Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Double-strandet RNA Oral leveringsmåter å indusere RNA-interferens i Phloem og anlegg-sap-fôring Hemipteran insekter

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57390
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, 2Horticultural Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

Summary

Denne artikkelen viser romanen teknikker utviklet oral levering av double-strandet RNA (dsRNA) gjennom vaskulær vev av planter for RNA-interferens (RNAi) i phloem sap fôring insekter.

Abstract

Phloem og anlegg sap fôring insekter invadere integriteten til avlinger og frukt hente næringsstoffer, i prosessen skade matavlinger. Hemipteran insekter konto for en rekke økonomisk betydelige skadedyr planter som skade avlinger av fôring på phloem sap. Brun marmorated stinker feilen (BMSB), Halyomorpha halys (Teger: Pentatomidae) og den asiatisk sitrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Nebbmunner: Liviidae) er hemipteran insekt skadedyr introdusert i Nord-Amerika, hvor de er en invasiv landbruket pest av høy verdi spesialitet, rad og stifte avlinger og sitrusfrukter, samt en ordensforstyrrelser plage når de samle innendørs. Insektmiddel motstand i mange arter har ført til utviklingen av alternative metoder for pest management strategier. Double-strandet RNA (dsRNA)-mediert RNA-interferens (RNAi) er et gen stanse mekanisme for funksjonell genomisk studier som har potensielle anvendelser som et verktøy for styring av insekt skadedyr. Exogenously syntetisert dsRNA eller lite forstyrrende RNA (siRNA) kan utløse høyeffektive genet stanse gjennom nedbrytning av endogene er svært følsomt som presenteres. Effektiv og miljømessige bruk av RNAi som molekylær biopesticides for biocontrol av hemipteran krever i vivo levering av dsRNAs gjennom fôring. Her viser vi metoder for levering av dsRNA til insekter: lasting av dsRNA i grønne bønner ved nedsenkning og absorberende av gen-spesifikke dsRNA med oral levering gjennom inntak. Vi har også skissert ikke-transgene plante levering tilnærminger med foliar spray, rot skyll, trunk injeksjoner samt leire korn, som kan være avgjørende for vedvarende utgivelsen av dsRNA. Effektiv levering av muntlig ingested dsRNA bekreftet som en effektiv dose å indusere en betydelig reduksjon i uttrykk for målrettet gener, som yngel hormon syre O-methyltransferase (JHAMT) og vitellogenin (Vg). Disse innovative metoder representerer strategier for levering av dsRNA til bruk i avlingsvern og overvinne miljøutfordringer for pest management.

Introduction

Hemipteran insekter omfatter noen av økonomisk betydelige skadedyr av agriculturebecause evne å oppnå opphøyet befolkningsvekst og spre sykdommer i planter. BMSB, H. halys Stål, er en invasiv pest som tilfeldigvis ble innført i den vestlige halvkulen i Allentown, Pennsylvania fra Asia (Kina, Taiwan, Korea og Japan) med den første sighting i 19961. Siden introduksjonen, BMSB påvist i 43 stater, med høyeste befolkningen i midtatlantiske (DE, MD, PA, NJ, VA, og WV), som i Canada og Europa, og representerer en potensiell trussel mot landbruket2. Som en Plantesugere pest, kan BMSB bringe skade på ca 300 identifiserte anlegget verter inkludert høy verdi avlinger som epler, druer, dekorative planter, frø avlinger, soyabønner og mais. Skaden skyldes hovedsakelig skyldes modus for fôring kjent som lacerate og flush der dyr gjennomborer vert avlingen med sin nål som stylet å få tilgang til næringsstoffer fra vaskulær vev2,3. BMSB er også et innendørs pest som de kan finne bolig i levende områder som skoler og hus i løpet av høsten gjennom vinteren2. Kjemikalier og aeroallergens befridd av BMSB ble rapportert til illegale allergisk reaksjon i frukt beskjære arbeidere. BMSB kan også bidra til allergiske sykdommen fører til kontakteksem, konjunktivitt og rhinitt i følsomme individer4,5. En annen hemipteran insekt, den ACP, D. citri Kuwayama (Nebbmunner: Liviidae) er en alvorlig pest av sitrusfrukter og overfører phloem-begrenset bakterier (Candidatus Liberibacter asiaticus) forårsaker Huanglongbing (HLB), bedre kjent sitrus greening sykdom6,7. HLB ble først rapportert fra Sør-Kina og har spredt seg til 40 forskjellige asiatiske, afrikanske, Oceanian, Sør og Nord-amerikanske land7. Sitrus greening er et verdensomspennende problem med truende økonomiske og finansielle tap som følge av sitrusfrukter tap; dermed regnes styring av ACP av største betydning å forebygge og kontrollere HLB.

Tiltak for effektiv kontroll over disse insekt skadedyr vanligvis krever bruk av kjemiske plantevernmidler som er relativt korte bodde. Kjemisk insektmiddel kontroll strategier ofte mangler trygt miljøledelse strategier eller har avtatt mottakelighet på grunn av plantevernmidler motstand i pest bestander8,9. Derfor biologisk kontroll av skadedyr med molekylær biopesticides er et potensielt alternativ, men bruk er fortsatt globalt beskjedne, og ulike arter av parasitoider (f.eks Trisolcus japonicus) kan også være effektiv som naturlig biologisk Kontroller. RNAi er potensielt en kommende teknologi for håndtering av invasiv insekt skadedyr med molekylær biopesticides10. RNAi er en godt beskrevet genet regulatoriske mekanisme som muliggjør effektive posttranscriptional gene silencing av endogene samt invaderende dsRNAs i en sekvens-spesifikk måte, som til slutt fører til regulering av genuttrykk på mRNA nivå11,12. Kort, når eksogene dsRNA er internalisert i en celle det behandles i siRNAs av et medlem av bidentate nuclease RNase III gruppe, kalt Dicer, som er evolutionarily bevart i ormer, fluer, planter, sopp og pattedyr13, 14 , 15. disse 21-25 nucleotide siRNA duplexes deretter avviklet og integrert i RNA-indusert stanse komplekset (RISC) som guide RNAs. RISC-RNA komplekset kan Watson-Crick base sammenkobling til den supplerende målrette mRNA; Dette fører til slutt til spalting av Argonaute protein, en multi domene protein inneholder et RNase H-lignende domene, som forringer den tilsvarende mRNA og reduserer protein oversettelsen, og dermed fører til posttranscriptional gene stanse16 , 17 , 18.

RNAi for pest administrasjon krever innføring av dsRNA i vivo til taushet genet av interesse, og dermed aktivere siRNA veien. Ulike metoder som har blitt brukt for dsRNA levering til insekter og insekt celler for å indusere systemisk RNAi inkluderer fôring10,19, soaking20,21, microinjection22, bærere som liposomer 23og andre teknikker24. RNAi var første i Caenorhabditis elegans til taushet unc-22 genuttrykk av brann og Mello25, etterfulgt av knockdown i uttrykket av frizzled genene i Drosophila melanogaster26. Første funksjonelle studier utnyttet microinjection å levere dsRNA i insekter, som APIene mellifera22,27, Acyrthosiphon erter28, Blattella germanica29, H. halys30og Lepidoptera insekter (anmeldt av Terenius et al. 31). microinjection er en fordel å gi en nøyaktig og presis dose til området av interesse i insekt. Men slike septisk punkteringer kan framprovosere uttrykket av immun beslektede gener på grunn av traumer32, derfor utelukker praktiske sin i landbruket biopesticides utvikling.

En annen metoden å levere dsRNA i vivo er soaking, som innebærer inntak eller absorpsjon av dsRNA av suspensjon av dyr eller celler generelt i ekstracellulære medium som inneholder dsRNA. Soaking er brukt til å indusere effektivt RNAi i Drosophila S2 vev kultur celler å hemme Downstream-av-Raf1 (DSOR1) mitogen-aktivert protein kinase kinase (MAPKK)20og C. elegans å slå POS-1 gene33. DsRNA leveres ved hjelp av soaking er imidlertid mindre effektiv å indusere RNAi forhold til microinjection20. RNAi formidlet stanse i et tygge insekt ble først vist i vestlige mais rootworm (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) av infusjonen dsRNA i en kunstig agar kosthold10. Tidligere rapporter har oppsummert metoder for å levere dsRNA infundert i natural dietter gjelder leddyr34. Disse leveringsmåter var mer bestemt å være sammenlignbare effektivt å kunstig mulighet levering; som i tilfelle av tsetse fly (Glossina morsitans morsitans), der lik knockdown av en immun-relaterte genet ble observert når dsRNA ble levert enten gjennom blod måltid eller microinjected35. Tilsvarende levering av dsRNA gjennom dråper i lys brun apple møll (Epiphyas postvittana)36, diamondback møll (Plutella xylostella) Larvene37, samt honning bier38,39 indusert effektiv RNAi. Mest effektive RNAi eksperimenter i hemipteran har utnyttet injeksjon av dsRNA40 fordi muntlig levering av dsRNA i hemipteran insekter er vanskelige siden det skal leveres gjennom verten anlegget vaskulær vev. Effektiv RNAi ble også observert i ACP og glassaktig vanlig sharpshooter leafhopper (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA ble levert gjennom sitrus og vinranker som hadde absorbert dsRNA i vaskulær vev gjennom roten skyll, foliar spray, trunk injeksjoner eller av borekaks41,42,43,44,45,46. Dette resulterte også i første patentet for dsRNA mot ACP (2016, oss 20170211082 A1). SiRNA og dsRNA med bærere som nanopartikler og liposomer formidler stabilitet, og øker i leverte dsRNA effekt er raskt voksende23,47,48,49 ,50. En ny klasse av hydrogenion basert levering biler for nukleinsyrer i vitro og i vivo som var oppsummert spesielt for terapeutiske programmer kan formidle enorme potensial som passer levering vektorer51. Nanopartikler som en levering kjøretøy for dsRNA kan ha ulemper inkludert løselighet, hydrophobicity eller begrenset bioakkumulering52, men en passende polymer hjelpe levering kan kompensere disse ulempene. Utvikling og bruk av selv levere nukleotider dukker også kalt "antisense oligonucleotides", som enkelt strandet RNA/DNA duplexes46.

Vitellogenesis i leddyr er en nøkkel-prosess kontroll reproduksjon og regulert av juvenile hormon (JH) eller isoinokosterone, som er de viktigste indusere av Vg syntese av kroppsfett; Vg er til slutt tatt opp av den utvikle oocyte via Vg reseptor-mediert endocytose53. VG er en gruppe av polypeptides syntetisert extraovarially, som er avgjørende for utvikling av store egg eggeplomme protein, vitellin54,55, og derfor er det viktig for reproduksjon og aldring56. VG har vært vellykket forstummet i nematoder57 samt honningbie (APIene mellifera) der RNAi mediert uttømming av Vg ble observert i voksne og egg22. RNAi formidlet posttranscriptional gene stanse Vg ble testet fordi det ble antatt sin uttømming ville føre til en observerbar fenotypiske effekt som redusert fruktbarhet og fruktbarhet, å hjelpe BMSB kontroll. JHAMT genet som kodes i S-adenosyl-L-metionin (SAM)-avhengige JH syre O-methyltransferase, gir det siste trinnet av JH biosyntesen sti58. I denne veien farnesyl er pyrophosphate (FPP) sekvensielt forvandlet fra farnesol, til farnesoic syre etterfulgt av konvertering av metyl farnesoate til JH av JHAMT. Denne veien er bevart i insekter og leddyr spesielt for metamorfose, en prosess som er developmentally regulert av hormoner59,60,61. I B. moriforeslår JHAMT genuttrykk og JH biosyntetiske aktiviteten i Corpora allata at transcriptional undertrykkelse av JHAMT genet er avgjørende for avslutning av JH biosyntesen58. Derfor ble JHAMT og Vg genene valgt for målrettet uttømming bruker RNAi. RNAi ble også testet i sitrustrær for kontroll av ACP og GWSS. Sitrus trær ble behandlet med dsRNA gjennom roten skyll, stammer trykk (bagasjerommet injeksjoner), samt foliar spray med dsRNAs mot insekt bestemt arginine kinase (AK) transkripsjoner42,44. Aktuell anvendelse av dsRNA ble oppdaget over kalesjen av sitrustrær, indikerer effektiv levering gjennom planter vaskulær vev, og resulterte i økte dødeligheten i ACP og GWSS41,42, 45.

I denne studien, har vi identifisert en naturlig kosten Leveringsmetode for behandlinger som dsRNA. Denne nyutviklet teknikken ble brukt for å stanse JHAMT og Vg mRNA bruke genet bestemte dsRNAs i BMSB nymfer som vist tidligere62. Disse nye levering protokoller demonstrert her erstatter konvensjonelle RNA leveringssystemer som bruker aktuell spray eller microinjections. Grønnsaker og frukt, stilk trykk, jord gjennomvåt og leire Absorpsjonsmidler i kan bli brukt for levering av dsRNA, som er avgjørende for videreutvikling av biopesticide pest og patogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. BMSB bakside

  1. Bak BMSB insekter som standard lab praksis og beskrevet tidligere63.
  2. Øke ACP (D. citri) insekter på sitrus macrophylla i en glasshouse (22 ° C) og naturlig lys. Bruk voksen ACP, på ca 5-7 dager legge eclosion.

2. valg av Gene regioner og I Vitro syntese av dsRNA

  1. Velg gener gjelder BMSB fra tidligere publiserte transcriptome profiler32.
  2. Sikre regionene rundt valgt varierer mellom 200-500 base parene.
  3. Utføre polymerasekjedereaksjons (PCR) ved hjelp av vilkårene som beskrives nedenfor til å generere fragmenter tilknyttet valgte genet av interesse fra genomisk DNA. Se tabell 1 for gen-spesifikke oligonucleotides.
    1. PCR reaksjon: I en 0,25 mL PCR tube, kombinere 5 µL av 10 X PCR Buffer, 4 µL av dNTP blanding (2,5 mM hver), 2 µL av DNA mal (50 ng/µL), 2,5 µL hver av primere 1 og 2 (10 µM), 0,25 µL av DNA polymerase (5 U/µL) , og DNase/RNase gratis vann opptil 50 µL.
    2. PCR tilstand: sykle PCR reaksjonen til forsterke området av interesse på 95 ° C i 3 min etterfulgt av 30 sykluser av 98 ° C for 10 s, 55 ° C for 30 s, 72° C i 1 Incubate reaksjonen ved 72 ° C i en ekstra 10 min. rense PCR reaksjon bruker en rensing kit.
  4. Forsterke innhentet PCR fragmenter videre med gene bestemt primere flankert med T7 RNA polymerase promoter sekvensen (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3) som nevnt tidligere62.
  5. Bruke LacZ genet som en negativ kontroll (falske) for RNAi.
    Merk: LacZ er et gen som koder β-galactosidase forsterket fra Escherichiacoli genomisk DNA (primere brukt er oppført i tabell 1).
  6. Utføre i vitro transkripsjon å gi dsRNA som beskrevet tidligere62.
  7. Oppløse og resuspend den resulterende dsRNA i 150 µL DNase/RNase gratis vann, måle konsentrasjonen og lagre-80 ° c for fremtidig bruk.

3. levering av dsRNA bruke grønne bønner

  1. Velg tidlig 4th skikkelsen BMSB nymfer klekket fra samme egg masse og sulte dem for 24 timer før dsRNA fôring.
  2. Velg slanke sertifiserte organiske grønne bønner (Phaseolus vulgaris L.) og vask med 0,2% natriumhypokloritt løsning 5 min.
    Merk: Slank grønne bønner ble valgt slik at bønner kan lett innpasses i 2 mL microcentrifuge rørene.
  3. Vask 3 ganger med ddH2O og la luften tørr.
  4. Trimme den grønn bønner fra calyx slutten til en total lengde på 7,5 cm med en ren barberblad.
  5. Fordype vasket og trimmet grønne bønner i en cap-mindre 2 mL microcentrifuge rør som inneholder 300 µL av kontrolløsning (en 1:10 fortynning grønn konditorfarge (ingredienser: vann, propylenglykol, Fd & C gul 5, Fd & C blått 1 og Propylparaben som konserveringsmiddel)).
  6. Gjør fortynninger av i vitro syntetisert LacZ, JHAMT eller Vg dsRNAs ved utvannende 5 µg eller 20 µg i 300 µL RNase/DNase gratis vann å gi endelige konsentrasjoner av 0.017 µg/µL eller 0.067 µg/µL, henholdsvis.
  7. Fordype vasket og trimmet grønne bønner i en cap-mindre 2 mL microcentrifuge rør som inneholder 300 µL dsRNA løsning (fra trinn 3.6).
  8. Pakk og forsegle kantene av microcentrifuge tuber omsluttende oppslukt bønner å unngå fordampning av dsRNA løsningen og hindre dyrene å microcentrifuge røret.
  9. Plasser disse rørene i en oppreist måte ved romtemperatur for 3 h å tillate dsRNA løsningen lastes hele grønne bønne kapillær handling.
  10. Plass disse rørene i ren kultur fartøy (polypropylen). Sted tre sultet 4th skikkelsen BMSB nymfer i kultur fartøyer.
  11. Behandle tre dyr per kultur fartøyet hver inneholder tre grønne bønner med grønne food coloring eller dsRNA løsning. Opprettholde insekter ved 25 ° C og 72% relativ fuktighet, under en 16 L: 8D fotoperiode i en inkubator.
  12. Tillate insekter å mate på den grønne bønner (oppslukt og absorberes av dsRNA) for 5 dager, men fylle med frisk kosten for dsRNA behandling grønne perler etter 3 dager.

4. sanntid kvantitativ analyse av Gene Expression følgende RNAi mediert stanse i BMSB (qPCR)

  1. Måle effekten av RNAi på nivået av utskriften uttrykk ved qPCR.
  2. Isolere den totale RNA fra dsRNA behandlet dyr og syntetisere cDNA62.
  3. Setup qPCR reaksjoner med en sanntids PCR-system og primerne oppført i tabell 1. Bruk følgende qPCR sykling betingelse: 95 ° C i 10 min etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 15 s, 60 ° C i 1 min, sammen med dissosiasjon skritt inkludert 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min, 95 ° C i 15 s , og 60 ° C i 15 s.
  4. Bestemme qPCR standarder: Bruk den serielle fortynning av cDNA utarbeidet av totale RNA isolert fra en vanlig dyr som en referanse standard for kvantifiseringen.
  5. Bruk BMSB 18s RNA som interne standard korrigere forskjeller i RNA utvinning fra vev32.

5. foliar Spray programmet i stor potteplante sitrus trær og planter

Merk: Planter av sitrus sorten 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae), ble opprettholdt i en glasshouse under naturlig lys og temperatur, vokst 1,2 L beholdere. Plantene ble stadig beskjæres for å fremme veksten av nye foliar skudd, kalt 'flush'. ACP foretrekker å mate og oviposition på nye veksten av sitrus64.

  1. Velg planter eller stiklinger og ikke vann dem for 2-3 dager før å bruke la jorda tørke ut damp, men ikke helt tørt.
  2. En hånd pumpe sprayflaske bruk en 200 mL dsRNA løsning (0,5 mg/mL) på lavere kalesjen (figur 4A).
    Merk: Forberede ovenfor nevnte dsRNA løsninger i DNase/RNase gratis vann.
  3. Etter spray program, tillate anvendt dsRNA løsningen å bli helt absorbert av bladene.
    Merk: Sitrustrær absorbert av brukt dsRNA, og deretter blader fra enten ny vekst eller grener som var dekket før, ble utvunnet; dsRNA var synlig med qPCR og viste systemisk bevegelse i tre topp baldakin bladene i 3-4 h44,45,46.
  4. Prøve ny vekst fra tidligere toppet trær etter 25-40 dager ved å samle ca 10 forlater fra tuppen av fire grener. Pakk ut den totale RNA og analysere dem ved omvendt transkripsjon PCR (RT-PCR) og qPCR for tilstedeværelsen av brukt dsRNA utløseren bruker primerne oppført i tabell 1 og tidligere beskrevet metoder46.
    Merk: Utvalg innsamling, totalt RNA isolasjon, RT PCR og qPCR ble utført som beskrevet tidligere46.
  5. Tilsvarende lokalt spray 10 mL dsRNA fra nedre regionen i en frøplante eller lite potted tre løvverk.
    Merk: Hemipteran insekter (ACP og GWSS) ble gitt fôring tilgang normalt på 24 h, legge behandlinger på ny vekst (blader) som ikke hadde vært direkte sprayet eller som vokste uker senere, eller hele planter. Dette produsert insekter som testet positivt for dsRNA på 3, 6 og 10 dager, stolpe mate.

6. jord/Root skyll programmet i store eller små Potted sitrus trær og planter

  1. Velg planter eller stiklinger og ikke vann dem for 2-3 dager før å bruke la jorda tørke ut til fuktig, men ikke helt tørr (Dette oppretter luft plass å holde flytende løsningen brukes).
  2. Legg 1 L dsRNA løsning (0,2 mg/mL) til jord av store potteplanter (ca 2,5 m) og Legg 1 L vann (chaser) etter 1 time.
  3. Bruke 100 mL dsRNA løsning (1,33 mg/mL) jord av 1 m høy potted trær i delvis tørr jord.
  4. Bruke 10 mL dsRNA løsning (1 mg/mL) for små frøplanter, jord i koner eller nakne røttene (figur 4B, C).
  5. Gi plantene som mottar den dsRNA løsningen som en jord skyll suge 30 min. Deretter bruke vanlig vann bare behandling for å hjelpe absorpsjon av røtter (20 mL for planter i gul beholdere) eller 100 mL hvis større blomsterpotter > 1 gallon.
    Merk: Lokalt brukt dsRNA til løvverk resulterte i oppdaging høyst distale tuppen av avdelinger innen 3-6t innlegget behandlinger, viser systemisk bevegelse gjennom trærne. Nye vekst grener testet positivt for dsRNA på 60-90 dagers innlegget behandlinger. Borekaks tilbys til insekter (ACP og GWSS) i en dsRNA fôring bioassay44.

7. stem trykk (Tree Trunk injeksjon) program i store Potted sitrus trær og planter

  1. Velg sitrus frøplanter, nye, eller ca 3,5 år gamle planter for sprøytebruk dsRNA bruker stammen trykk (bagasjerommet injeksjoner) metoden.
  2. Bore hull på sitrus planter ved hjelp av en drill og litt 10 mm drill, ta vare ikke for å overstige 2 cm eller halv diameteren på stammen.
  3. Pakk kobber spissen av hver injektor 4 - 6 ganger med en 0,6 cm (¼ tomme) bred stripe med tetting filmen for å forhindre lekkasje nær spissen.
  4. Fylle tree trunk sprøytebrukere med 6 mL (1,7 mg/mL) dsRNA løsning fortynnet i DNase/RNase gratis vann (betegnet som farget løsning).
  5. Injisere løsningen i bagasjerommet på treet og la injektoren i bagasjerommet 6-10 h å tillate absorpsjon av dsRNA løsning. Tillate insekter å mate på borekaks behandlet trær på 3, 10 og 30 dager innlegg behandling.
    Merk: Faste dsRNA injisert med metoden bagasjerommet injeksjon i trærne for en periode på 30-60 dager41,42,44. Validering for RNAi ble utført av qPCR bruker primerne oppført i tabell 1.

8. dsRNA behandlet leire granulater for levering til insekter gjennom jord

  1. Utøse leire absorberende til en 50-mL konisk rør til 35 mL merke (ca 30 g leire absorberende) på røret.
  2. Hell 20 mL dsRNA løsning fortynnet i DNase/RNase gratis vann (100 µg/mL) inn i røret våt alle absorberende. Cap konisk røret tips røret for å fjerne luft og cap røret.
  3. Sett røret oppreist og la den stå i 1-2 min for leire partiklene til å absorbere løsningen.
  4. Legg nok dsRNA-gjennomvåt leire til jord blanding å fylle en 1 gallon potten.
  5. Bland og slå jorden for hånd for å grundig blande dsRNA-gjennomvåt leire i jorden.
  6. Bruk denne jord repot seedlings valgt for dsRNA behandling.
  7. Vann jorda med 200 mL vanlig vann uten dsRNA. Etter 30 minutter til 1 h, følg med 100 mL rent vann. Etter 24 timer, kan du sette anlegget på en normal vanning tidsplan.
  8. Teste 4-6 blader av behandlet potteplanter med leire Absorpsjonsmidler og dsRNA hver måned innlegg behandling for dsRNA ved å samle mest apikale bladene av nye plantevekst.
    Merk: Planter eller stiklinger fra disse behandlede planter fôres til insekter helst etter 24 h legge behandling og å levering RNAi for opp til ett år til insekter (upubliserte data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vegetabilsk mediert dsRNA levering gjennom fôring i BMSB 4th skikkelsen nymfer ble testet for utvikling av molekylære biopesticides bruker RNAi for invasiv insekt skadedyr. BMSBs feed ved hjelp av deres inntil stylets av en mekanisme som kalles lacerate og flush, som forårsaker betydelig skade på avlinger. Slank organiske grønne bønner, P. vulgaris L., ble brukt til å teste om næringsstoffer eller dsRNA kan leveres i vivo til BMSB gjennom fôring3. Segmenter av grønne bønner var oppslukt i DNase/RNase gratis vann eller vann og grønn konditorfarge teste levering i BMSB (figur 1A). Den grønn konditorfarge ble brukt som en visuell indikasjon for å imitere dsRNA. Vaskulær vev av den grønne bønner var mettet med grønn konditorfarge på grunn av flyten av grønne fargede løsning gjennom phloem av kapillær handling62. BMSB nymfer ble sett fôring på delene av grønne bønner ved å sette inn sine stylets i vaskulær vev av den grønne bønner (figur 1B). Grønne fargede ekskrementer dråper ble observert etter dagene 2 og 3 i insekter som ble matet på bønner mettet med grønne food coloring indikerer leverte materialet hadde blitt svelget muntlig og gikk gjennom tarmen før ekskresjon (figur 1 c, D ).

Senere testet vi hvis betydelig uttømming av målrettet genuttrykk ble gjort ved hjelp grønn bønne mediert levering av BMSB bestemte dsRNA gjennom inntak i BMSB. Grønne bønne segmenter var oppslukt og absorberes en løsning 0.067 µg/µL (20 µg i 300 µL DNase/RNase gratis vann) eller 0.017 µg/µL (5 µg i 300 µL DNase/RNase gratis vann) av i vitro syntetisert dsRNA spesifikke for BMSB JHAMT og Vg , henholdsvis. Grønne bønner var også nedsenket i vann alene, 0.067 µg/µL eller 0.017 µg/µL LacZ dsRNA (Mock) som respektive kontroller. Transkripsjon nivåer ble vurdert qPCR indikerer at uttrykk for JHAMT og Vg mRNA ble betydelig redusert i vivo nesten 4,5- og 2.2-fold, henholdsvis (figur 2A, B). Følgelig indikerer resultatene at dsRNA kan bli levert gjennom vaskulær vev av grønne bønner å indusere vellykket RNAi.

En annen hemipteran pest, Harlequin feilen (HB) (Murgantia histrionica), som forårsaker skade på cole avlinger var testet hvis vellykket leveranse av næringsstoffer eller dsRNA behandlinger kan leveres med vegetabilske mediert levering. 4th skikkelsen HB nymfene ble tillatt å spise baby grønne grønnsaker (Brassica oleracea var. viridis) nedsenket i vann eller en løsning av vann med grønn konditorfarge. Resultatene indikerte at HB matet og svelget den grønn konditorfarge, som var synlig fra sine grønne fargede ekskrementer, sammenlignet med HB som inntatt grønnsaker nedsenket i vann, som hadde klart ekskrementer (Figur 3).

Flere teknikker for forbigående levering av dsRNA av sprøyting eller root/jord soaking resultater i dsRNA opptak i hele anlegget vev65,66. Spraybare RNAi-baserte produkter er i utvikling, og kan være tilgjengelig snart venter på godkjenning. Levering av dsRNA i feltene med spray eller root skyll kan hjelpe i å håndtere invasiv insekter42,67. Store sitrus trær og planter ble utsatt for dsRNA enten ved foliar spray eller ved jorden eller bare rot gjennomvåt, henholdsvis (Figur 4). Resultatene indikerte at dsRNAs levert av enten spray eller jord/bare rot skyll ble oppdaget i Citrus planter (2,5 m høy) for 7 uker innlegg en enkelt eksponering av 2 g dsRNA42. Levering og inntak av psyllid dsRNA-AK (20 ng/µL) økt psyllid dødelighet av 30-45% (Figur 4 d)42.

In vitro transkribert dsRNA effektivt kan leveres til Plantesugere insekter ved hjelp av stammen trykk (bagasjerommet injeksjoner) av genet bestemte dsRNA direkte inn i vaskulær vev av anlegget, som kan bli kjøpt opp av insekter når utnytter på slike anlegg44 (Figur 5). For sitrus trær som var utsatt for dsRNA av bagasjerommet injeksjoner, dsRNA ble oppdaget i alderen sitrus planter (ca 1 m høy) for 7 uker innlegget en enkelt eksponering bruker 6 mL av 1,7 mg/mL av dsRNA i en løsning av DNase/RNase gratis vann (figur 5A B). Phloem-fôring hemipteran insekter var da lov å spise disse Salix behandlet med dsRNA. Det antas at dsRNA var vellykket infundert og flyttet gjennom vaskulære system av sitrus planter for inntak av ACP, som viste dødelighet når matet på dsRNA-AK42.

Bioassay har utviklet fra 2008 til 2012, vært vist i en rekke potteplanter og vist å gi dsRNA levering på en måte som planter kan absorbere og translocate dsRNA til systemisk dsRNA formidling41,42 . En metode bruker en leire absorberende komponent med dsRNA adsorpsjon i leire matrix; Dette inkluderer et bredt utvalg av leire, Fuller's Earth, Zeolitt og andre, som andre absorberende materiale, cellulose, agars, Bioplast, etc. Clay partiklene er støv ledig nukleinsyre bærere som kan brukes for å levere aktive ingredienser som dsRNA til jord for plante opptak og levering til insekter (figur 6). Leire komplekse konfigureres også kjemisk for å løslate dsRNA under bestemte pH eller ioniske forhold. Clay leveringsmåter av dsRNA i planter har vist å gi dsRNA til potted sitrus trær og andre planter i over 14 måneder (data ikke vist). Levering systemet kan brukes til å endre anlegget trekk, som blomst farger, plantehøyde (dwarfing) eller andre. Foreløpig er den primære bruken av denne metoden for utvikling av en effektiv insect pest og patogen (virus) kontroll eller ledelse. Tilnærmingen kan være kostnadseffektivt for barnehager og huseiere, og er en ikke-transgene metode.

Figure 1
Figur 1 . Levering av næringsstoffer eller dsRNA gjennom grønne bønner. (A) segmenter av slanke organiske grønne bønner var oppslukt og absorberes løsningen i en 2 mL microcentrifuge rør som inneholder 300 µL ddH2O alene eller ddH2O med grønn konditorfarge, 3 h. Tre 4th skikkelsen BMSB nymfer var utsultet 24 h og plassert i kultur fartøy med 3 grønne bønner per fartøy. (B) BMSB feed på segmenter av grønne bønner nedsenket i vann ved piercing gjennom den grønne bønner å nå næringsstoffer med deres stylets. (C) dag 2 av BMSB fôring bioassay, piler betegne ekskrementer. (D) dag 3; Økt BMSB ekskrementer (betegnet av pilen) observerte innlegget inntak av en løsning på ddH2O og grønn konditorfarge gjennom grønne bønner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Kvantitativ RT PCR-analyse for å måle nivået av utskriften etter RNAi-mediert uttømming av JHAMT og Vg i BMSB. Total RNA fra 3 personlige BMSB 4th skikkelsen nymfer matet på JHAMT (A) 20 µg (0.067 µg/µL), og Vg (B) 5 µg (0.017 µg/µL) dsRNAs i 300 µL ddH2O leveres gjennom segmenter av grønne bønner, ble isolert og transkripsjon nivåer ble målt ved qPCR. LacZ dsRNA (Mock) var en negativ kontroll. BMSB 18s RNA ble brukt som en intern standard korrigere forskjeller i RNA utvinning fra vev. Resultatene rapporteres fra tre biologiske gjentak, og feilfelt indikerer at det SEM. En enveis analyse av varians (ANOVA) ble utført for å teste for statistiske betydning av data, p < 0,0001. Resultatene gjengitt fra Ghosh et al. 62 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Muntlig levering behandling i Harlequin bug (M. histrionica ) bruke baby grønne grønnsaker. Organisk baby grønne grønnsaker ble vasket med 0,2% natriumhypokloritt trimmet og midt i en 2 mL cap-mindre microcentrifuge rør som inneholder 300 µL av løsning av (A) DNase/RNase gratis ddH2O, eller (B) DNase/RNase gratis ddH2 O løsning med grønn konditorfarge, for en periode på 3 h. Tre 4 skikkelsen HB nymfer var sultet for 24 timer og deretter plassert i kultur fartøy og lov til å spise disse grønne grønnsaker for 3 dager. Hvite pilene angir ekskrementer observert på dag 3 stolpe mate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Foliar spray og rot skyll programmet i sitrus trær og planter. Valgte planter eller stiklinger før du bruker er ikke vannet i 2-3 dager å la jorda tørke ut damp, men ikke helt tørt. (A) trær ble først toppet og 200 mL dsRNA løsning (0,5 mg/mL) i DNase/RNase gratis vann ble anvendt for hånd pumpe sprayflaske til lavere kalesjen. (B) 100 mL dsRNA løsning (1 mg/mL) i DNase/RNase gratis vann ble brukt til jord av frøplanter i delvis tørr jord. (C) 100 mL dsRNA løsning (1 mg/mL) i DNase/RNase gratis vann ble brukt bare røttene av planter for ca 3 h. (D) ACP fôring på planter som hadde absorbert dsRNA av nakne røttene, viste økt ACP dødelighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Sitrus frøplante tree trunk injeksjon. Sitrus seedlings ca 1 m høy ble injisert med 1,7 mg/mL dsRNA. (A) bore hull i sitrus seedlings bruker en 10 mm diameter borekronen sette inn injektoren i stammen av anlegget. Utsatte kobber spissen av hver injektor var innpakket med en 0,6 cm (¼ tomme) bred stripe med tetting filmen for å forhindre lekkasje. (B) sprøytebrukere fylt med 6 mL farget ble brukt til stammen (trunk) i seedlings. Sprøytebrukere var igjen i stedet for ca 6-10 timer for komplett opptak av løsningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Leire jord endring levering av dsRNA til planter gjennom jord. En ny linje av leverer materiale: leire som er støv ledig nukleinsyre bærer for bruk i å levere aktive ingredienser som dsRNA til jord for opptak i planter og til slutt til insekter. (A) ubrent leire og (B) bakte clay avbilder toleranse/vannretensjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Potensielle H. halys målet gener
Tiltredelse Størrelse Gene navn/homologi
XP_014293026.1 491 Vitellogenin-A1-aktig (Vg) (Mulig isoformene: vitellogenin-2-lignende isoformen X1 XP_014291483.1; vitellogenin-2-lignende isoformen X2 XP_014291484.1).
XP_014290953.1 545 Juvenile hormon syre O-methyltransferase-like (JHAMT) (Mulige homolog: juvenil hormon syre O-methyltransferase XP_014283772.1).
Primere
PCR
Gene navn/homologi Primer navn Sekvens
VG BMSB Vitellog P2 F CAATTTGATCCACCGACTGTT
VG BMSB Vitellog P2 R CCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH P1 F GGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH P1 R GTATAGGATTGCCATTTTGG
T7 PCR
VG T7 BMSB Vitellog P2 4263 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCAAAGTTGGAAGGGAATGA
VG T7 BMSB Vitellog P2 4753 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGCATGAATCTTACTCTGGA
JHAMT BMSB JH T7 P1 F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGATGCTTATGAATAATCCAG
JHAMT BMSB JH T7 P1 R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTATAGGATTGCCATTTTGG
LacZ T7 LacZ RNAi F GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGAAAGCTGGCTACAGGA
LacZ T7 LacZ RNAi R GAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCAGGCTTCTGCTTCAAT
AK dsAK-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
AK dsAK 50-F TAATACGACTCACTATAGGGAGTGGCATTCTTGTATGGCGTA
AK dsAK 50-R TAATACGACTCACTATAGGGAGTGAAGCCCTTGTGGTAGTC
AK dsAK 30-F TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCGGACTCTGGAGTAGG
AK dsAK 30-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGCCTGCAAGAATCTGTCTCC
GFP dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGAGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTT
GFP dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGAGGTAATGGTTGTCTGGTAAAAGGA
qPCR
VG RT Vitellog P2 F TTGATAGTTGTTTGGATTTTGAAGGT
VG RT Vitellog P2 R TCTTACTTGATCAGCGCTCAGAA
JHAMT BMSB JH RT P1 F AGGAAAACCCAAAATGGCAAT
JHAMT BMSB JH RT P1 R ATGTATTCTTCTTTTGGATCTTTTCTTGAG
18S BMSB 18S F3 ATGCCCCCGCCTGTCCTTATT
18S BMSB 18S R3 TGAAAGCAGCCTGAATAGTGG
GFP GFP-F GGTAAAAGGACAGGGCCATC
GFP GFP-R TCAAGGAGGACGGAAACATC
AK AK quant-F CGGACTTGAGGGAGAACTGA
AK AK quant-R GTGGTAGATACCGCGACCAG
en-badekar a-badekar-F GCGTCTCTTCGGTTTGACGG
en-badekar en-badekar-R CACTTCACCATCTGGTTGGC

Tabell 1. Oligonucleotide sekvenser for RNAi. Oppført er gener og oligonucleotides brukes til å generere PCR fragmenter, dsRNA og qPCR primere analysere transkripsjon nivåene.

Supplerende Video 1: Agars og gels som Absorpsjonsmidler for levering og vedvarende utgivelsen av dsRNA. Hydrert syntetiske eller agars og gels med dsRNA-løsning som kan brukes som agn eller dietter for ulike leddyr. Klikk her for å laste ned denne videoen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNAi har vist seg for å være et viktig verktøy for å utforske gen biologisk funksjon og regulering, med stort potensial til å brukes til behandling av insekt skadedyr19,68,69,70, 71. design og valg av en passende gene(s) for å stanse i insekt artene og metode for levering av det tilsvarende dsRNA(s) til insekt er av største betydning. Den optimale metoden for å levere dsRNA til et insekt må bestemmes empirisk, sammen med relativ dose utvalget for levering, som bestemte metoder kan tilby fordelene og andre begrensninger. For utviklingen av en molekylær biopesticide som kan til slutt være passende for miljømessige utgivelse, kreves det en mulig, effektiv og fordelaktig leveringsmetode. For eksempel har lokalt anvendt dsRNA vist seg for å være effektive for dsRNA levering for insekt kontroll til sitrus og vinranker42,44. Innovative strategier som bruk av agn, sukrose løsninger, gjær eller bakteriell dsRNA produksjon for direkte inntak, aktuell anvendelse av dsRNA på planter eller produksjon av bestemte dsRNAs endret transgene anlegg, har avansert utvikling av effektive RNAi-basert kontroller19,72.

Et godt eksempel er vist her med bruk av grønne bønner å levere dsRNA (figur 1 og figur 2) spesielt påvirke og redusere et insekt pest av global betydning. Den nyutviklede vegetabilske mediert dsRNA levering protokollen bruker segmenter av grønne bønner oppslukt og mettet med dsRNA er brukt til å effektivt målet gener bestemt for larver utvikling i BMSB. Så disse ble brukt som et medium for å levere dsRNA grønne bønner er en av de mange grønnsakene som blir fortært av BMSB. Andre medier dsRNA levering var testet (data ikke vist), men mislyktes i å forsyne ernæring til BMSB sannsynligvis forskjeller i Vaskulær struktur. Derfor brukte vi deler av grønne bønner for å levere i vitro syntetisert dsRNA til BMSB nymfene. Nucleic syrer leveres gjennom en plante- eller vegetabilske mediert teknikk kan potensielt kunne indusere RNAi i insekt valgfrihet observert her med uttømming av JHAMT og Vg gener i BMSB (figur 2)62.

Denne vegetabilsk mediert dsRNA levering protokollen har vært brukt med hell å indusere RNAi ikke bare i BMSB, men også i HB bruker grønne grønnsaker (Figur 3), skjønt levering strategier og metoder må optimaliseres for hver genet og insekt. Det anbefales derfor at ulike metoder bli testet for levering i tillegg å målrette flere gener av interesse individuelt eller ved stabling minst to dsRNAs for å få bedre fenotypiske penetrance. Flere metoder har blitt summert for dsRNA levering til insekter og insekt celler inkludert fôring13,22, soaking73,74, microinjection75og andre teknikker76 brukes for dsRNA opptak å indusere systemisk RNAi. Nyere metoder for muntlig levering av dsRNA å indusere RNAi i andre insekter ved svelging på behandlet ikke-transgene planter har også vært utforsket (Figur 4 figur 5og figur 6). Sitrustrær har vist seg å absorbere dsRNAs enten gjennom røttene, stammer trykke (bagasjerommet injeksjoner), eller foliar spray42,44. Tidligere har sitrustrær og modne vinranker blitt behandlet med insekt bestemte dsRNA tilsvarer AK genet både ACP og GWSS. Disse behandlede planter forårsaket en økning i dødelighet for både ACP og GWSS for opp til lengre tid41,45. Sammen viser disse resultatene at dsRNA kan hindre uttrykk for bestemte gener i studerte insekter.

Utfordringene som påvirker vellykket stanse genuttrykk omfatter unike grupper av dsRNA nucleases (dsRNases) uttrykt i tarmen vev av insekter og salivary sekreter eller tarmen pH som kan være ansvarlig for nedbrytning av dsRNA47 ,77,78. Men for å overvinne slike fornedrelse, systemisk RNAi kan bli indusert effektivt i insekter utnytte høyere konsentrasjoner av dsRNA og/eller bruke pinne i kostholdet for muntlig levering av gen-spesifikke dsRNA for å overvinne slike fornedrelse62, 79. levering og opptak av dsRNA kan også bli stabilisert med hjelp av operatør molekyler, som nanopartikler80 som Chitosan48, liposomer som Lipofectamine 2000 og Metafectene76, polyetylenglykol79, leire nanosheets81, og karbon quantum dot50. Forskning pågår å forbedre effektiv levering av dsRNA med agar og gel stykker tilført genet bestemte dsRNA (data ikke vises, se supplerende Video 4). Denne teknikken kan brukes for levering av en effektiv dose av dsRNA til maur som kan bære dsRNA infundert harpiks eller agar til reiret som mat.

Stabilitet i dsRNA er langsiktige utholdenhet av dsRNA i anlegget vev viktig, spesielt for jordbruksprodukter. dsRNA distribueres gjennom vaskulær vev av planter, frukt eller grønnsaker kan akkumuleres i vedvev og phloem med redusert enzym aktivitet før blir ingested av insekter å indusere RNAi mekanismen. Det kan være nødvendig for visse programmer har dsRNA vare for en kort periode, som i 6 dager i grønne bønner eller lenger, 36 h i jord62,82 slik at opphopning av nukleinsyrer i miljøet blir usannsynlig. Imidlertid Neena et al. vist at nanosheets kan beskytte store dsRNAs fra tidlig fornedrelse som vel som megle deres oppholdt utgivelse på blad overflater over en periode på 30 dager81.

Samlet kan dsRNA levering strategiene omtalt her brukes til taushet insekt bestemte gener for pest management. Levering av dsRNA til planter gjennom irrigasjon vann, rot skyll eller bagasjerommet injeksjon kan være en effektiv strategi for Klegger, som root feeders, som ingen effektiv kontroll metoden er tilgjengelig. Levering av dsRNA bruker en operatør eller stabilisere medium som leire eller agar kan legges direkte til jorda for opptak av planter. En av de viktigste årsakene til langsom fremgang i utviklingen av RNAi mediert molekylær biopesticides er mangel på effektiv muntlig levering teknikker for å iverksette effektive RNAi og stabilitet under miljøforhold83. Muntlig levering metodene som er nevnt her kan i fremtiden brukes for å levere nukleinsyre mediert genet stanse behandlinger for å plante sap fôring samt tygge insekter å redusere insekt skade i globale matproduksjon og utvikle bærekraftige økologiske pest behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner takknemlig Donald Weber og Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) gir BMSB og HB for eksperimentering og opprettholde koloniene; og Maria T. Gonzalez Salvador P. Lopez (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) og Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) for kolonien vedlikehold, prøve forberedelse og analyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BMSB (H. halys) insects  USDA
ACP (D. citri) insects  USDA
organic green beans N/A
Citrus plants USDA
sodium hypochlorite solution J.T. Baker
green food coloring  McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers  Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture) Sigma
Primers  IDT DNA
SensiMix SYBR Bioline
qPCR ABI 7500 Applied Biosystems 
Spray bottle N/A
Parafilm American Can Company
TaKaRa Ex Taq Clontech
QIAquick Qiagen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoebeke, E. R., Carter, M. E. Halyomorpha halys (Stǻl)(Heteroptera: Pentatomidae): a polyphagous plant pest from Asia newly detected in North America. , (2003).
  2. Leskey, T. C., Hamilton, G. C., et al. Pest Status of the Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha Halys in the USA. Outlooks on Pest Management. 23 (5), 218-226 (2012).
  3. Peiffer, M., Felton, G. W. Insights into the Saliva of the Brown Marmorated Stink Bug Halyomorpha halys (Hemiptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (2), e88483 (2014).
  4. Anderson, B. E., Miller, J. J., Adams, D. R. Irritant contact dermatitis to the brown marmorated stink bug, Halyomorpha halys. Dermatitis : contact, atopic, occupational, drug. 23 (4), 170-172 (2012).
  5. Mertz, T. L., Jacobs, S. B., Craig, T. J., Ishmael, F. T. The brown marmorated stinkbug as a new aeroallergen. The Journal of allergy and clinical immunology. 130 (4), 999-1001 (2012).
  6. McClean, A. P. D., Schwarz, R. E. Greening or blotchy-mottle disease of citrus. Phytophylactica. 2 (3), 177-194 (2012).
  7. Bové, J. M. Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
  8. Kuhar, T., Morrison, R., Leskey, T., Aigner, J. Integrated pest management for brown marmorated stink bug in vegetables. , (2016).
  9. Tiwari, S., Mann, R. S., Rogers, M. E., Stelinski, L. L. Insecticide resistance in field populations of Asian citrus psyllid in Florida. Pest management science. 67 (10), 1258-1268 (2011).
  10. Baum, J. A., Bogaert, T., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nature Biotechnology. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418 (6894), 244-251 (2002).
  12. Mello, C. C., Conte, D. Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
  13. Macrae, I. J., Zhou, K., et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science(New York, N.Y.). 311 (5758), 195-198 (2006).
  14. Bernstein, E., Caudy, A. A., Hammond, S. M., Hannon, G. J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409 (6818), 363-366 (2001).
  15. Ketting, R. F., Fischer, S. E., Bernstein, E., Sijen, T., Hannon, G. J., Plasterk, R. H. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes & development. 15 (20), 2654-2659 (2001).
  16. Agrawal, N., Dasaradhi, P. V. N., Mohmmed, A., Malhotra, P., Bhatnagar, R. K., Mukherjee, S. K. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 67 (4), 657-685 (2003).
  17. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., Lührmann, R., Tuschl, T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell. 110 (5), 563-574 (2002).
  18. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  19. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
  20. Clemens, J. C., Worby, C. A., et al. Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6499-6503 (2000).
  21. Saleh, M. C., van Rij, R. P., et al. The endocytic pathway mediates cell entry of dsRNA to induce RNAi silencing. Nature cell biology. 8 (8), 793-802 (2006).
  22. Amdam, G. V., Simões, Z. L. P., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC biotechnology. 3, 1 (2003).
  23. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (11), 824-832 (2009).
  24. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect Physiology. 56 (3), 227-235 (2010).
  25. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  26. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
  27. Gatehouse, H. S., Gatehouse, L. N., Malone, L. A. Amylase activity in honey bee hypopharyngeal glands reduced by RNA interference. Journal of Apicultural. , (2004).
  28. Jaubert-Possamai, S., Le Trionnaire, G., Bonhomme, J., Christophides, G. K., Rispe, C., Tagu, D. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC biotechnology. 7, 63 (2007).
  29. Martín, D., Maestro, O., Cruz, J., Mané-Padrós, D., Bellés, X. RNAi studies reveal a conserved role for RXR in molting in the cockroach Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 52 (4), 410-416 (2006).
  30. Bansal, R., Mittapelly, P., Chen, Y., Mamidala, P., Zhao, C., Michel, A. Quantitative RT-PCR Gene Evaluation and RNA Interference in the Brown Marmorated Stink Bug. PloS one. 11 (5), e0152730 (2016).
  31. Terenius, O., Papanicolaou, A., et al. RNA interference in Lepidoptera: an overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57 (2), 231-245 (2011).
  32. Sparks, M. E., Shelby, K. S., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Invasive Brown Marmorated Stink Bug, Halyomorpha halys (Stål) (Heteroptera: Pentatomidae). PloS one. 9 (11), e111646 (2014).
  33. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science (New York, N.Y.). 282 (5388), 430-431 (1998).
  34. Baum, J. A., Roberts, J. K. Chapter Five - Progress Towards RNAi-Mediated Insect Pest Management. Insect Midgut and Insecticidal Proteins. 47, 249-295 (2014).
  35. Walshe, D. P., Lehane, S. M., Lehane, M. J., Haines, L. R. Prolonged gene knockdown in the tsetse fly Glossina by feeding double stranded RNA. Insect Molecular Biology. 18 (1), 11-19 (2009).
  36. Turner, C. T., Davy, M. W., MacDiarmid, R. M., Plummer, K. M., Birch, N. P., Newcomb, R. D. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Molecular Biology. 15 (3), 383-391 (2006).
  37. Bautista, M. A. M., Miyata, T., Miura, K., Tanaka, T. RNA interference-mediated knockdown of a cytochrome P450, CYP6BG1, from the diamondback moth, Plutella xylostella, reduces larval resistance to permethrin. Insect biochemistry and molecular biology. 39 (1), 38-46 (2009).
  38. Maori, E., Paldi, N., et al. IAPV, a bee-affecting virus associated with Colony Collapse Disorder can be silenced by dsRNA ingestion. Insect Molecular Biology. 18 (1), 55-60 (2009).
  39. Hunter, W., Ellis, J., Hayes, J., Westervelt, D., Glick, E. Large-scale field application of RNAi technology reducing Israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathogens. 6 (12), e1001160 (2010).
  40. Christiaens, O., Smagghe, G. The challenge of RNAi-mediated control of hemipterans. Current Opinion in Insect Science. 6, 15-21 (2014).
  41. Hunter, W. B., Hail, D., Tipping, C., Paldi, N. RNA interference to reduce sharpshooters, the glassy-winged sharpshooter, and the Asian citrus psyllid. Symposium. , 24-27 (2010).
  42. Hunter, W. B., Glick, E., Paldi, N., Bextine, B. R. Advances in RNA interference: dsRNA treatment in trees and grapevines for insect pest suppression. Southwestern Entomologist. , (2012).
  43. Hail, D. A., Dowd, S., Hunter, W. H., Bextine, B. R. Investigating the transcriptome of the potato psyllid (Bactericera cockerelli): toward an RNAi based management strategy. Proceed. 10th Annual Zebra Chip Reporting Session, San Antonio TX, , 183-186 (2010).
  44. de Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNA Interference-Natural Gene-Based Technology for Highly Specific Pest Control (HiSPeC). RNA INTERFERENCE. , (2016).
  45. Taning, C. N. T., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian Citrus Psyllid RNAi Pathway - RNAi evidence. Scientific reports. 6, 38082 (2016).
  46. Andrade, E. C., Hunter, W. B. RNAi feeding bioassay: development of a non-transgenic approach to control Asian citrus psyllid and other hemipterans. Entomologia Experimentalis et Applicata. 162 (3), 389-396 (2017).
  47. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi Efficiency, Systemic Properties, and Novel Delivery Methods for Pest Insect Control: What We Know So Far. Frontiers in physiology. 7, 553 (2016).
  48. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Molecular Biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  49. Li-Byarlay, H., Li, Y., et al. RNA interference knockdown of DNA methyl-transferase 3 affects gene alternative splicing in the honey bee. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12750-12755 (2013).
  50. Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, Carbon Quantum Dot, and Silica Nanoparticle Mediated dsRNA Delivery for Gene Silencing in Aedes aegypti: A Comparative Analysis. ACS applied materials & interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
  51. Nimesh, S. Recent patents in siRNA delivery employing nanoparticles as delivery vectors. Recent patents on DNA & gene sequences. 6 (2), 91-97 (2012).
  52. Draz, M. S., Fang, B. A., et al. Nanoparticle-mediated systemic delivery of siRNA for treatment of cancers and viral infections. Theranostics. 4 (9), 872-892 (2014).
  53. Swevers, L., Raikhel, A. S., Sappington, T. W. Vitellogenesis and post-vitellogenic maturation of the insect ovarian follicle. Comprehensive. , (2005).
  54. Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
  55. Hagedorn, H. H., Kunkel, J. G. Vitellogenin and vitellin in insects. Annual review of entomology. , (1979).
  56. Brandt, B. W., Zwaan, B. J., Beekman, M. Shuttling between species for pathways of lifespan regulation: a central role for the vitellogenin gene family? Bioessays. , (2005).
  57. Murphy, C. T., McCarroll, S. A., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  58. Shinoda, T., Itoyama, K. Juvenile hormone acid methyltransferase: a key regulatory enzyme for insect metamorphosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 11986-11991 (2003).
  59. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual review of entomology. 55, 111-128 (2010).
  60. Nouzova, M., Edwards, M. J., Mayoral, J. G., Noriega, F. G. A coordinated expression of biosynthetic enzymes controls the flux of juvenile hormone precursors in the corpora allata of mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 41 (9), 660-669 (2011).
  61. Huang, J., Marchal, E., Hult, E. F., Tobe, S. S. Characterization of the juvenile hormone pathway in the viviparous cockroach, Diploptera punctata. PloS one. 10 (2), e0117291 (2015).
  62. Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA delivery system for plant-sap-feeding insects. PloS one. 12 (2), e0171861 (2017).
  63. Khrimian, A., Zhang, A., et al. Discovery of the aggregation pheromone of the brown marmorated stink bug (Halyomorpha halys) through the creation of stereoisomeric libraries of 1-bisabolen-3-ols. Journal of natural products. 77 (7), 1708-1717 (2014).
  64. Hall, D. G., Richardson, M. L., El-Desouky, A., Halbert, S. E. Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, vector of citrus huanglongbing disease. Entomologia Experimentalis et Applicata. 146 (2), 207-223 (2012).
  65. Murphy, K. A., Tabuloc, C. A., Cervantes, K. R., Chiu, J. C. Ingestion of genetically modified yeast symbiont reduces fitness of an insect pest via RNA interference. Scientific reports. 6, 22587 (2016).
  66. San Miguel,, K,, Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest management science. 72 (4), 801-809 (2016).
  67. Li, H., Guan, R., Guo, H., Miao, X. New insights into an RNAi approach for plant defence against piercing-sucking and stem-borer insect pests. Plant, cell & environment. 38 (11), 2277-2285 (2015).
  68. Hull, D., Timmons, L. Methods for delivery of double-stranded RNA into Caenorhabditis elegans. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 265, 23-58 (2004).
  69. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  70. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: future in insect management. Journal of Invertebrate Pathology. 112 Suppl, S68-S74 (2013).
  71. Rodrigues, T. B., Figueira, A. Management of Insect Pest by RNAi-A New Tool for Crop Protection. , (2016).
  72. Baumann, A. M. T., Bakkers, M. J. G., et al. 9-O-Acetylation of sialic acids is catalysed by CASD1 via a covalent acetyl-enzyme intermediate. Nature communications. 6, 7673 (2015).
  73. Araujo, R. N., Santos, A., Pinto, F. S., Gontijo, N. F., Lehane, M. J., Pereira, M. H. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect biochemistry and molecular biology. 36 (9), 683-693 (2006).
  74. Wuriyanghan, H., Rosa, C., Falk, B. W. Oral Delivery of Double-Stranded RNAs and siRNAs Induces RNAi Effects in the Potato/Tomato Psyllid, Bactericerca cockerelli. PloS one. 6 (11), e27736 (2011).
  75. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods (San Diego, Calif). 30 (4), 313-321 (2003).
  76. Yu, N., Christiaens, O., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions). Insect Science. , (2012).
  77. Allen, M. L., Walker, W. B. Saliva of Lygus lineolaris digests double stranded ribonucleic acids. Journal of Insect Physiology. 58 (3), 391-396 (2012).
  78. Wynant, N., Santos, D., Verdonck, R., Spit, J., Van Wielendaele, P., Vanden Broeck, J. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect biochemistry and molecular biology. 46, 1-8 (2014).
  79. Ghosh, S. K. B., Gundersen-Rindal, D. E. Double strand RNA-mediated RNA interference through feeding in larval gypsy moth, Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). European Journal of Entomology. 114, 170-178 (2017).
  80. Baigude, H., Rana, T. M. Delivery of therapeutic RNAi by nanovehicles. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 10 (15), 2449-2454 (2009).
  81. Mitter, N., Worrall, E. A., et al. Clay nanosheets for topical delivery of RNAi for sustained protection against plant viruses. Nature plants. 3, 16207 (2017).
  82. Dubelman, S., Fischer, J., et al. Environmental fate of double-stranded RNA in agricultural soils. PloS one. 9 (3), e93155 (2014).
  83. Kola, V. S. R., Renuka, P., Madhav, M. S., Mangrauthia, S. K. Key enzymes and proteins of crop insects as candidate for RNAi based gene silencing. Frontiers in physiology. 6, 119 (2015).

Tags

Miljøfag problemet 135 levering brune marmorated stinker bug asiatisk sitrus psyllid RNA-interferens svelging Nebbmunner
Double-strandet RNA Oral leveringsmåter å indusere RNA-interferens i Phloem og anlegg-sap-fôring Hemipteran insekter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B.,… More

Ghosh, S. K. B., Hunter, W. B., Park, A. L., Gundersen-Rindal, D. E. Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects. J. Vis. Exp. (135), e57390, doi:10.3791/57390 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter