Summary
ويصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة للحصول على تجلط وريدي باستخدام نموذج ركود. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم أسلوب غير الغازية لقياس تكوين خثرة والقرار على مر الزمن.
Abstract
تجلط وريدي حالة شائعة تؤثر على 1-2% السكان، مع الإصابة سنوية 1 في 500. تجلط وريدي يمكن أن يؤدي إلى الوفاة عن طريق الانسداد الرئوي أو النتائج في متلازمة ما بعد الخثاريه، تتميز بالألم المزمن في الساق وتورم وتقرح، أو ارتفاع ضغط الدم الرئوي المزمن الناتج في كبيرة المزمن الرئوي الحل الوسط. هذا هو أكثر الأمراض القلبية الوعائية بعد احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية، وهو تحد سريرية لجميع التخصصات الطبية، كما أنها تؤدي إلى تعقيد مسار اضطرابات أخرى مثل السرطان والأمراض الجهازية، والجراحة، والصدمة الكبرى.
نماذج تجريبية ضرورية لدراسة هذه الآليات. نموذج ركود الحث على حجم خثرة متسقة وكمية قابلة للقياس الكمي من خثرة. ومع ذلك، من الضروري سد الفروع الجانبية الأجوف فينا أدنى لتجنب التقلبات في أحجام خثرة وأي تفسير بيانات خاطئة بشكل منهجي. قمنا بتطوير تقنية غير الغازية لقياس حجم خثرة باستخدام الموجات فوق الصوتية. باستخدام هذا الأسلوب، يمكننا تقييم التنمية خثرة والقرار مع مرور الوقت في نفس الحيوان. يحد هذا النهج عدد الفئران المطلوبة للتحديد الكمي ليتمشى مع مبدأ الاستبدال، والحد، وصقل للحيوانات في البحوث تجلط وريدي. لقد أظهرنا أن الحصول على الوزن خثرة والتحليل النسيجي لربط حجم خثرة بالقياس بالموجات فوق الصوتية. ولذلك، توضح الدراسة الحالية للحث على تجلط الوريد العميق في الفئران باستخدام نموذج ركود أدنى الوريد الأجوف وكيفية رصد استخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد.
Introduction
الجلطات الوريدية (إعطاؤهم)، التي تتألف من تجلط وريدي عميق (DVT)، والانسداد الرئوي، هو السبب الرئيسي الثالث للوفاة القلبية الوعائية بعد احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية. أنها حالة شائعة تؤثر على 1-2% السكان، مع الإصابة سنوية 1 في 5001. إعطاؤهم يمكن أن يؤدي إلى: 1) الموت عن طريق الانسداد الرئوي؛ 2) متلازمة بعد انتهاء الخثاريه، تتميز بالألم المزمن في الساق وتورم وتقرح؛ أو 3) ارتفاع ضغط الدم الرئوي المزمن أدى كبير وسط الجهاز التنفسي المزمنة. إعطاؤهم هو مرض متعدد العوامل، وقد ينتج عن ركود تدفق الدم، تلف جدران الأوعية، و/أو الدول هايبركواجولابل بسبب حدوث اضطراب في التوازن بين النظم فيبرينوليتيك، وتخثر الدم كما قد وصفت قبل ما يزيد على مائة عام من سندربربيركورس ويعرف باسم الثالوث سندربربيركورس.
لأنه في معظم الحالات من المستحيل الحصول على العينات دفت البشرية، قد طور الباحثون نماذج حيوانية تجريبية من دفت. وقد استخدمت العديد من الحيوانات بما فيها الجرذان2والماوس3، الأرانب4، خنزير5، الكلب6والرئيسيات غير البشرية7 . ويمكن أن يكون محوره وراثيا الفئران الحيوان الأكثر استخداماً لدراسة دفت. ومع ذلك، كما هو الحال في جميع الحيوانات، لا يلاحظ دفت عفوية في الفئران. وهكذا، تستخدم التغيرات الفيزيائية أو الكيميائية لجدار الوريد لخلق تجلط الدم في الفئران. وقد استخدمنا نموذج كلوريد الحديد سابقا للحث على تجلط الدم في الأجوف فينا أدنى (IVC) من الفئران8،،من910. هذا النموذج يتميز بإنتاج موثوق الجلطات الانسداد في غضون دقائق ويمكن استخدامها للتحقيق في دور الأدوية المضادة الصفيحات والمضادة تخثر خلال دفت الحاد. ومع ذلك، وإجراء المحطة طرفية. وهكذا، لدراسة دفت الحادة والمزمنة، يعتبر هذا النموذج ركود أكثر ملاءمة. في هذا النموذج، يتم تكوين خثرة الناجمة عن انقطاع تدفق الدم في IVC، أحد العوامل في ثالوث سندربربيركورس للتنمية دفت كاملة. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة تشكيل دفت والقرار، الذي ميزة مقارنة ب النموذج3 فيكل11.
قمنا بتطوير أسلوب غير الغازية لمتابعة تكوين خثرة والقرار على مر الزمن باستخدام نظام مايكرو-التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية التردد12. قد أثبتنا سابقا أن قياس تجلط وريدي بالموجات فوق الصوتية يرتبط ارتباطاً إيجابيا بالجلطات حصل مرضية. وقد أكدنا في اثنين من الدراسات اللاحقة أن القياسات التي تم الحصول عليها مع ربط الموجات فوق الصوتية مع الوزن خثرة ومنطقة خثرة كمياً قبل9،هيستوتشيميستري10. الأهم من ذلك، لقد أظهرنا أن الموجات فوق الصوتية عالية التردد يمكن استخدامها لرصد تشكيل تجلط وريدي عميق في12من الفئران. قد تستعمل أيضا لتحديد القرار خثرة بطريقة غير الغازية.
هنا، ونحن سوف تصف البروتوكول الذي يسمح تكوين خثرة باستخدام نموذج الماوس تجلط الدم الناجم عن ركود، وكيف يمكن رصد تكوين خثرة غير إينفاسيفيلي مع مرور الوقت باستخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافق جميع إجراءات كندا "الحيوان رعاية اللجنة ماكغيل جامعة مونتريال"، ومراقبة الجودة، المؤسسية. يتم سرد كافة المعدات المطلوبة في الجدول أنا.
1-الفاري (C57BL/6J) IVC ركود البروتوكول
- إعداد عملية جراحية
ملاحظة: هذا عملية جراحية في البقاء على قيد الحياة وذلك الأسلوب العقيم السليم يحتاج إلى أن يتبع في جميع الأوقات. وهذا يشمل التأكد من أن جميع المواد التي في متناول اليد، وتنظيف وتعقيم الأدوات قبل وبين استخدام، وتعيين منطقة معقمة على سطح العمل لجميع المواد المعقمة.- تعقيم كل الأدوات الجراحية والمواد عن طريق اﻷوتوكﻻف. معقم حبة زجاج غير كافية لتعقيم نصائح صك بين الحيوانات، إذا كان يتم إجراء واحد أو أكثر في وقت واحد.
- تخدير الأسبوع 8-10 القديمة C57Bl/6 ذكور الفئران بمزيج إيسوفلوراني الأكسجين ونسبة 2.5% 100%.
ملاحظة: ضبط تدفق الأكسجين و isoflurane حسب الضرورة. - تأكيد أنيسثيتيزيشن معسر مخلب خلفي للحيوان بين أصابع القدم بالملقط. لا توجد استجابة من رشة يشير إلى تم تخديره من الحيوان.
- إدارة بطء الإفراج عن مسكن (البوبرينورفين) عن طريق الحقن تحت الجلد. إعطاء الفئران بجرعة 1 ملغ مسكن كل 1 كغم من وزن الجسم (1 مغ/كغ).
- ضع مرهم العين في كلتا العينين للحيوان لضمان لا جفاف القرنية طوال مدة الإجراء.
- إدارة 0.2-0.5 مل سوائل متساوي التوتر كل 10 غم وزن الجسم تحت الجلد.
- إصلاح الحيوان في المكان إلى طاولة الجراحة باستخدام الشريط الجراحي. وضع الحيوان في موقف ضعيف لفضح البطن. إجراء عمليات جراحية على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- إزالة الشعر من بطن الماوس بالتطبيق لإزالة الشعر كريم لمسح منطقة البطن نظيفة مع شاش والمقطر المياه، كحد أدنى 1-2 إذا لزم الأمر.
- وبدلاً من ذلك، إزالة الشعر من البطن بالحلاقة بشفرة حلاقة الكهربائية صغيرة.
- تعقيم البطن مع باكسالدين (محلول الكلورهيكسيدين غلوكونات BP) قبل أي شقوق. تطبيق الإيثانول طفيفة مع الشاش لتجنب فقدان الحرارة المفرطة الناجمة عن تبخر الكحول.
- التعرض الأجوف فينا أدنى (IVC)
- نفذ باستخدام مقص جراحي فتح البطن لفتح تجويف البطن.
- رفع الجلد مع الملقط في أسفل البطن وجعل شق عمودي مواز لجانبي ينيا ألبا. جعل الشق الأول إلى اليسار أو اليمين ينيا ألبا، اعتماداً على استخدام إحدى اليدين للمشغل. يتم إجراء شق بعيداً عن خط الوسط لمساعدة في التصوير بالموجات فوق الصوتية في وقت لاحق.
- إجراء شق أفقي، والثانية في الجزء العلوي من البطن.
ملاحظة: عند اختراق البطن، العضلات ينبغي "تينتيد" وثم اخترقت مع المقص الجراحي لمنع أي ضرر لأعضاء البطن. - كرر شقوق رأسية وأفقية في طبقة العضلات البطن للحيوان. من المؤكد أن خيمة العضلات أثناء اقتحام البطن حتى لا يؤدي إلى تلف الأجهزة تحت.
تنبيه: أرفع الجلد والعضلات بعيداً عن الأمعاء وغيرها من الأجهزة الداخلية عند شقوق حتى لا يتعرض للثقب لهم.
- أمثال في الجلد والعضلات بعيداً عن شق لفضح تجويف البطن.
- تطبيق شاش، مبلل بمحلول متساوي التوتر، إلى الجانبين لفتح الجرح وتخريج الأمعاء. تطبيق الضغط على كلا الجانبين من البطن لمساعدة تخريج الأمعاء. استخدام حركات لطيف مع قضيب نصيحة القطن لتحريك الأمعاء. نقع شاش في محلول متساوي التوتر ووضعه على الأمعاء الخارجية.
- ينبغي أن يكون الشاش مبلل مسبقاً قبل التنسيب في الأنسجة.
- نقل جانبا أي الدهون البريتوني، وفضح IVC بين الأوردة الكلوية وحرقفي.
- قم بتحديد أولى لفروع جانبية واضحة. فرع جانب ستظهر أصغر، ولكن المنطلق كبيرة فروع بعيداً عن IVC، بين الكلي وحرقفي الأوردة. المفرج يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا بين الفئران. الفئران قد الفروع الجانبية هذا على واحد أو كلا الجانبين من IVC.
- نفذ باستخدام مقص جراحي فتح البطن لفتح تجويف البطن.
- ربط الفروع الجانبية
ملاحظة: في حالة وجود فروع جانبية، يتبع الإجراء التالي لكل واحد. إذا كان غير موجود، انتقل إلى الخطوة 4: الأولى خياطة وضعها تحت IVC. سوف يكون موقع ربط IVC القاصي فورا إلى الوريد الكلوي الأيسر، بغض النظر عن وجود فروع جانبية.- إجراء تشريح حادة على كل جانب من فرع الجانب. تشريح كليلة هو عملية فتح الملقط حادة مرارا وتكرارا مع ضغط لطيف، بغية اختراق اللفافة دون إلحاق الضرر بالسفن المحيطة بها.
تنبيه: تجنب ثقب أو إلحاق الضرر بها في الوريد. - رفع الفرع وتمرير مقطع من 6-0 خياطة الحرير تحت هذا السياق. دائماً تأخذ الرعاية عند رفع أو تحريك السفن. فمن الأفضل لانتزاع الدهون حول الأوعية، إلا يوجد خطر إلحاق الضرر بالسفينة.
- استخدام الملقط خياطة، تجعل من ربط جراحي حول فرع الجانب باستخدام عقده الجراحية القياسية ربط تقنية. ويتم ربط كامل لضمان 100 ٪ انسداد الوريد. استخدام رمية التلازم ثلاثة على الأقل لضمان عملية ربط آمنة.
- كرر الخطوة 1، 3 لأي فروع الجانب المتبقي.
- إجراء تشريح حادة على كل جانب من فرع الجانب. تشريح كليلة هو عملية فتح الملقط حادة مرارا وتكرارا مع ضغط لطيف، بغية اختراق اللفافة دون إلحاق الضرر بالسفن المحيطة بها.
- تسلخ الابهر البطني من IVC
- إجراء تشريح حادة حول IVC القاصي فورا من الوريد الكلوي الأيسر. الشريان الاورطي البطني موصولة إلى IVC اللفافة عبر، لذلك إجراء تشريح كليلة الأولية حول IVC والشريان الاورطي البطني.
تحذير: تجنب ثقب أو إتلاف الوريد. لا تمزق أو ثقب أما السفينة. هذا هو الجزء الأكثر أهمية من الإجراء، مع خطر أعلى لأضرار السفينة. - الاستمرار في تطبيق ضغط لطيف عن طريق تشريح كليلة حتى يتم إجراء نافذة واضحة بين الشريان الاورطي و IVC.
- إجراء تشريح حادة حول IVC القاصي فورا من الوريد الكلوي الأيسر. الشريان الاورطي البطني موصولة إلى IVC اللفافة عبر، لذلك إجراء تشريح كليلة الأولية حول IVC والشريان الاورطي البطني.
- وضع خياطة وربط IVC
- يمر قسم من 6-0 خياطة الحرير تحت IVC والشريان الاورطي البطني.
- تحديد موقع الخياطة من خلال النافذة التي تم إنشاؤها بين IVC والشريان الاورطي. استخدام الملقط لسحب الخياطة وخيط عليه بين الشريان الاورطي البطني و IVC. خيط الخياطة من خلال بعناية، لا تحاول سحب/ثقب IVC والشريان الاورطي البطني.
- جعل من ربط جراحي حولها IVC مع الملقط خياطة، ضمان إجمالي انسداد الوريد. مرة أخرى، جعل الربط القاصي فورا من الوريد الكلوي الأيسر.
- جعل خياطة ثلاث رميات لضمان عملية ربط.
ملاحظة: من الممكن أيضا لتمرير خياطة تحت IVC والشريان الاورطي قبل فصل الاثنين كخيار بديل. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام خيوط برلين 7-0 لربط الفروع الجانبية وفي IVC.
- إغلاق الجرح والرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
- تحقق من أن الشريان الاورطي البطني قد تركت دون انقطاع، وأن كل جانب الفروع قد تم متصلة. سوف تظهر IVC المتوسعة القاصي من موقع ربط ولا للدم من التدفق ستكون مرئية.
- ضع جميع الدهون البريتوني والأمعاء في تجويف البطن.
- إغلاق الجرح باستخدام الملقط خياطة وخياطة الحرير 6-0. استخدام خياطة قيد تشغيل (بسيطة المستمر) وضمان أن خياطة الجروح لن تكون ضيقة جداً. وسوف تمزق خياطة ضيق عند الحيوان يستيقظ ويسير بالقرب من قفصة.
- بدلاً من ذلك، استخدام مقاطع PDS، اثيلون، فيكريل، ديكسون، أو الفولاذ المقاوم للصدأ لإغلاق الجرح.
- خياطة على طبقة العضلات البطن أولاً استخدام خياطة مناسبة ربط تقنية.
- كرر التقنية خياطة للجلد وتأكد من إغلاق الجرح كافية.
ملاحظة: إذا كان استخدام نفس إبرة خياطة وخيط للحيوانات متعددة، تعقيم في الإيثانول 70% قبل كل استخدام على حد سواء. - إزالة الحيوان من غاز مخدر ووضعها في حاضنة 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- ومرة أخرى، إدارة 0.2-0.5 مل سوائل متساوي التوتر كل 10 غم وزن الجسم تحت الجلد. يمكن إعطاء السوائل في الأيام التالية للحفاظ على وزن الجسم قبل العملية، إذا لزم الأمر.
- رصد هذا الحيوان حتى الشفاء لضمان نجاح عملية جراحية وتقييم الصحة العامة للحيوان.
تنبيه: تتوقع موقفا متحدب طفيف لإجراء الغازية مثل هذا، ولكن سوف تتصرف الحيوانات عادة في أقرب وقت 30 دقيقة بعد انتهاء العملية. - وضع الحيوان في القفص الخاص به وعدم وضعه مع الحيوانات الأخرى حتى شُفي تماما.
- إعادة إدارة مسكن يوميا ليصل إلى 48 بوستوب ح.
- مكان الغذاء على أرضية القفص لحين الحيوان في الانتعاش. عموما ليست هناك حاجة الرعاية الخاصة الأخرى.
- بحث في موقع الجرح لاحمرار وتورم، أو التصريف وأي علامات أخرى للعدوى.
- إذا لزم الأمر، قم بإزالة خيوط بعد 7-10 أيام.
- تنفيذ القتل الرحيم فورا إذا لم تنجح عملية جراحية (مثلاً، سفينة كبيرة الأضرار و/أو الدم خسارة) أو الحيوان لا يحسن مع الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية. عموما يتم تنفيذ القتل الرحيم في بوستوب ح 48. لتجارب أطول، استخدم برلين 7-0 لسد الفروع الجانبية وفي IVC وخيوط فيكريل 5-0 لإغلاق تجويف البطن.
- تنفيذ القتل الرحيم أنيسثيتيزيشن للحيوان في الاستقراء كما هو موضح سابقا، ما عدا في إيسوفلوراني 5%. ويعقب هذا خنقاً مع 100% CO2 بينما تخديره.
- بعد تأكيد للقتل الرحيم بالخنق (فقدان نبضات القلب والتنفس لا)، أداء التفكك عنق الرحم التأكد من اكتمال القتل الرحيم.
2. البروتوكول بالموجات فوق الصوتية عالية التردد
ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من سيدة ديفيس معهد مكافحة القوارض Phenotyping الأساسية SOP للتصوير بالموجات فوق الصوتية عالية التردد. هذا البروتوكول ينفذ المنطوق بعد 24 ساعة، ولكن يمكن أن يتم عاجلاً طالما الحيوان ويستجيب جيدا للجراحة. البروتوكول يمكن أن تنفذ في أي وقت على الفئران صحية، وغالباً ما يتم ذلك مقارنة قبل وبعد الجراحة.
-
إعداد الحيوانات
- وضع الحيوان في دائرة للحث وتخدير الحيوان بمزيج إيسوفلوراني الأكسجين ونسبة 2.5% 100%.
- قم بتشغيل مراقبة درجة الحرارة ومعدل ضربات القلب. موقف مصباح الحرارة فوق الجدول الدفء الحيوان أثناء الإجراء.
- إزالة الحيوان من قاعة التعريفي، وتطبيق مواد التشحيم العين لمنع جفاف القرنية. ضع الحيوان على منصة التحليل وإلصاق أنبوب مخدر للفم/الآنف الحيوان.
- هلام إلى 37 درجة مئوية الحارة بالموجات فوق الصوتية ووضع الجل على البطن للحيوان. هو استعد هلام الموجات فوق الصوتية باستخدام نظام تسخين المياه أن مضخات المياه عن طريق الأنابيب التي يتم التفاف حول زجاجة جل الدافئة.
- لقياس معدل ضربات القلب (إذا لزم الأمر)، وضع جل قطب الأقطاب 4 منهاج تحليل وإصلاح آثار أقدام الحيوان إلى المنصة/كهربائي مع الشريط الجراحي. ضع الحيوان في موقف ضعيف للتصوير IVC. ويشمل نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية منصة تحليل التي يتم تسخينها وتحتوي على أقطاب كهربائية لرصد هذا الحيوان.
- لقياسات درجات الحرارة، وضع جل القطب على الحرارة وإدراج في المستقيم للحيوان.
- ضبط الحرارة مصباح و isoflurane حسب الضرورة لضمان هذا الحيوان مريحة، وقد تنفس بين 30-70 نبضة في الدقيقة، ويتم الاحتفاظ عند 37 درجة مئوية.
- إذا لزم الأمر، يحلق البطن للحيوان أو إزالة الشعر مع كريم لإزالة الشعر. تطبيق لمدة 1-2 دقيقة ويمسح نظيفة بالماء المقطر وشاش.
ملاحظة: الكثير الشعر يمكن أن يؤثر على نوعية الصور. - ضع شاش تحت أو إلى الجانب من الحيوان لالتقاط أي جل الزائدة بالموجات فوق الصوتية.
-
التصوير IVC وخثره
- قم بتشغيل برامج التصوير والبدء في دراسة جديدة.
- حدد سكانهيد مناسبة للتصوير. سكانهيد المستخدم هنا للبطن الأجهزة (التردد: 35 ميغاهرتز، البعد البؤري: 12.8 مم).
- تسجيل أي معلومات ذات صلة عن الحيوان. وقد يشمل هذا الحيوان معرف، الجنس، الوزن، وتاريخ الميلاد، والسلالة، إلخ.
- أقل سكانهيد استمرار حتى أنه لمس الجل الموجات فوق الصوتية على الحيوان.
- بدء التحقيق سكانهيد للبدء في تصوير ثنائي الأبعاد للحيوان. في هذا الوضع، يتم عرض الصور كاثنين من الأبعاد، في ظلال مختلفة من الرمادي.
- تحديد موقع IVC والشريان الاورطي البطني عن طريق تحريك منصة الماوس في جميع أنحاء العاشر--و/أو y-الطائرة، بينما تتحرك أيضا سكانهيد من خلال z-الطائرة.
ملاحظة: الدم السفن سوف تظهر على الجدران البيضاء والدم داخل تقريبا أسود. الشريان الاورطي البطني سوف خفق مكثف والجدران أكثر سمكا، بينما سيكون IVC الجدران أرق وضغط/توسيع بسهولة على الصورة الشاشة عندما يتم نقل سكانهيد وإلى أسفل. ربط الموقع سيكون واضحا، كما سوف تكون متسعة في الاتجاه وسوف يأتي جدار الوريد إلى نقطة. أي خثرة شكلت داخل سوف تكون صلبة تحت التصوير بالموجات فوق الصوتية، وسوف لا ضغط بسهولة مثل جدار الوريد لا. وسوف ضغط على المنوال فقط فوق الربط، حيث يتم تشكيل لا خثرة. - عند تحديد موقع IVC والموقع، وربط مركز لهم في الوصل للموجات فوق الصوتية، بغية تحقيق الصورة الأكثر دقة.
- إذا كانت الصورة مظلمة للغاية رؤية واضحة، وضبط الهلام إزالة أي فقاعات الهواء مع قضيب نصيحة القطن.
- إذا لزم الأمر، إمالة سكانهيد 45 درجة إلى اليمين أو اليسار، وتكييف المنهاج الحيوان رؤية الوريد بوضوح. ويتم هذا إذا لم يكن هناك تدخل سكانهيد. في هذا السيناريو، يلزم على المنوال تصويرها بزاوية جانبية لتجنب خياطة الجروح.
ملاحظة: تدخل الصورة في أغلب الأحيان ناجم عن بقع داكنة من الجلد على الحيوان، وموضع خياطة الجرح الفقراء، أو فقاعات في جل الموجات فوق الصوتية.
- باستخدام البرمجيات، التقاط صور لأي هياكل المطلوب وإجراء القياسات باستخدام أي من أدوات القياس. وتشمل القياسات الشائعة مساحة مقطعية لخثرة أو عرض موقع ربط.
- تغيير وضع التصوير إلى دوبلر موجه النبض إجراء قياسات تدفق الدم. هذا الوضع يسمح تصوير تدفق الدم والأوعية الدموية وقياس سرعة تدفق، من بين متغيرات أخرى.
- إمالة، منصة التحليل إلى انخفاض نهاية الخلفية للحيوان.
- تغيير الزاوية/موقف سكانهيد حيث أنه سيتصل هلام بزاوية مقدارها حوالي 30° من الطرف الخلفي من الحيوان.
- تغيير موضع منصة الحيوان وسكانهيد. نقل IVC وربط إذا لزم الأمر.
- إجراء قياسات تدفق الدم المحيطة بموقع ربط للتأكد من ركود واتخاذ أي صور المطلوب. وتشمل القياسات الشائعة لتدفق الدم متوسط السرعة، السرعة القصوى، أو متوسط السرعة.
- حفظ أية قياسات أو الصور الملتقطة.
-
استرداد تنظيف والحيوان
- وتثير سكانهياد الأولى الموقف وتغيير موضعه منصة الحيوان بموقفها المبدئي، كذلك.
- إزالة جل الزائدة قبالة الحيوان مع شاش. القيام بذلك بلطف حيث أنه سوف لا يكون تمزق خياطة الجرح.
- إزالة الحرارة من المستقيم للحيوان والحيوان خارج المنهاج.
- وضع الحيوان في قفصة وحاضنة 34 درجة مئوية.
- رصد هذا الحيوان حتى الشفاء. الإجراء طفيفة جداً وغير الغازية. وسوف تستيقظ الحيوان بسرعة. مواصلة رصد الحيوان في الأيام التالية وفقا للفرع 1، 6 من هذا البروتوكول.
- تنظيف الأساسي الحيوان مع شاش ومطهر.
- مسح سكانهيد نظيفة بالماء المقطر وشاش.
تنبيه: تنظيف سكانهيد بلطف جداً و فقط مع الماء المقطر. - كرر الخطوة 2 للحيوان القادم.
- إذا كان ذلك مع جميع المواضيع، تحقق من أنه تم حفظ جميع الصور والتسجيلات. ثم إيقاف تشغيل جميع المعدات والبرمجيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نموذج تجلط وريدي ركود
في النموذج، وركود تم تخديره من الفئران، وشق لفضح الأجوف فينا أدنى (IVC). يتم إجراء الشق الجانب الأيمن أو الأيسر للماوس بدلاً من فتح خط الوسط البطن بطريقة لن يتدخل في التحقيق بالموجات فوق الصوتية. عضلات البطن والجلد إضعاف مرة أخرى لفضح IVC (الشكل 1). أولاً، هي متصلة الفروع الجانبية مع خياطة حرير 6-0 (الشكل 2). ثم، IVC مفصولة من الشريان الاورطي تشريح كليلة ويتم وضع الحرير حول IVC (الشكل 3 ألف-ج). IVC هو متصلة مع خياطة حرير 6-0. توسع IVC أسفل الموقع ربط مؤشرا على نجاح انقطاع تدفق الدم (3D الشكل). وأخيراً، يتم خياطة التجويف الصفاقى والجلد مرة أخرى بشكل مستمر (رقم 3E).
رصد لتكوين خثرة باستخدام الموجات فوق الصوتية
كما أننا أظهرنا سابقا، يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد، الذي يستخدم عادة لتقييم تجلط وريدي في إعدادات السريرية، لقياس تكوين خثرة والقرار على مر الزمن في نموذج مورين تجريبية. فنحن نستخدم نظام تصوير الدقيقة عالية تردد12. قبل ربط، يمكن التعرف IVC في عرض طولية. بعد ربط الوريد، يمكن تصور نجاح الإجراء. يمكن استخدام وضع PW-دوبلر تحديد سرعة تدفق الدم قبل (34.8 mm/s) وبعد (5.6 ملم/s) الربط. سبب الجلطات أكثر كثافة من تدفق الدم، ويمكن أن نقدر خثرة شكلت داخل IVC استخدام الموجات فوق الصوتية، 24 ساعة بعد عملية ربط (الشكل 4 أ). تسمح الموجات فوق الصوتية للتحديد الكمي لسرعة تدفق الدم في الأوعية الدموية باستخدام لون دوبلر. كما هو موضح في الشكل 4 باء، يمكننا قياس التدفق في هذا السياق قبل عملية ربط ونقدر انقطاع التدفق بعد عملية ربط، عندما تتشكل خثرة. البيانات من عرضنا المختبر على حجم خثرة متوسط من 4.85 0.22 مم ±2 في 24 ساعة و 5.05 0.47 مم ±2 في 48 ساعة (يعني ± ووزارة شؤون المرأة).
رقم 1. نموذج ركود: الإجراء لفضح الأجوف فينا أدنى. (A) إزالة الشعر الفأرة من البطن باستخدام كريم لإزالة الشعر. (ب شق أول) اعتماد على الجانب الأيسر من البطن والثاني البطني واحد (ج) من اليسار إلى اليمين. (د) نظرة عقيمة رطب يستخدم اكستريورز الأمعاء وفضح الجانب فرع (SB) وأدنى الوريد الأجوف (IVC). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. نموذج ركود: الداخلي سد فرع الجانب. (أ) المعرض IVC وتنسيب SB. (ب) من الحرير خياطة تحت SB. (ج) ربط من لرف SB.: الوريد الكلوي الأيسر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. نموذج ركود: الداخلي سد الأجوف فينا أدنى. (أ-ب) تشريح غير حادة لفصل في IVC من الشريان الاورطي. (ج) وضع خياطة الحرير تحت IVC. (د) ربط IVC. ولوحظ توسع IVC. ) ﻫ (عضلات البطن والجلد مغلقة بشكل منفصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. رصد لتكوين خثرة باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية- (أ) ممثل بالموجات فوق الصوتية الصور قبل، بعد ذلك مباشرة و 24 ساعة بعد عملية ربط IVC. (ب) الصور ممثلين للدم تدفق السرعة يصور بلون دوبلر استخدام ألوان المعالجة. حجم النطاقات تدفق الدم مرمزة من اللون الأحمر إلى اللون الأصفر لتصوير عالية للتدفق المنخفض. ويرد غياب تدفق في الحيوانات الواصلة بغياب اللون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لتكوين خثرة وريدية ناجحة باستخدام نموذج ركود. التعريفي تجلط الوريد أكثر صعوبة في الفئران القديمة بسبب تراكم الدهون المحيطة أدنى الوريد الأجوف والشريان الاورطي. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون الفئران تمر بهذا الإجراء 8-10 أسابيع من العمر. وينبغي إيلاء عناية كبيرة لا للحث على الأضرار غشائي في IVC خلال التشريح كليلة وحرف مزدوج. وبالإضافة إلى ذلك، من الأهمية بمكان للحفاظ على الحيوانات في حاضنة 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل بعد الجراحة وإعادته إلى شركة الحيوانات الأخرى إلا بعد الشفاء التام. عندما يتم إجراء الجراحة بشكل صحيح، تتصرف الحيوانات ملحوظ جيدا خلال الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية. أنها تظهر لا آثار جانبية خطيرة مثل عرج أو شلل أو سلس البول. قد يحمل انخفاض الحركة وموقف قليلاً متحدب فورا بعد الجراحة، ولكن هذا لا يعتبر غالباً ما طالما مسكن فعال وإجراء عملية جراحية شكل صحيح.
نموذج ركود تنتج من خثرة كبيرة مع قياسات حجم استنساخه من الماوس واحد إلى آخر. كما هو الحال في البشر، وتشريح النظام الوريدي يختلف بين الفئران وعولجت مسألة انقطاع فرع IVC مؤخرا في التضيق ونماذج ركود دفت13،14. أظهر برانت et al. أن منع تكوين خثرة الناجمة عن تقييد تدفق عند الفروع الجانبية كانت موجودة في < 1.5 ملم موقع ربط IVC. ومع ذلك، لا تتأثر تشكيل دفت الناجمة عن تقييد تدفق في الفئران الجانب فرع ربط13،،من1516. كما أفيد بأن تباين IVC جانب فروع في سلالة الماوس C57Bl6 تأثيراً هاما على تكوين خثرة الناجمة عن ربط كاملة IVC14. ووجد أن لا ligating الجانب الفروع النتائج في حجم جلطة إحصائيا أصغر مقارنة بعناصر التحكم مع فروع جانبية الواصلة. دراستنا تشير أيضا إلى ربط ذلك بالجانب فروع إنتاج خثرة يتسق تشكيل وحجم. بيد أن التباين التشريحية الأكثر تواترا في C57Bl/6 وجود 2 مرة أخرى فروع (98% الفئران)14. وثبت أن مقاطعة فروع يعود له أكبر الأثر على حجم خثرة. أن المنهجية الحالية لم تعالج تأثير فروع مرة أخرى، التي يمكن أن توقف استخدام قلم الكي14درجة حرارة منخفضة. ومع ذلك، أثبتنا أن ربط IVC والجانب أدت إلى فروع في تكوين خثرة متسقة في C57Bl/6. أخيرا، وكما أظهرنا سابقا، نظام الموجات فوق الصوتية عالية التردد يسمح للقياس الدقيق لحجم خثرة ويمكن استخدامها في الدراسات طويلة الأجل ومتعدية لتكوين خثرة والقرار12،13 ،15.
عيب رئيسي واحد من طراز ركود هو عرقلة تدفق الدم، مما يقلل من أثر العوامل التي تدار عن طريق الوريد القصوى على الجدار خثرة والسياق الكامل. وهذا يصبح قضية هامة عندما يريد أحد أن اختبار تأثير عامل الدوائي. إذا كان تأثير مخدر معين واحد يحتاج إلى اختبار، واحد يفضل استخدام نموذج تضيق13 أو نموذج الالكتروليتى17. كلا النموذجين تنتج الجلطات حضور تدفق الدم المستمر، التي تسمح لاختبار العوامل المضادة تخثر الجديدة دفت الوقاية والعلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بمنحه من القلب ومؤسسة كندا السكتة الدماغية، و "موريس" و "مؤسسة عائلة فاينمان بيلا". المؤلف يود أن يشكر "ميشو فيرونيك" لها المساعدة التقنية مع نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية VEVO770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 perma-hand silk suture | Ethicon | 706G | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| blunt forceps (straight and curved) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria Spring Scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1ml syringes | BD Biosciences | ||
| 26G needles | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | No longer sold | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Given to LDI by Vet | |
| Surgery Microscope | Leica | Leica M651 | |
| Systan eye oinment | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2x2 sterile Gauze | CDMV | #104148 | |
| Cotton Tip Applicators | from JGH | ||
| Transpore hypoallergenic surgical tape | CDMV | #7411 | |
| Ultrasound gel (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Incubator | From JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment | Dispomed | ||
| Hair remover | Nair | ||
| Water heated hard pad | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar heater water pump TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Infra-red heating lamp | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Mouse rectal temperature prope | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterile water | From JGH |
References
- Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).
- McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).
- Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).
- Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).
- Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).
- Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).
- Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121 (4), 692-699 (2013).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127 (6), 769-777 (2016).
- Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. , (2016).
- Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).
- Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).
