Summary
Dit protocol beschrijft de stappen voor het verkrijgen van veneuze trombose met behulp van een stase-model. Daarnaast zijn we met behulp van een niet-invasieve methode voor het meten van de vorming van trombose en resolutie na verloop van tijd.
Abstract
Veneuze trombose is een veel voorkomende aandoening treft 1-2 procent van de bevolking, met een jaarlijkse incidentie van 1 in 500. Veneuze trombose kan leiden tot de dood door middel van longembolie of resultaten in het post-trombotische syndroom, gekenmerkt door chronische beenpijn, zwelling en ulceratie, of in chronische pulmonale hypertensie resulteert in aanzienlijke chronische respiratoire compromis. Dit is de meest voorkomende hart-en vaatziekten na myocardinfarct en ischemische beroerte en een klinische uitdaging voor alle medische disciplines, zoals het het verloop van andere aandoeningen zoals kanker, systemische ziekten, chirurgie en belangrijk trauma kan bemoeilijken.
Experimentele modellen zijn nodig om deze mechanismen te bestuderen. De stase model induceert consistente trombose grootte en een meetbare hoeveelheid trombose. Het is echter moet systematisch afbinden kant takken van de vena cava inferior variabiliteit in maten van de trombose en eventuele foutieve interpretatie te voorkomen. Wij hebben een niet-invasieve techniek voor het meten van trombose grootte met behulp van Ultrasonografie ontwikkeld. Met behulp van deze techniek kunnen we trombose ontwikkeling en resolutie beoordelen na verloop van tijd in hetzelfde dier. Deze benadering beperkt het aantal muizen die nodig zijn voor de kwantificering van veneuze trombose overeenstemming met het beginsel van vervanging, vermindering en verfijning van dieren in het onderzoek. We hebben aangetoond dat trombose gewicht en histologische analyse van trombose grootte correlaat met meting met Ultrasonografie verkregen. Daarom beschrijft de huidige studie hoe voor het opwekken van diep-veneuze trombose in muizen met behulp van de vena cava inferior stase model en hoe om te controleren met behulp van hoge frequentie echografie.
Introduction
Veneuze thromboembolism (VTE), die uit diepe veneuze trombose (DVT) en longembolie bestaat, is de derde belangrijkste oorzaak van cardiovasculaire dood na een hartinfarct en beroerte. Het is een veel voorkomende aandoening treft 1-2 procent van de bevolking, met een jaarlijkse incidentie van 1 in 5001. VTE kan leiden tot: 1) dood door longembolie; 2) post-trombotische syndroom, gekenmerkt door chronische beenpijn, zwelling en ulceratie; of 3) chronische pulmonale hypertensie resulteert in aanzienlijke chronische respiratoire compromis. VTE is een multi factoriële ziekte en kan voortvloeien uit stase van de bloedstroom, schade aan wanden en/of hypercoagulable Staten als gevolg van een verstoring van het evenwicht tussen de stolling en de fibrinolytic systemen, zoals het is meer dan honderd jaar geleden beschreven door Virchow en staat bekend als de Virchow van triade.
Omdat in de meeste gevallen het onmogelijk is om menselijke DVT monsters krijgen, hebben de onderzoekers experimentele dierlijke modellen van DVT ontwikkeld. Verschillende dieren waaronder rat2, muis3, konijn4, varken5, hond6en7 van de niet-menselijke primaten hebben ingezet. Muizen genetisch kunnen worden gewijzigd en zijn de meest gebruikte dier te bestuderen van DVT. Echter zoals alle dieren, wordt spontane DVT niet waargenomen bij muizen. Dus, fysische of chemische veranderingen van de wand van de ader worden gebruikt voor het maken van trombose bij muizen. Eerder hebben we de ferrichloride model gebruikt voor het opwekken van trombose in de vena cava inferior (IVC) van muizen8,9,10. Dit model heeft het voordeel dat het betrouwbaar produceren occlusieve stolseltjes binnen minuten en kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van anti-coagulans en anti-bloedplaatjes geneesmiddelen tijdens acute DVT. Het is echter een terminal procedure. Dus, om te bestuderen van acute en chronische DVT, de stase-model is meer geschikt. In dit model wordt trombus vorming geïnduceerd door de volledige onderbreking van de bloedstroom in het IVC, een van de factoren in de Virchow triade voor DVT ontwikkeling. Dit model kan worden gebruikt om te studeren van DVT vorming en resolutie, wat een voordeel ten opzichte van de FeCl3 model11.
Wij hebben een niet-invasieve methode te volgen van vorming van trombose en resolutie na verloop van tijd met behulp van een micro-imaging hoge-frequentie echografie systeem12ontwikkeld. Wij hebben eerder aangetoond dat meting van veneuze trombose door echografie gunstig met stolseltjes verkregen pathologisch correleert. Wij hebben in twee latere studies bevestigd dat metingen met echografie correlaat met trombose gewicht en trombose gebied gekwantificeerd door histochemie9,10 verkregen. Nog belangrijker, hebben we aangetoond dat hoge frequentie echografie kan worden gebruikt voor het controleren van de vorming van diepe veneuze trombose in muizen12. Het kan ook worden gebruikt om het kwantificeren van trombose resolutie in een niet-invasieve manier.
Hier beschrijven we het protocol waardoor trombose vorming met behulp van de muismodel stase-geïnduceerde trombose en hoe trombose vorming niet-gebeurt na verloop van tijd met behulp van hoge frequentie echografie kan worden gecontroleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care Comité van McGill University Montreal, QC, Canada. Al het nodige materiaal wordt vermeld in tabel I.
1. RattenUitrustingen (C57BL/6J) IVC Stasis Protocol
- Operatie voorbereiding
Nota: Dit is een survival chirurgie en dus juiste aseptische techniek moet te allen tijde worden gevolgd. Het gaat hierbij om ervoor te zorgen dat alle materialen zijn bij de hand, reinigen en steriliseren van instrumenten vóór en tussen gebruik en aanwijzing van een steriele ruimte op het plateau voor alle steriel materiaal.- Alle chirurgische instrumenten en materialen door autoclaaf steriliseren. Een glazen kraal sterilisator volstaat om te steriliseren instrument tips tussen dieren, als meer dan één procedure in één keer gebeurt.
- Anesthetize 8-10 week oud C57Bl/6 mannelijke muizen met een mengsel van 100% zuurstof en 2,5% Isofluraan.
Opmerking: Pas de toevoer van zuurstof en Isofluraan zo nodig. - Bevestig afstomping door knijpen de achterste poot van het dier tussen de tenen met een tang. Geen reactie van de snuifje geeft aan dat het dier wordt verdoofd.
- Beheren langzaamwerkend pijnstiller (buprenorfine) via subcutane injectie. Geven de muizen een dosis van 1 mg van pijnstiller per 1 kg lichaamsgewicht (1 mg/kg).
- Plaats oog zalf op beide ogen van het dier om ervoor te zorgen geen hoornvlies uitdroging voor de duur van de procedure.
- 0,2 - 0,5 mL isotone vloeistoffen per 10 g lichaamsgewicht subcutaan beheren.
- Corrigeer het dier in plaats op de operatie tafel met behulp van chirurgische tape. Plaats het dier in een liggende positie om de buik bloot te stellen. Chirurgie uitvoeren op een verwarming pad te voorkomen hypothermie.
- Haar verwijderen uit de buik van de muis door toepassing van een ontharing crème voor 1-2 min. Veeg de buikstreek schoon met gaas en gedestilleerd water, indien nodig.
- Ook het haar uit de buik door scheren met een klein elektrisch scheerapparaat te verwijderen.
- Het steriliseren van de buik met Baxedin (chloorhexidine gluconaat BP oplossing) alvorens elke incisies. Toepassing van ethanol lichtjes met gaas om overmatige hitte verlies veroorzaakt door de verdamping van de alcohol te vermijden.
- Blootstelling van de Vena Cava (IVC), Inferior
- Met chirurgische scharen, uitvoeren een laparotomie om te openen de buikholte.
- Til de huid met een Tang voor de onderbuik en maak een verticale insnijding parallel aan weerszijden van de linea alba. De eerste snede maken links of rechts van de linea alba, afhankelijk van de handigheid van de exploitant. De incisie wordt gemaakt uit de buurt van de middellijn bij echografie imaging later.
- Maak een tweede, horizontale snede boven in de buik.
Opmerking: Na penetratie in de buik, de daaraan gehechte spiermassa moet worden "tented" en vervolgens met een chirurgische schaar ter voorkoming van schade aan de buikorganen doorgedrongen. - Herhaal de verticale en horizontale incisies op de buikspier laag van het dier. Zorg ervoor dat de spieren tijdens de penetratie in de buik niet te beschadigen de organen onder de tent.
Let op: Heffen huid en spier weg van darmen en andere inwendige organen bij het maken van insnijdingen om niet doorprikken hen.
- Vouw de huid en de spier uit de buurt van de incisie bloot van de buikholte.
- Toepassing van gaas, bevochtigd met isotone oplossing, op de zijkanten van de wond-opening en belichamen van de darmen. Druk uitoefenen op beide zijden van de buik bij de externalization van de darmen. Gebruik zachte bewegingen met een katoen-tip applicator te verplaatsen van de darmen. Doordrenk gaas in isotone oplossing en plaats deze over de externalized van de darmen.
- Gaas moet vooraf worden bevochtigd vóór plaatsing op weefsel.
- Verplaats opzij peritoneale vet en bloot de IVC tussen de nier- en iliacale aderen.
- Maak een initiële identificatie van duidelijk zij takken. Een zijaansluiting zal verschijnen als kleine, maar belangrijke ader die uit de buurt van het IVC, tussen de renale en iliacale takken veins. Therapieën kan sterk variëren tussen muizen. Muizen kunnen zij takken aanwezig hebben aan één of beide zijden van de IVC.
- Met chirurgische scharen, uitvoeren een laparotomie om te openen de buikholte.
- Afbinding van zij takken
Opmerking: Als zij takken aanwezig zijn, wordt de volgende procedure gevolgd voor elkaar. Als niet aanwezig is, gaat u verder met stap 4: initiële hechtdraad plaatsing onder het IVC. De site van de afbinding van het IVC zullen onmiddellijk distale aan de linker nier ader, ongeacht de aanwezigheid van kant takken.- Botte dissectie uitvoeren aan weerskanten van de zijaansluiting. Botte dissectie is het proces van openen herhaaldelijk botte pincet met zachte druk, zodat het doorbreken van de fascia zonder beschadiging van de omliggende vaartuigen.
Let op: Vermijd prikken of beschadiging van de ader. - Til de tak en doorgeven van een deel van de zijde hechtdraad 6-0 onderaan de ader. Altijd wees voorzichtig bij het heffen of verplaatsen van schepen. Het is het beste om te grijpen het vet rond de schepen, anders bestaat het risico van beschadiging van het schip.
- Maak een chirurgische afbinding rond de zijaansluiting met behulp van standaard chirurgische knoop koppelverkoop techniek met hechtdraad pincet. Volledige Afbinding wordt gedaan om ervoor te zorgen 100% occlusie van de ader. Gebruik ten minste drie gelijkmakende gooit om dat de afbinding is veilig.
- Herhaal stap 1.3 voor eventuele resterende zij-takken.
- Botte dissectie uitvoeren aan weerskanten van de zijaansluiting. Botte dissectie is het proces van openen herhaaldelijk botte pincet met zachte druk, zodat het doorbreken van de fascia zonder beschadiging van de omliggende vaartuigen.
- Dissectie van de abdominale aorta vanuit het IVC
- Botte dissectie rond het IVC onmiddellijk distale uitvoeren vanaf de linker nier ader. De abdominale aorta is gekoppeld aan het IVC via fascia, daarom voeren eerste botte dissectie rond zowel de IVC en de abdominale aorta.
Let op: Vermijd prikken of beschadiging van de ader. Niet scheuren of perforaties of vaartuig. Dit is het meest kritische deel van de procedure, met het hoogste risico voor beschadiging van het schip. - Blijven van toepassing zachte druk via botte dissectie tot een doorzichtig venster is gemaakt tussen de aorta en de IVC.
- Botte dissectie rond het IVC onmiddellijk distale uitvoeren vanaf de linker nier ader. De abdominale aorta is gekoppeld aan het IVC via fascia, daarom voeren eerste botte dissectie rond zowel de IVC en de abdominale aorta.
- Sutuur (geologie) plaatsing en Afbinding van de IVC
- Het doorgeven van een deel van de zijde hechtdraad 6-0 onder de IVC en abdominale aorta.
- Zoek de hechtdraad door het raam gemaakt tussen de IVC en de aorta. Gebruik pincet te trekken van de hechtdraad en rijg deze tussen de abdominale aorta en IVC. Rijg de hechtdraad via zorgvuldig, probeert niet te trek/punctie de IVC en abdominale aorta.
- Maak een chirurgische afbinding rond het IVC met hechtdraad pincet, zorgen voor een totale occlusie van de ader. Opnieuw, maken de afbinding onmiddellijk distale uit de linker nier ader.
- Maak drie hechtdraad gooit teneinde de afbinding.
Opmerking: Het is ook mogelijk om door te geven van de hechtdraad onder de IVC en aorta vóór het scheiden van de twee als een alternatieve optie. Als alternatief kunnen de 7-0 Prolene hechtingen worden gebruikt voor afbinding van de zij-takken en het IVC.
- Sluiting en postoperatieve wondverzorging
- Controleer of dat de abdominale aorta ononderbroken heeft gelaten en dat alle zij-takken hebben zijn afgebonden. Het IVC verschijnt verwijde distale van de afbinding-site en geen bloed stroom zichtbaar zal zijn.
- Plaats alle peritoneale vet en de darmen terug in de buikholte.
- Sluit de wond met hechtdraad pincet en 6-0 zijde hechtdraad. Gebruik een lopende hechtdraad (eenvoudige continu) en ervoor zorgen dat de hechtdraad niet te strak. Een strakke hechtdraad zal scheuren wanneer het dier wakker en rond zijn kooi beweegt.
- Als alternatief, PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon of edelstaal clips te gebruiken voor de sluiting van de wond.
- Sutuur (geologie) de laag van de buikspier eerst met behulp van passende hechtdraad koppelverkoop techniek.
- Herhaal hechtdraad techniek voor de huid en controleer of de sluiting van de wond is voldoende.
Opmerking: Als het dezelfde hechtdraad naald en draad gebruikt voor meerdere dieren, steriliseren zowel in 70% ethanol vóór elk gebruik. - Verwijder het dier uit verdoving gas en plaats hen in een incubator 34 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
- Nogmaals, het beheren van 0,2 - 0,5 mL isotone vloeistoffen per 10 g lichaamsgewicht subcutaan. Vloeistoffen kunnen worden gegeven in de volgende dagen te handhaven van pre-operatieve lichaamsgewicht, indien nodig.
- Het controleren van het dier tot herstel beoordelen van de algehele gezondheid van het dier te waarborgen van de succesvolle operatie.
Let op: Verwacht een lichte gebogen houding voor een invasieve procedure zoals deze, maar het dier gedraagt zich normaal zo spoedig na operatie van 30 minuten. - Plaats het dier in zijn eigen kooi en zet het niet met andere dieren tot volledig hersteld.
- Opnieuw beheren pijnstiller dagelijks voor maximaal 48 h postop.
- Voedsel plaats op de vloer van de kooi voor de dierlijke while in herstel. Andere speciale zorg is over het algemeen niet nodig.
- Bekijk de site van de wond voor roodheid, zwelling, of geen kwijting en eventuele andere tekenen van infectie.
- Indien nodig verwijderen hechtingen na 7-10 dagen.
- Uitvoeren van de euthanasie onmiddellijk als de operatie mislukt (bijvoorbeeld een aanzienlijke schip schade en/of bloed verlies) of dier verbetert niet met post-operatieve zorg. Euthanasie wordt over het algemeen uitgevoerd met 48 h postop. Voor langere experimenten, kunt 7-0 Prolene afbinden zij takken en het IVC en 5-0 Vicryl hechtingen te sluiten van de buikholte.
- Euthanasie door afstomping van het dier in een inductie zoals eerder is beschreven, behalve bij 5% Isofluraan uitvoeren Dit wordt gevolgd door verstikking met 100% CO2 terwijl verdoofd.
- Na bevestiging van euthanasie door verstikking (verlies van hartslag en geen ademhaling), cervicale dislocatie om ervoor te zorgen volledige euthanasie uit te voeren.
2. hoge frequentie echografie Protocol
Opmerking: Dit protocol is aangepast van de Lady Davis Instituut knaagdier fenotypering Core SOP voor hoge frequentie echografie imaging. Dit protocol postoperatieve 24 h wordt uitgevoerd, maar kan eerder worden gedaan zolang het dier goed op de operatie reageert. Het protocol kan worden uitgevoerd op elk gewenst moment op gezonde muizen en vaak is gedaan vóór en na de operatie te vergelijken.
-
Voorbereiding van dier
- Plaats het dier in een zaal van de inductie en anesthetize van het dier met een mengsel van 100% zuurstof en 2,5% Isofluraan.
- Hartslag en temperatuur monitor inschakelen. Achterlicht warmte boven tafel dier om warm te houden tijdens de procedure.
- Verwijderen van het dier uit de zaal inductie en toepassen van oog smeermiddel om te voorkomen dat hoornvlies uitdroging. Plaats het dier op het platform van de analyse en brengt de verdoving buis aan mond/neus van het dier.
- Warme echografie gel tot 37 ° C en plaats de gel op de buik van het dier. De echografie gel is verwarmd met behulp van een water-Verwarming systeem dat pompen warm water door spoelen die zijn gewikkeld rond de fles van gel.
- Voor de metingen van de hartslag (indien nodig), elektrode gel zetten de 4 elektroden van het platform van de analyse en de poten van het dier aan de platform/elektroden met chirurgische tape vast. Plaats het dier in een liggende positie voor beeldvorming van de IVC. De echografie imaging systeem omvat een analyse-platform dat is opgewarmd en bevat elektroden voor het toezicht op het dier.
- Voor temperatuurmetingen, elektrode gel zetten thermometer en voeg in de rectum van het dier.
- Aanpassen van warmte lamp en Isofluraan als nodig is om ervoor te zorgen dat dier is comfortabel, heeft een ademhaling tussen 30-70 bpm en wordt bewaard bij 37 ° C.
- Indien nodig, scheren van de buik van het dier of het verwijderen van haar met haar verwijdering room. 1-2 minuten solliciteren en veeg schoon met gaas en gedestilleerd water.
Opmerking: Teveel haren kan invloed hebben op de kwaliteit van de beelden. - Plaats gaas onder of aan de zijkant van het dier te vangen eventuele overtollige ultrageluid-gel.
-
Imaging de IVC en trombose
- Zet de denkbaar software en een nieuwe studie beginnen.
- Selecteer een geschikte scanhead voor imaging. De scanhead die hier gebruikt is voor buikorganen (frequentie: 35 MHz, focale lengte: 12,8 mm).
- Het opnemen van alle relevante informatie over het dier. Dit kan inhouden dat dier ID, geslacht, gewicht, geboortedatum, stam, enz.
- Lager de scanhead naar beneden totdat het is ontroerend de ultrageluid-gel op het dier.
- Start de scanhead sonde om te beginnen met 2D-beeldvorming van het dier. In deze modus worden beelden gepresenteerd als tweedimensionaal, in variërende tinten grijs.
- Zoek de IVC en abdominale aorta door het bewegen van de muis platform in de x - en/of y-vlak, terwijl het ook het bewegen van de scanhead via het z-vlak.
Opmerking: Bloed schepen zal verschijnen met hun witte muren en het bloed binnen bijna zwart. De abdominale aorta zal intens pulseren en dikkere wanden hebben, terwijl het IVC zal hebben van dunner muren en comprimeren/uitbreiden eenvoudig op het beeld scherm wanneer de scanhead wordt verplaatst omhoog en omlaag. De afbinding site zal blijken, zoals de ader zal worden uitgezet en de wand van de ader tot een punt komen zal. Trombose gevormd binnen zullen solide onder echografie imaging en zal niet gemakkelijk comprimeren als de wand van de ader doet. De ader zal comprimeren alleen boven de afbinding, waar geen trombose ontstaat. - Op het IVC en de afbinding-site zoeken, centreert u hen op het brandpunt van de echografie, met het oog op het meest nauwkeurige beeld.
- Als de afbeelding te donker is te zien, aanpassen van de gel luchtbellen te verwijderen met een katoen-tip applicator.
- Indien nodig, de scanhead 45° naar links of rechts kantelen en passen de dierlijke platform om te zien de ader duidelijk. Dit wordt gedaan als er interferentie met de scanhead. In dit scenario moet de ader image worden gemaakt op een side-hoek om te voorkomen dat de hechtdraad.
Opmerking: Afbeelding interferentie wordt meestal veroorzaakt door donkere vlekken van de huid op het dier, slechte wond hechtdraad plaatsing of bubbels in de ultrageluid-gel.
- Gebruik de software, nemen foto's van elke gewenste structuren en metingen met behulp van elke prestatiemetingsprogramma's. Gemeenschappelijke metingen bevatten oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de trombose of breedte van de afbinding site.
- De imaging mode veranderen naar Pulse-Golf Doppler om bloed stroom metingen. In deze modus kunt de beeldvorming van vasculaire doorbloeding en het meten van de stroomsnelheid, onder andere variabelen.
- Kantel het analyse-platform te verlagen van het posterieure einde van het dier.
- De hoek/positie van de scanhead wijzigen zodat hij zal contact opnemen met de gel op een hoek van ongeveer 30° vanaf het achterste einde van het dier.
- De dierlijke platform en scanhead verplaatsen. De IVC en Afbinding verplaatsen indien nodig.
- Bloed stroom metingen rond de afbinding site gewenst afbeeldingen te bevestigen stase maken Gemeenschappelijke metingen van de bloedstroom opnemen gemiddelde snelheid, maximale snelheid of gemiddelde snelheid.
- Metingen of opnamen opslaat.
-
Sanering en dierlijke herstel
- Verhogen van de scanhead eerste positie te verplaatsen van dierlijke platform naar haar aanvankelijke standpunt, ook.
- Verwijder overtollige gel uit het dier met gaas. Doe dit voorzichtig zodat de wond hechtdraad zal niet worden gescheurd.
- Verwijder de thermometer uit rectum van het dier en de hond uit het platform te nemen.
- Plaats het dier in zijn kooi en een 34 ° C incubator.
- Het controleren van het dier tot herstel. De procedure is zeer klein en niet-invasief. Het dier zal snel wakker. Blijven volgen dier in de volgende dagen overeenkomstig punt 1.6 van dit protocol.
- Reinig de dierlijke platform met gaas en ontsmettingsmiddel.
- Veeg de scanhead schoon met gaas en gedestilleerd water.
Let op: Reinig zeer voorzichtig de scanhead en alleen met gedestilleerd water. - Herhaal stap 2 voor het volgende dier.
- Als klaar met alle onderwerpen, controleert u of dat alle afbeeldingen en opnamen zijn opgeslagen. Schakel alle apparatuur en software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stase veneuze trombose model
In het model van stase, muizen zijn verdoofd en een snede is gemaakt om de vena cava (IVC), inferior bloot te stellen. De incisie wordt gemaakt aan de linker- of rechterkant van de muis in plaats van een middellijn laparotomie op een manier die niet met de ultrasone sonde interfereren zou. De buikspieren aan te spannen en de huid zijn vouwen terug naar het blootstellen van het IVC (Figuur 1). Ten eerste zijn zij takken afgebonden met een 6-0 zijde hechtdraad (Figuur 2). Vervolgens het IVC door botte dissectie van de aorta is gescheiden en de zijde is geplaatst rond het IVC (figuur 3A-C). De IVC is afgebonden met een 6-0 zijde hechtdraad. Torsie van de IVC onder de afbinding site is een indicatie van succesvolle onderbreking van de bloedtoevoer (figuur 3D). Tot slot zijn de peritoneale Holte en de huid ingehecht terug op een continue wijze (de 3E figuur).
Toezicht op de vorming van trombose met behulp van Ultrasonografie
Zoals we eerder hebben getoond, kan hoge frequentie echografie, die wordt gebruikt bij het beoordelen van veneuze trombose in klinische instellingen, worden gebruikt voor het meten van de vorming van trombose en resolutie na verloop van tijd in een experimentele lymfkliertest model. We hebben een hoge frequentie micro-imaging systeem12gebruikt. Voorafgaand aan de afbinding, kan het IVC worden geïdentificeerd in de lengterichting weergave. Na Afbinding van de ader, kan het succes van de procedure worden gevisualiseerd. De PW-Doppler-modus kan worden gebruikt om te bepalen van de stroomsnelheid van bloed vóór (34.8 mm/s) en na (5,6 mm/s) de afbinding. Omdat stolseltjes dichtere dan stroomt bloed, konden we waarderen de gevormde trombose binnen het IVC met behulp van Ultrasonografie, 24 uur na de afbinding (figuur 4A). Ultrasonografie zorgt voor de kwantificering van de snelheid van de bloedstroom in de bakken met behulp van color Doppler. Zoals blijkt uit figuur 4B, kunnen wij meten van de stroom in de ader vóór afbinding en waarderen van de onderbreking van de stroom na de afbinding, wanneer de trombose wordt gevormd. Gegevens uit onze laboratorium-Toon de grootte van een gemiddelde trombose van 4,85 ± 0,22 mm2 24 uur en 5.05 ± 0.47 mm2 48 uur (bedoel ± SEM).
Figuur 1. Stase model: Procedure voor het blootstellen van de vena cava inferior. (A) muis haar uit de buik wordt verwijderd met behulp van haar verwijdering room. (B) een eerste snede is gemaakt aan de linkerkant van de buik en een tweede ventrale één (C) van links naar rechts. (D) een natte steriele blik wordt gebruikt om de exteriorize van de darmen en bloot de vena cava inferior (IVC) en zijaansluiting (SB). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Stase model: Procedure voor het afbinden van de zijaansluiting. (A) de expositie van de IVC en SB. (B) plaatsing van de zijde van de hechtdraad onder de SB. (C) Ligation van de SB. LRV: linker nier ader. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Stase model: Procedure voor het afbinden van de vena cava inferior. (A-B) Botte dissectie te scheiden van het IVC van de aorta. (C) plaatsing van de zijde van de hechtdraad onder de IVC. (D) Afbinding van de IVC. Torsie van de IVC wordt waargenomen. (E) de buikspieren aan te spannen en de huid zijn afzonderlijk gesloten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Toezicht op de vorming van trombose met behulp van echografie imaging. (A) representatieve echografie beelden, onmiddellijk na en 24 uur na de afbinding van de IVC. (B) vertegenwoordigers beelden van bloed stromen snelheid afgebeeld door kleur Doppler met behulp van kleur verwerking. De schaal van gekleurde bloed stroom varieert van rood naar geel verbeelden van hoge naar lage stroom. In de ligaturen dieren is het ontbreken van stroom afgebeeld door de afwezigheid van kleur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen voor succesvol veneuze trombose vorming met behulp van het stasis-model. Inductie van veneuze trombose is moeilijker in oude muizen als gevolg van de ophoping van vet rond de vena cava inferior en de aorta. Idealiter moet de muizen ondergaan deze procedure 8 - 10-weken oude. Grote zorg moet worden genomen niet ertoe endothelial schade in het IVC tijdens de botte dissectie en ligatuur. Daarnaast is het essentieel om te houden van het dier in een incubator 34 ° C gedurende ten minste 30 minuten na de operatie en terugbrengen naar het gezelschap van andere dier slechts na volledig herstel. Wanneer de operatie correct wordt gedaan, wordt de dieren opmerkelijk goed tijdens de post-operatieve zorg gedragen. Ze vertonen geen ernstige bijwerkingen zoals kreupelheid, parese of incontinentie. Ze vertonen verminderde beweging en een lichtjes gebogen houding onmiddellijk na de operatie, maar dit wordt niet vaak gezien, zolang de pijnstiller effectief is en de operatie goed uitgevoerd.
Het model stase produceert een grote trombose met reproduceerbare grootte metingen van één muisklik naar de andere. Net als in de mens, de anatomie van het veneuze systeem varieert tussen muizen en de kwestie van de onderbreking van de tak van de IVC is onlangs behandeld in de stenose en de stase modellen van DVT13,14. Brandt et al. toonde dat trombose vorming geïnduceerd door beperking van de stroom werd voorkomen toen de zij-takken waren gelegen op < 1.5 mm van de IVC afbinding site. DVT vorming geïnduceerd door beperking van de stroom bij muizen was echter niet beïnvloed door kant tak afbinding13,15,16. Het werd ook gemeld dat de variabiliteit van IVC zij takken bij C57Bl6 muis stam grote invloed op de vorming van trombose geïnduceerd door volledige Afbinding van de IVC14 heeft. Bleek dat niet ligating kant resultaten in statistisch kleiner clot, in vergelijking met besturingselementen met ligaturen zij takken takken. Onze studie blijkt ook dat Afbinding van kant takken geproduceerd consistent trombose vorming en dezelfde afmetingen. De meest voorkomende anatomische variatie in C57Bl/6 is echter dat de aanwezigheid van 2 terug takken (98% van de muizen),14. Het bleek dat onderbreken terug takken de grootste impact op trombose grootte heeft. De huidige methode ingegaan niet op het effect van de bijkantoren van de rug, die kan worden onderbroken met een lage temperatuur brandijzer pen14. We lieten echter zien dat Afbinding van de IVC en kant takken resulteerde in consequent trombose vorming in C57Bl/6. Ten slotte, zoals we eerder hebben aangetoond, het hoge frequentie echografie systeem maakt de nauwkeurige meting van trombose grootte en kan worden gebruikt voor langdurige en translationeel onderzoek naar trombose vorming en resolutie12,13 ,15.
Een groot nadeel van het stasis-model is de volledige obstructie van de bloedstroom, waardoor het maximale effect van intraveneus toegediend agenten op de trombose en ader muur. Dit wordt een belangrijke kwestie wanneer men wil testen van het effect van een farmacologische agent. Als het effect van een specifieke drug worden getest moet, zou men liever met behulp van de stenose model13 of de elektrolytische model17. Beide modellen produceren stolseltjes in aanwezigheid van continue doorbloeding, waardoor het testen van nieuwe anti-coagulant agenten voor DVT profylaxe en behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het hart en de Stichting van de lijn in Canada en de Morris en Bella Fainman Family Foundation. De auteurs bedank Veronique Michaud voor haar technische hulp bij de VEVO770 echografie imaging systeem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 perma-hand silk suture | Ethicon | 706G | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| blunt forceps (straight and curved) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria Spring Scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1ml syringes | BD Biosciences | ||
| 26G needles | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | No longer sold | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Given to LDI by Vet | |
| Surgery Microscope | Leica | Leica M651 | |
| Systan eye oinment | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2x2 sterile Gauze | CDMV | #104148 | |
| Cotton Tip Applicators | from JGH | ||
| Transpore hypoallergenic surgical tape | CDMV | #7411 | |
| Ultrasound gel (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Incubator | From JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment | Dispomed | ||
| Hair remover | Nair | ||
| Water heated hard pad | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar heater water pump TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Infra-red heating lamp | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Mouse rectal temperature prope | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterile water | From JGH |
References
- Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).
- McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).
- Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).
- Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).
- Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).
- Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).
- Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121 (4), 692-699 (2013).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127 (6), 769-777 (2016).
- Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. , (2016).
- Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).
- Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).
