNA til et insekt skal bestemt empirisk, samt relative dosis udvalg for levering, som visse metoder kan tilbyde fordele og andre begrænsninger. For udvikling af en molekylær biopesticide, der i sidste ende kan være egnet til miljømæssige frigivelse, kræves en gennemførlig, effektiv og fordelagtig leveringsmetode. For eksempel, har topikalt dsRNA vist sig for at være effektiv for dsRNA levering til insekt kontrol for citrus og vinstokke42,44. Innovative strategier såsom brugen af lokkemad, saccharose løsninger, gær eller bakterielle dsRNA produktion til direkte indtagelse, topikal applikation af dsRNA på planter eller produktion af særlige dsRNAs af modificerede transgene planter, har fremmet udviklingen af effektiv RNAi-baseret kontrol19,72.

Et godt eksempel er vist her med brug af grønne bønner til at levere dsRNA (figur 1 og figur 2) designet til specifikt indflydelse og reducere et insekt skadedyr af global betydning. Den nyudviklede vegetabilsk medieret dsRNA levering protokol bruger segmenterne i grønne bønner nedsænket og mættet med dsRNA har været anvendt til effektivt målrette gener specifikke for larve udvikling i BMSB. Grønne bønner er en af de mange grøntsager, der er ædt af BMSB og så disse blev brugt som et medium til at levere dsRNA. Andre medier dsRNA leveringsbetingelser blev testet (data ikke vist), men fik ikke medhold i at levere ernæring til BMSB muligvis på grund af forskelle i vaskulære tekstur. Derfor, vi brugte segmenter af grønne bønner til at levere i vitro syntetiseret dsRNA til BMSB nymfer. Nukleinsyrer leveres gennem et anlæg eller vegetabilske medieret teknik kan potentielt kunne fremkalde RNAi i insekt valg som observeret her med nedbrydningen af JHAMT og Vg gener i BMSB (figur 2)62.

Denne vegetabilsk medieret dsRNA levering protokol har været anvendt med succes til at fremkalde RNAi ikke kun i BMSB, men også i HB bruger collard greens (figur 3), selv levering strategier og metoder skal optimeres for hvert gen og insekt. Det anbefales derfor, at forskellige metoder afprøves for levering samt at målrette flere gener af interesse individuelt eller ved stabling mindst to dsRNAs for at opnå bedre fænotypiske penetrans. Flere metoder er summeret for dsRNA levering til insekter og insekt celler herunder fodring13,22, iblødsætning73,74, mikroinjektion75og andre teknikker76 bruges til dsRNA optagelse til at fremkalde systemisk RNAi. Nyere metoder til oral levering af dsRNA til at fremkalde RNAi i andre insekter ved indtagelse på behandlede ikke-transgene planter også blevetundersøgt (figur 4, figur 5og figur 6). Citrus træer er blevet påvist at absorbere dsRNAs enten gennem rødderne, dæmme op for hanen (trunk injektioner) eller Blandtegning sprays42,44. Tidligere, citrustræer og modne vinranker er blevet behandlet med insekt specifikke dsRNA svarende til AK-genet i både AVS- og GWSS. Disse behandlede planter forårsagede en stigning i dødeligheden for både AVS- og GWSS for op til forskellige længder af tid41,45. Sammen viser disse resultater, at dsRNA kan hæmme udtryk af specifikke gener i de undersøgte insekter.

Udfordringer, der påvirker vellykket hæmning af Gen-ekspression omfatter unikke grupper af dsRNA nukleaser (dsRNases) udtrykt primært i gut væv af insekter og spyt sekret eller gut pH, hvilket kan være ansvarlig for nedbrydning af dsRNA47 ,77,78. Men for at overvinde sådanne nedbrydning, systemisk RNAi kan induceres effektivt i insekter af udnytte højere koncentrationer af dsRNA og/eller bruge PLØK i kosten for oral levering af gen-specifikke dsRNA for at overvinde sådanne nedbrydning62, 79. levering og optagelsen af dsRNA kan også være stabiliseret ved hjælp af carrier molekyler, såsom nanopartikler80 som Chitosan48, Liposomer som Lipofectamine 2000 og Metafectene76, polyethylenglycol79, ler nanosheets81, og kulstof quantum dot50. Forskning er i gang at forbedre effektiv levering af dsRNA ved hjælp af agar og gel stykker infunderes med gen specifikke dsRNA (data ikke vist, se supplerende Video 4). Denne teknik kan bruges til levering af en effektiv dosis af dsRNA til myrer, der kan bære dsRNA infunderes harpiks eller agar til reden som føde.

Ud over dsRNA stabilitet er langsigtede persistens af dsRNA i plantevæv af betydning, især for landbrugsafgrøder. dsRNA distribueres gennem kardiovaskulære væv af planter, frugter eller grøntsager kan ophobes i vedvævet og phloem med nedsat enzymaktivitet før der indtages af insekter til at fremkalde RNAi-mekanisme. Det kan være nødvendigt for visse applikationer have dsRNA vare i en kort periode, som i 6 dage i grønne bønner eller længere, for 36 h i jord62,82 således at ophobning af nukleinsyrer i miljøet bliver usandsynligt. Dog Neena et al. viste, at nanosheets kunne beskytte store dsRNAs mod for tidlig forringelse som godt som mægle deres vedvarende frigivelse på blade overflader over en periode på mindst 30 dage81.

Samlet kunne dsRNA levering strategier drøftet her bruges til tavshed insekt specifikke gener for Plantebeskyttelse og skadedyr. Levering af dsRNA til planter gennem vand til kunstvanding, roden gennembløde eller stammen injektion kan være en effektiv strategi for skadedyr insekter som root foderautomater, som ingen effektiv kontrol metode er tilgængelig i øjeblikket. Levering af dsRNA ved hjælp af et luftfartsselskab eller stabilisere medium såsom ler eller agar kan føjes direkte til jord for optagelse af planter. En af de vigtigste årsager til langsomme fremskridt i udviklingen af RNAi medieret molekylære biopesticider har været manglen på effektiv oral levering teknikker til at indlede effektive RNAi og stabilitet under miljøforhold83. Den oral levering metoder skitseret her kan i fremtiden bruges til at levere nukleinsyre medieret genhæmning behandlinger til at plante sap fodring samt tygge insekter at reducere insektangreb i den globale fødevareproduktion og udvikle bæredygtig økologisk skadedyrsbekæmpelse Management.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne parlamentsarbejdet Donald Weber og Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) for at give BMSB og HB for eksperimenter og vedligeholde kolonier; og Maria T. Gonzalez Salvador P. Lopez (USDA, ARS, og Fort Pierce, FL), og Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) for kolonien vedligeholdelse, forberedelse af prøver og analyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).

Tags

Miljøvidenskab spørgsmålet 135 levering brun marmorated stank bug asiatiske citrus psyllid RNA-interferens indtagelse Hemiptera
Dobbelt-strenget RNA Oral leveringsmetoder til at fremkalde RNA-interferens i Phloem og plante-sap-fodring Hemipteran insekter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,… More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter