Summary
Denne protokol beskriver trin for at hente venøs trombose ved hjælp af en stasis model. Desuden vi bruger en ikke-invasiv metode til at måle blodprop dannelse og opløsning over tid.
Abstract
Venøs trombose er en almindelig tilstand, der påvirker 1-2% af befolkningen, med en årlig incidens på 1 i 500. Venøs trombose kan føre til døden gennem lungeemboli eller resultater i den post trombotiske syndrom, præget af kroniske smerter i benene, hævelse og ulceration eller kronisk pulmonal hypertension resulterer i betydelig kronisk respiratorisk kompromis. Dette er den mest almindelige hjerte-kar-sygdom efter myokardieinfarkt og iskæmisk slagtilfælde og er en klinisk udfordring for alle medicinske discipliner, som det kan komplicere forløbet af andre lidelser som kræft, systemisk sygdom, operation og større traumer.
Eksperimentelle modeller er nødvendige for at undersøge disse mekanismer. Stasis model inducerer konsekvent Trombe størrelse og en kvantificerbar mængde af blodprop. Det er imidlertid nødvendigt at systematisk ligate sidegrene af den ringere vena cava at undgå variabilitet i Trombe størrelser og eventuelle fejlagtige data fortolkning. Vi har udviklet en ikke-invasiv teknik til at måle Trombe størrelse ved hjælp af ultralyd. Brug af denne teknik kan vi vurdere Trombe udvikling og opløsning over tid i de samme dyr. Denne tilgang begrænser antallet af mus kræves til kvantificering af venøs trombose i overensstemmelse med princippet om erstatning, reduktion og forfinelse af dyr i forskning. Vi har demonstreret, at blodprop vægt og histologiske analyse af Trombe størrelse korrelat med måling fremstillet med ultralyd. Den nuværende undersøgelse beskrives derfor, hvordan til at fremkalde dyb venetrombose i mus ved hjælp af den ringere vena cava stasis model og hvordan man kan overvåge det ved hjælp af højfrekvente ultralyd.
Introduction
Venøs tromboemboli (VTE), som består af dyb venøs trombose (DVT) og lungeemboli, er den tredje hyppigste årsag til hjerte-kar-død efter myokardieinfarkt og slagtilfælde. Det er en almindelig tilstand, der påvirker 1-2% af befolkningen, med en årlig incidens på 1 i 5001. VTE kan føre til: 1) død gennem lungeemboli; 2) post-trombotiske syndrom, præget af kroniske smerter i benene, hævelse og sårdannelse; eller 3) kronisk pulmonal hypertension resulterer i betydelig kronisk respiratorisk kompromis. VTE er en multifaktorielle sygdomme og kan skyldes stasis af blodgennemstrømningen, skade på fartøjet vægge, og/eller hypercoagulable stater som følge af en forstyrrelse af balance mellem koagulation og de fibrinolytiske systemer, som det er blevet beskrevet over hundrede år siden af Virchow og er kendt som den Virchow treklang.
Fordi i de fleste tilfælde er det umuligt at få menneskelige DVT prøver, har forskere udviklet eksperimentelle dyremodeller for DVT. Flere dyr herunder rotte2, mus3, kanin4, gris5, hund6og primat7 har været brugt. Mus kan være genetisk modificerede og er den hyppigst anvendte dyr at studere DVT. Men som i alle dyr, spontane DVT er ikke observeret i mus. Således, fysiske eller kemiske ændringer af vene væg er brugt til at oprette trombose hos mus. Vi har tidligere brugt ferrichloridopløsning model til at fremkalde blodpropper i den ringere vena cava (IVC) mus8,9,10. Denne model har fordelen at producere pålideligt okklusiv trombi inden for få minutter og kan bruges til at undersøge rollen af antikoagulerende og anti-trombocyttal medicin under akut DVT. Det er imidlertid en terminal procedure. Således, for at studere akut og kronisk DVT, stasis model er mere velegnet. I denne model, er blodprop dannelse fremkaldt af den fuldstændige afbrydelse af blodgennemstrømningen i IVC, en af faktorer i Virchow's triad for udvikling af DVT. Denne model kan bruges til at studere DVT dannelse og opløsning, hvilket er en fordel i forhold til FeCl3 model11.
Vi har udviklet en ikke-invasiv metode til at følge blodprop dannelse og opløsning over tid ved hjælp af en mikro-imaging høj frekvens ultralyd system12. Vi har tidligere vist, at måling af venøs trombose af ultralyd korrelerer positivt med trombi fremkommer patologisk. I to efterfølgende undersøgelser har vi bekræftet, at målinger fremstillet med ultralyd korrelat med blodprop vægt og blodprop område kvantificeres ved histokemi9,10. Vigtigere er, har vi viste at høj frekvens ultralyd kan bruges til at overvåge dannelsen af dyb venøs trombose i mus12. Det kan også bruges til at kvantificere Trombe opløsning i en ikke-invasiv måde.
Her vil vi beskrive protokollen tillader blodprop dannelse ved hjælp af stasis-induceret trombose musen model og hvordan blodprop dannelse kan overvåges ikke-invasivt over tid ved hjælp af højfrekvente ultralyd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af det institutionelle Animal Care Udvalget af McGill University Montréal, QC, Canada. Alle de nødvendige udstyr er angivet i tabel jeg.
1. murine (C57BL/6J) IVC Stasis protokol
- Kirurgi forberedelse
Bemærk: Dette er en overlevelse kirurgi og korrekt aseptisk teknik skal derfor følges på alle tidspunkter. Dette omfatter at sikre alle materialer er for hånden, rengøring og sterilisering instrumenter før og mellem brug og udpege en steril område på den arbejdende overflade for alle sterile materiale.- Sterilisere alle kirurgiske instrumenter og materialer af autoklave. Et glas perle sterilizer er tilstrækkelig til at sterilisere instrument tips mellem dyr, hvis mere end én procedure sker på én gang.
- Bedøver 8-10 uge gamle C57Bl/6 mandlige mus med en blanding af 100% ilt og 2,5% isofluran.
Bemærk: Justere strømmen af ilt og isofluran som nødvendigt. - Bekræft anesthetization ved at klemme den bageste pote af dyr mellem tæer med pincet. Ingen reaktion fra knibe angiver dyret er bedøvede.
- Administrere langsom frigivelse smertestillende (buprenorphin) via subkutan injektion. Give mus en dosis af 1 mg af smertestillende pr 1 kg legemsvægt (1 mg/kg).
- Placer øjet salve på begge øjne af dyret til at sikre, at ingen hornhinde udtørring for procedurens varighed.
- Administrere 0,2 - 0,5 mL isotonisk væsker pr. 10 g kropsvægt subkutant.
- Fix dyret på plads til tabellen kirurgi ved hjælp af kirurgisk tape. Placere dyret i en liggende stilling at eksponere maven. Udføre kirurgi på en varmepude at forhindre hypotermi.
- Fjern hår fra maven med musen ved anvendelse af en Hårfjerningscreme til 1-2 min. tørre maveregionen rense med gaze og destilleret vand, hvis nødvendigt.
- Alternativt, fjerne håret fra underlivet ved barbering med en lille elektrisk barbermaskine.
- Sterilisere maven med Baxedin (klorhexidin gluconat BP løsning) inden du foretager eventuelle indsnit. Anvende ethanol let med gaze til at undgå overdreven varmetab som følge af fordampning af alkohol.
- Eksponering af den ringere Vena Cava (IVC)
- Ved hjælp af kirurgiske saks, udføre en laparotomi for at åbne i bughulen.
- Løft huden med pincet i underlivet og laver et lodret snit parallelt med begge sider af linea alba. Gøre den første snit, til venstre eller højre side af linea alba, afhængigt af håndethed af operatøren. Snittet er lavet fra midterlinjen til at bistå med ultralydsscanning senere.
- Gøre en anden, vandret snit i toppen af maven.
Bemærk: Efter penetration ind i maven, muskulaturen bør være "telt" og derefter trængte med kirurgisk saks til at forebygge skader den abdominale organer. - Gentag de lodrette og vandrette indsnit på mavemuskel lag af dyret. Vær sikker på at telt muskulaturen under penetration ind i maven for ikke at beskadige organerne under.
Forsigtig: Løft hud og muskel fra tarmene og andre indre organer ved at gøre indsnit at punktere dem ikke.
- Fold hud og muskel fra snit til at udsætte i bughulen.
- Anvende gaze, fugtet med isotonisk opløsning, til siderne af sår åbning og externalize tarmene. Lægge pres på begge sider af maven til at bistå udlægning af tarmene. Brug blide bevægelser med en bomuld spids applikator til at flytte tarmene. Sættetid gaze i isotonisk opløsning og Placer det over externalized tarmene.
- Gaze bør fugtes pre inden anbringelsen på væv.
- Flytte til side nogen peritoneal fedt, og udsætte IVC mellem de renale og iliaca vener.
- Foretage en indledende identifikation af indlysende sidegrene. En side gren vises som mindre, men betydeligt vene, som grene fra IVC, mellem den renale og iliaca vener. Vaskulaturen kan variere meget mellem mus. Mus kan have sidegrene til stede på en eller begge sider af IVC.
- Ved hjælp af kirurgiske saks, udføre en laparotomi for at åbne i bughulen.
- Ligatur af sidegrene
Bemærk: Hvis sidegrene er til stede, den følgende procedure følges for hver enkelt. Hvis ikke til stede, skal du fortsætte til trin 4: indledende sutur placering under IVC. Webstedet ligatur af IVC vil være umiddelbart distalt for den venstre nyre-vene, uanset forekomsten af sidegrene.- Udføre stump dissektion på hver side af grenen side. Stump dissektion er processen med at gentagne gange åbne stump pincet med blide tryk, for at bryde igennem fascia uden at beskadige omgivende fartøjer.
Forsigtighed: Undgå punktering eller beskadige venen. - Løft grenen og passere en sektion af 6-0 silke sutur nedenunder venen. Altid tage sig når personløft eller -flytning fartøjer. Det er bedst at Grib fat omkring fartøjerne, ellers er der en risiko for at beskadige skibet.
- Ved hjælp af sutur pincet, gøre en kirurgisk ligatur omkring grenen side ved hjælp af standard kirurgisk knude binde teknik. Fuld ligatur er gjort for at sikre 100% okklusion af venen. Brug mindst tre koblingssalg kaster til at sikre ligation er sikkert.
- Gentag trin 1.3 for enhver resterende sidegrene.
- Udføre stump dissektion på hver side af grenen side. Stump dissektion er processen med at gentagne gange åbne stump pincet med blide tryk, for at bryde igennem fascia uden at beskadige omgivende fartøjer.
- Dissektion af den abdominale aorta fra IVC
- Udføre stump dissektion omkring IVC umiddelbart distalt fra den venstre nyre-vene. Den abdominale aorta er knyttet til IVC via fascie, derfor udføre indledende stump dissektion omkring både IVC og abdominale aorta.
Forsigtig: Undgå punktering eller beskadige venen. Undlad at briste eller punktere enten fartøj. Dette er den mest kritiske del af proceduren, med den højeste risiko for fartøj skade. - Fortsat gælde blide tryk via stump dissektion, indtil en klare vindue er lavet mellem aorta og IVC.
- Udføre stump dissektion omkring IVC umiddelbart distalt fra den venstre nyre-vene. Den abdominale aorta er knyttet til IVC via fascie, derfor udføre indledende stump dissektion omkring både IVC og abdominale aorta.
- Sutur placering og IVC ligatur
- Passere en sektion af 6-0 silke sutur nedenunder IVC og abdominale aorta.
- Find suturen gennem vinduet lavet mellem IVC og aorta. Bruge pincet til at trække sutur og tråd det mellem den abdominale aorta og IVC. Tråd sutur gennem omhyggeligt, forsøger ikke at trække/punktering IVC og abdominale aorta.
- Gøre en kirurgisk ligatur omkring IVC med sutur pincet, at sikre en total okklusion af venen. Igen, gør ligation umiddelbart distalt fra den venstre nyre-vene.
- Gøre tre sutur kaster til at sikre ligation.
Bemærk: Det er også muligt at passere sutur nedenunder IVC og aorta før adskiller to som en alternativ mulighed. Alternativt kan 7-0 Prolene suturer bruges til ligatur af sidegrene og IVC.
- Såret lukning og postoperativ pleje
- Kontroller, at den abdominale aorta er blevet efterladt uden afbrydelser og at alle sidegrene har været forbundet. IVC vises forstørrede distale fra webstedet ligatur og ingen blod flow vil være synlige.
- Placere alle peritoneal fedt og tarmene tilbage i bughulen.
- Lukke såret ved hjælp af sutur pincet og 6-0 silke sutur. Bruge en løbende sutur (simpel kontinuerlig) og sikre, at sutur ikke bliver for stram. En stram sutur vil briste når dyret vågner op og flytter omkring sit bur.
- Alternativt bruge PDS, Ethilon, Vicryl, Jakobs eller rustfrit stål klip for sår lukning.
- Sutur lag af mavemuskel først ved hjælp af passende sutur binde teknik.
- Gentag Sutur teknik for huden og kontrollere sår lukning er tilstrækkelig.
Bemærk: Hvis du bruger den samme sutur nål og tråd til flere dyr, sterilisere både i 70% ethanol før hver brug. - Fjerne dyret fra bedøvende gas og placere dem i en inkubator 34 ° C i mindst 30 minutter.
- Igen, administrere 0,2 - 0,5 mL isotonisk væsker pr. 10 g kropsvægt subkutant. Væsker kan gives i følgende dage at opretholde præoperativ kropsvægt, hvis nødvendigt.
- Overvåge dyret indtil opsving til at sikre vellykket kirurgi og vurdere den generelle sundhed i dyret.
Forsigtighed: Forventer en let foroverbøjet kropsholdning for en invasiv procedure som denne, men dyret vil opføre sig normalt så tidligt som 30 minutter efter operationen. - Placere dyret i sit eget bur og Placer det ikke med andre dyr indtil fuldt tilbagebetalt.
- Re administrere smertestillende dagligt for op til 48 h postop.
- Placer mad på gulvet i buret for de dyr, mens i recovery. Generelt er der ikke behov for andre særlig pleje.
- Undersøge webstedet sår for rødme, hævelse, eller decharge og andre symptomer på infektion.
- Om nødvendigt fjernes suturer efter 7-10 dage.
- Udføre eutanasi straks, hvis operationen ikke lykkes (f.eks. betydelige fartøj skade og/eller blod tab) eller dyr ikke forbedres med postoperativ pleje. Aktiv dødshjælp er generelt udført på 48 h postop. For længere eksperimenter, skal du bruge 7-0 Prolene til at ligate sidegrene og IVC og 5-0 Vicryl sutur for at lukke i bughulen.
- Udføre eutanasi af anesthetization af dyret i en induktion som tidligere beskrevet, undtagen på 5% isofluran. Dette er efterfulgt af kvælning med 100% CO2 mens bedøvede.
- Efter bekræftelse af eutanasi af kvælning (tab af hjerteslag og ingen vejrtrækning), udføre cervikal dislokation for at sikre komplet eutanasi.
2. høj frekvens ultralyd protokol
Bemærk: Denne protokol er tilpasset fra Lady Davis Institute gnaver fænotyper Core SOP for høj frekvens ultralyd billeddannelse. Denne protokol er gennemført 24 h postoperativ, men kan gøres hurtigere, så længe dyret svarer godt til operationen. Protokollen kan foretages når som helst på sund mus og er ofte gjort det at sammenligne før og efter operationen.
-
Forberedelse af dyr
- Placere dyret i en induktion kammer og bedøver dyret med en blanding af 100% ilt og 2,5% isofluran.
- Tænd puls og temperatur skærme. Position varmelampe over bordet for at holde dyret varm under proceduren.
- Fjern dyret fra induktion kammer og anvende øje lubricant for at forhindre hornhinde udtørring. Placer dyret på analyse-perron og anbringer den bedøvende tube til dyrets mund/næse.
- Varm ultralyd gel til 37 ° C og Anbring gel på maven af dyret. Ultralyd gel er opvarmet ved hjælp af en opvarmning af vand system at pumper varmt vand gennem spoler, der er svøbt omkring gel flaske.
- Puls målinger (hvis nødvendigt), sætte elektrode gel på analyse-perron 4 elektroder og lave poter af dyr til platform/elektroder med kirurgisk tape. Placere dyret i en liggende stilling til billeddannelse af IVC. Ultralyd imaging system omfatter en analyse platform, der er opvarmet og indeholder elektroder til overvågning af dyret.
- For temperaturmålinger, sætte elektrode gel på termometeret og indsætte i endetarmen af dyret.
- Justere varmelampe og isofluran som nødvendigt for at sikre, at dyr er komfortable, har et åndedræt mellem 30-70 bpm, og holdes ved 37 ° C.
- Hvis det er nødvendigt, barbere maven af dyret eller fjerne hår med hårfjerning fløde. Gælder for 1-2 minutter og tørres af med gaze og destilleret vand.
Bemærk: For meget hår kan påvirke kvaliteten af billederne. - Placer gaze under eller ved siden af dyret til at fange eventuelle overskydende ultralyd gel.
-
Imaging IVC og blodprop
- Dreje på imaging software og begynde en ny undersøgelse.
- Vælg en passende scanhead for billeddannelse. Scanhead bruges her er for abdominal organer (frekvens: 35 MHz, brændvidde: 12,8 mm).
- Registrere alle relevante oplysninger om dyret. Dette kan omfatte dyr ID, køn, vægt, fødselsdato, belastning, osv.
- Sænk scanhead ned, indtil det er rørende ultralyd gel på dyret.
- Start scanhead sonde for at starte 2D-billeddannelse af dyret. I denne tilstand præsenteres billeder som to-dimensionelle, i varierende gråtoner.
- Find IVC og abdominale aorta ved at flytte musen platform i hele den x - og/eller y-flyet, mens også på vej scanhead gennem z-plan.
Bemærk: Blod fartøjer vises med deres vægge hvide og blod inde næsten sort. Den abdominale aorta vil pulsere intenst og har tykkere vægge, mens IVC vil have tyndere vægge og komprimere/ekspandere nemt på billedet skærmen når scanhead flyttes og ned. Ligatur site vil være synlige, som venen vil være dilaterede og vene væg vil komme til et punkt. Enhver Trombe dannet inde vil være fast under ultrasound imaging og vil ikke komprimere let gerne vene væg gør. Venen vil komprimere kun over ligatur, hvor ingen blodprop er dannet. - Ved at placere IVC og webstedet ligatur center dem på omdrejningspunktet for ultralyd, for at opnå det mest præcise billede.
- Hvis billedet er for mørkt til at se klart, justere gel og fjerner eventuelle luftbobler med en bomuld spids applikator.
- Om nødvendigt vippe scanhead 45° til venstre eller højre og justere den animalske platform for at se venen klart. Dette er gjort, hvis der er interferens med scanhead. I dette scenario skal venen være afbildet på en side-vinkel at undgå sutur.
Bemærk: Billedet indblanding er oftest forårsaget af mørke pletter på huden på dyr, dårlig sår sutur placering eller bobler i ultralyd gel.
- Ved hjælp af software, tage billeder af enhver ønskede strukturer og foretage målinger ved hjælp af enhver måleværktøjer. Fælles målinger omfatter tværsnitsareal af blodprop eller bredde af webstedet ligatur.
- Ændre tilstanden imaging til Pulse-bølge Doppler at gøre blod flow målinger. Denne tilstand tillader billeddannelse af vaskulære blodgennemstrømningen og måling af flow hastighed, blandt andre variabler.
- Vippe analyse platform for at sænke den bageste ende af dyret.
- Ændre scanhead vinkel/stilling, så det vil kontakte gel i en vinkel på omkring 30° fra den bageste ende af dyret.
- Flyt animalske platform og scanhead. Flytte IVC og ligatur, hvis nødvendigt.
- Gøre blod flow målinger omkring ligatur stedet at bekræfte stasis og tage billeder, der ønskes. Fælles målinger af blodgennemstrømningen omfatter gennemsnitlige hastighed, peak hastighed eller median hastighed.
- Gem alle målinger eller billeder taget.
-
Oprydning og animalske opsving
- Hæve scanhead for at indledende position og flytte animalske platform til dens oprindelige position, samt.
- Fjern overskydende gel fra dyr med gaze. Gøre dette forsigtigt så såret sutur ikke vil være bristet.
- Termometret fjernes fra dyrets endetarmen og tage dyr ud platform.
- Placere dyret i sit bur og en 34 ° C inkubator.
- Overvåge dyret indtil opsving. Proceduren er meget mindre og ikke-invasiv. Dyret vil vågne op hurtigt. Fortsætte overvågning dyr i de følgende dage i henhold til punkt 1.6 i denne protokol.
- Ren den animalske platform med gaze og desinfektionsmiddel.
- Tørre scanhead ren med gaze og destilleret vand.
Forsigtighed: Ren scanhead meget forsigtigt og kun med destilleret vand. - Gentag trin 2 for det næste dyr.
- Hvis færdig med alle emner, skal du kontrollere, at alle billeder og optagelser er blevet frelst. Derefter slukke alt udstyr og software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stasis venøs trombose model
I modellen stasis mus er bedøvede og et snit er lavet til at afsløre den ringere vena cava (IVC). Snittet er lavet på venstre eller højre side af musen i stedet for en midterlinjen laparotomi på en måde, der ikke ville blande med ultralydssonde. Mavemusklerne og huden er fold tilbage at afsløre IVC (figur 1). Først, sidegrene er forbundet med en 6-0 silke sutur (figur 2). Derefter, IVC er adskilt fra aorta med stumpe dissektion og silke er placeret i nærheden af IVC (figur 3A-C). IVC er forbundet med en 6-0 silke sutur. Dilatation af IVC under webstedet ligatur er en indikation af vellykket afbrydelse af blodgennemstrømningen (figur 3D). Endelig, bughulen og huden syet tilbage på en sammenhængende måde (figur 3).
Overvågning af blodprop dannelse ved hjælp af ultralyd
Som vi tidligere har vist, kan høj frekvens ultralyd, som er almindeligt anvendt til at vurdere venøs trombose i klinisk indstillinger, bruges til at måle blodprop dannelse og opløsning over tid i en eksperimentel murine model. Vi brugte en høj frekvens mikro-imaging system12. Før ligatur, kan IVC identificeres i længderetningen opfattelse. Efter ligatur af venen, kan resultat af indgrebet visualiseres. PW-Doppler tilstand kan bruges til at bestemme blod flow hastighed før (34,8 mm/s) og efter (5,6 mm/s) ligation. Fordi trombi er tættere end flyder blod, vi kunne værdsætte den dannede blodprop inde IVC ved hjælp af ultralyd, 24 timer efter ligatur (figur 4A). Ultralyd giver mulighed for kvantificering af hastigheden af blodgennemstrømningen i de fartøjer, der anvender farve Doppler. Som vist i figur 4B, kan vi måle flow i vene inden ligatur og værdsætte afbrydelse af strømmen efter ligatur, når en blodprop er dannet. Data fra vores laboratorium viser en gennemsnitlig Trombe størrelse 4,85 ± 0,22 mm2 på 24 timer og 5.05 ± 0.47 mm2 på 48 timer (mener ± SEM).
Figur 1. Stasis model: Procedure for at udsætte den ringere vena cava. (A) mus hår fra maven er fjernet ved hjælp af Hårfjerningscreme. B en første snit er lavet på venstre side af maven og en anden ventrale en (C) fra venstre til højre. (D) en våd steril gaze bruges til at exteriorize tarmene og udsætte den ringere vena cava (IVC) og side gren (SB). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Stasis model: Procedure til ligate side gren. A redegørelse af IVC og vejledende (B) placering af sutur silke nedenunder SB. (C) Ligation af SB. LRV: venstre nyre-vene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Stasis model: Procedure for at ligate den ringere vena cava. (A-B) Stump dissektion at adskille IVC fra aorta. (C) placeringen af sutur silke nedenunder IVC. (D) ligatur af IVC. Dilatation af IVC er observeret. (E) den abdominale muskler og hud lukket separat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Overvågning af blodprop dannelse ved hjælp af ultralyd imaging. (A) repræsentative ultralyd billeder før, umiddelbart efter og 24 timer efter ligatur af IVC. (B) repræsentanter billeder af blood flow hastighed skildret af farve Doppler bruger farvebehandling. Skala af farvekodede blod flow varierer fra rød til gul til at skildre højt til lavt flow. I de sammenskrevne dyr er mangel af flow afbildet ved fravær af farve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin til vellykket venøs blodprop dannelse ved hjælp af stasis model. Induktion af venøs trombose er mere udfordrende i gamle mus på grund af ophobning af fedt omkring den ringere vena cava og aorta. Mus under denne procedure, bør ideelt set være 8 - 10 uger gamle. Stor omhu bør tages ikke at fremkalde endotel skader i IVC under stump dissektion og ligatur. Det er derudover afgørende at holde dyret i en inkubator 34 ° C i mindst 30 minutter efter operationen og returnere det til selskab med andre dyr kun efter fuld helbredelse. Når operationen er udført korrekt, dyrene opfører sig bemærkelsesværdigt godt under postoperativ pleje. De udviser ingen alvorlige bivirkninger såsom halten, parese eller inkontinens. De kan udvise nedsat bevægelse og en lidt foroverbøjet kropsholdning umiddelbart efter operationen, men dette er ikke set ofte, så længe smertestillende er effektiv og operationen udføres korrekt.
Stasis model producerer et stort Trombe med reproducerbare størrelse målinger fra en mus til en anden. Som mennesker, anatomi af det venøse system varierer mellem mus og har for nylig været behandles spørgsmålet om IVC gren afbrydelse i stenose og stasis modeller af DVT13,14. Brandt et al. viste, blodprop dannelse induceret af flow begrænsning blev forhindret når sidegrene var placeret på < 1,5 mm af IVC ligatur site. Men DVT dannelse induceret af flow begrænsning i mus blev ikke påvirket af side gren ligatur13,15,16. Det blev også oplyst, at variabiliteten af IVC sidegrene i C57Bl6 mus stamme har en betydelig indvirkning på blodprop dannelse induceret af komplet ligatur af IVC14. Det blev konstateret, at ikke ligating side grene resultater i statistisk mindre blodprop størrelse i forhold til kontrol med sammenskrevne sidegrene. Vores undersøgelse også foreslå at ligatur af den side grene produceret konsekvent blodprop dannelse og størrelse. Dog er den hyppigste anatomiske variation i C57Bl/6 tilstedeværelse i 2 tilbage grene (98% af musene)14. Det blev påvist, at afbryde tilbage grene har den største effekt på blodprop størrelse. Den nuværende metode adresse ikke effekten af tilbage grene, der kan afbrydes ved hjælp af en lav temperatur cautery pen14. Men vi viste at ligatur af IVC og side grene resulteret i konsekvent blodprop dannelse i C57Bl/6. Endelig, som vi tidligere har påvist, høj frekvens ultralyd system giver mulighed for præcis måling af Trombe størrelse og kan anvendes til langsigtede og translationel studier af blodprop dannelse og opløsning12,13 ,15.
En stor ulempe ved modellen stasis er komplet obstruktion af blodgennemstrømningen, hvilket reducerer intravenøst administreret agenter maksimal påvirkning af blodprop og vene væg. Dette bliver et vigtigt spørgsmål, når man ønsker at teste effekten af et farmakologisk agent. Hvis effekten af et bestemt lægemiddel skal testes, ville man foretrækker at bruge stenose model13 eller elektrolytisk model17. Begge modeller producere trombi i overværelse af kontinuerlig blodgennemstrømning, som giver mulighed for afprøvning af nye antikoagulerende agenter for DVT profylakse og behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra hjertet og apopleksi Foundation of Canada og The Morris og Bella Fainman Family Foundation. Forfatterne vil gerne takke Veronique Michaud hendes teknisk hjælp til VEVO770 ultrasound imaging system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 perma-hand silk suture | Ethicon | 706G | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| blunt forceps (straight and curved) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria Spring Scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1ml syringes | BD Biosciences | ||
| 26G needles | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | No longer sold | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Given to LDI by Vet | |
| Surgery Microscope | Leica | Leica M651 | |
| Systan eye oinment | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2x2 sterile Gauze | CDMV | #104148 | |
| Cotton Tip Applicators | from JGH | ||
| Transpore hypoallergenic surgical tape | CDMV | #7411 | |
| Ultrasound gel (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Incubator | From JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment | Dispomed | ||
| Hair remover | Nair | ||
| Water heated hard pad | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar heater water pump TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Infra-red heating lamp | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Mouse rectal temperature prope | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterile water | From JGH |
References
- Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).
- McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).
- Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).
- Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).
- Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).
- Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).
- Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121 (4), 692-699 (2013).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127 (6), 769-777 (2016).
- Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. , (2016).
- Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).
- Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).
