Summary
Protokolls beskriver stegen för att få venös trombos använder en stasis modell. Dessutom använder vi en icke-invasiv metod för att mäta tromb bildande och upplösning över tid.
Abstract
Venös trombos är ett vanligt tillstånd som drabbar 1-2% av befolkningen, med en årlig incidens av 1 på 500. Venös trombos kan leda till döden genom lungembolism eller resultat i den efter trombotiska syndrom, kännetecknas av kronisk bensmärta, svullnad och sår eller kronisk pulmonell hypertension som resulterar i betydande kronisk respiratorisk kompromiss. Detta är den vanligaste kardiovaskulära sjukdomen efter hjärtinfarkt och ischemisk stroke och är en klinisk utmaning för alla medicinska discipliner, som det kan komplicera loppet av andra sjukdomar såsom cancer, systemisk sjukdom, kirurgi och större trauma.
Experimentella modeller är nödvändiga att studera dessa mekanismer. Stasis modellen inducerar konsekvent tromb storlek och en mätbar mängd tromber. Det är dock nödvändigt att systematiskt ligera sidogrenar av sämre vena cava att undvika variationer i tromb storlekar och någon tolkning av felaktiga data. Vi har utvecklat en icke-invasiv teknik för att mäta tromb storlek med hjälp av ultraljud. Med denna teknik, kan vi bedöma tromb utveckling och upplösning över tid på samma djur. Detta synsätt begränsar antalet möss krävs för kvantifiering av venös trombos förenligt med principen om ersättning, begränsning och förfining av djur i forskningen. Vi har visat att tromb vikt och histologisk analys av tromb storlek korrelerar med mätning erhålls med ultraljud. Därför beskriver den aktuella studien hur man framkalla djup ventrombos hos möss med sämre hålvenen stasis modell och hur att övervaka det med hjälp av högfrekvent ultraljud.
Introduction
Venös tromboembolism (VTE), som består av djup ventrombos (DVT) och lungembolism, är den tredje vanligaste dödsorsaken hjärt-efter hjärtinfarkt och stroke. Det är ett vanligt tillstånd som drabbar 1-2% av befolkningen, med en årlig incidens av 1 på 5001. VTE kan leda till: 1) döden genom lungembolism; (2) efter trombotiska syndrom, kännetecknas av kronisk bensmärta, svullnad och sår; eller 3) kronisk pulmonell hypertension som resulterar i betydande kronisk respiratorisk kompromiss. VTE är en fl sjukdom och kan resultera från Stas av blodflödet, skada på kärlväggen, och/eller hypercoagulable medlemsstater på grund av en störning av balansen mellan koaguleringen och fibrinolytiska system, som det har beskrivits över hundra år sedan av Virchow och är känd som den Virchow's Triad.
Eftersom i de flesta fall är det omöjligt att erhålla mänskliga DVT prover, har forskare utvecklat experimentella djurmodeller av DVT. Flera djur inklusive rat2, mus3, kanin4, gris5, hund6och icke-mänskliga primater7 har använts. Möss kan vara genetiskt modifierade och är det vanligaste djuret att studera DVT. Men liksom alla djur, är spontana DVT inte hos möss. Således, fysiska eller kemiska förändringar av ven väggen används för att skapa trombos hos möss. Vi har tidigare använt järnklorid modellen för att inducera trombos i inferior vena cava (IVC) av möss8,9,10. Denna modell har fördelen att tillförlitligt producera ocklusiva tromboser inom några minuter och kan användas för att undersöka betydelsen av antikoagulantia och trombocythämmande läkemedel under akut DVT. Det är dock en terminal förfarande. Således, för att studera akut och kronisk DVT, stasis modellen är mer passande. I denna modell framkallas tromb bildandet av komplett avbrott av blodflödet i IVC, en av faktorerna i Virchow's triad för DVT utveckling. Denna modell kan användas för att studera DVT bildande och upplösning, vilket är en fördel jämfört med FeCl3 modell11.
Vi har utvecklat en icke-invasiv metod att följa tromb bildande och upplösning över tid med hjälp av en mikro-imaging högfrekvent ultraljud system12. Vi har tidigare visat att mätning av venös trombos av ultraljud korrelerar positivt med tromboser erhålls patologiskt. I två efterföljande studier har vi bekräftat att mätningar erhålls med ultraljud korrelerar med tromber vikt och tromb området kvantifieras av histokemi9,10. Viktigare, har vi visat att hög frekvens ultraljud kan användas för att övervaka bildandet av djup ventrombos i möss12. Det kan också användas för att kvantifiera tromb upplösning i ett icke-invasivt sätt.
Här kommer vi att beskriva protokollet tillåter tromb bildas med hjälp av stasis-inducerad trombos musmodell och hur tromb bildandet kan övervakas icke-invasivt över tid med hjälp av högfrekvent ultraljud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av institutionella djur hand kommittén av McGill University Montreal, QC, Kanada. All utrustning som krävs visas i tabell I.
1. murin (C57BL/6J) IVC Stasis protokoll
- Kirurgi förberedelse
Obs: Detta är en överlevnad operation och därför lämplig aseptisk teknik måste följas vid alla tidpunkter. Detta inkluderar att se till att allt material finns till hands, rengöring och sterilisering instrument innan och mellan användning och utse ett sterilt område på arbetsytor för alla sterilt material.- Sterilisera alla kirurgiska instrument och material av autoklav. Ett glas pärla autoklaven är tillräcklig för att sterilisera instrument tips mellan djur, om mer än ett förfarande som görs på en gång.
- Söva 8-10 vecka gammal C57Bl/6 manliga möss med en blandning av 100% syre och 2,5% isofluran.
Obs: Justera flödet av syre och sevofluran som behövs. - Bekräfta anesthetization genom att nypa bakre tass av djur mellan tårna med pincett. Inget svar från nypa anger djuret är sövd.
- Administrera långsam frisättning smärtstillande (buprenorfin) via subkutan injektion. Ge möss en dos av 1 mg av smärtstillande medel per 1 kg kroppsvikt (1 mg/kg).
- Placera ögonsalva på båda ögonen av djuret att säkerställa ingen korneal uttorkning för varaktigheten av förfarandet.
- Administrera 0,2 - 0,5 mL isoton vätska per 10 g kroppsvikt subkutant.
- Fixa djuret att tabellen kirurgi med kirurgtejp. Placera djuret i ryggläge att exponera buken. Utför operationer på en värmedyna att förhindra hypotermi.
- Ta bort hår från magen av musen genom tillämpning av en Hårborttagningscreme för 1-2 min. torka buken rent med gasväv och destillerat vatten, om det behövs.
- Alternativt ta bort håret från buken genom rakning med en liten rakapparat.
- Sterilisera buken med Baxedin (klorhexidin glukonat BP lösning) innan du gör några snitt. Gäller etanol lätt med gasväv att undvika överdriven värmeförluster orsakade av avdunstning av alkoholen.
- Exponering av sämre Vena Cava (IVC)
- Med kirurgisk sax, utföra en laparotomi för att öppna bukhålan.
- Lyfta huden med pincett på nedre delen av magen och göra ett vertikalt snitt parallellt på vardera sidan av linea alba. Gör det första snittet till vänster eller höger om linea alba, beroende på handanvändning av operatören. Snittet görs från mittlinjen att bistå i ultraljud imaging senare.
- Göra ett andra horisontella snitt längst upp i buken.
Obs: Vid penetration in i buken, muskulaturen bör vara ”tented” och sedan trängde in med kirurgisk sax för att förhindra att bukorganen. - Upprepa de lodräta och vågräta snitt på buken muskellagrar av djuret. Tänk på att tält muskulaturen under penetration in i buken för att inte skada organen under.
Försiktighet: Lyft hud och muskler från tarmar och andra inre organ när att göra snitt så att inte punktera dem.
- Vik hud och muskel från snittet att exponera bukhålan.
- Applicera gasväv, fuktas med isoton lösning, på sidorna av såret öppningen och yttre tarmarna. Sätta press på båda sidor av buken att bistå externalisering av tarmarna. Använd mjuka rörelser med bomull tip applikator för att flytta tarmarna. Blöt kompress i isoton lösning och placera den över externalized tarmarna.
- Gasbinda bör före fuktas innan placering vävnad.
- Flytta undan något peritoneal fett, och utsätta IVC mellan njur- och iliaca venerna.
- Gör en inledande identifiering av uppenbara sidogrenar. En sida gren visas som mindre, men betydande ven som grenar från IVC, mellan nedsatt och iliaca vener. Blodkärlen kan variera kraftigt mellan möss. Möss kan ha sidogrenar närvarande på ena eller båda sidorna av IVC.
- Med kirurgisk sax, utföra en laparotomi för att öppna bukhålan.
- Ligering av sidogrenar
Obs: Om det finns sidogrenar följs följande procedur för var och en. Om inte, gå vidare till steg 4: Initial suturen placering enligt IVC. Webbplatsen ligering av IVC blir omedelbart distalt i vänster nedsatt ven, oavsett förekomsten av sidogrenar.- Utför trubbig dissektion på varje sida av grenen sida. Trubbig dissektion är processen med att upprepade gånger öppna trubbig pincett med lätt tryck, så att bryta igenom fascia utan att skada omgivande fartyg.
Varning: Undvika punktering eller venen. - Lyft grenen och passera ett avsnitt av 6-0 silk suturen under venen. Alltid ta hand vid lyft eller förflyttning fartyg. Det är bäst att ta tag i fettet runt kärlen, annars finns det en risk att skada fartyget.
- Använda suturen pincett, göra en kirurgisk ligation runt grenen sida använder standard kirurgiska knot knyta teknik. Full ligering görs för att säkerställa 100% ocklusion av venen. Använd minst tre kopplingsförbehåll kast för att säkerställa ligation är säkert.
- Upprepa steg 1.3 för eventuella återstående sidogrenar.
- Utför trubbig dissektion på varje sida av grenen sida. Trubbig dissektion är processen med att upprepade gånger öppna trubbig pincett med lätt tryck, så att bryta igenom fascia utan att skada omgivande fartyg.
- Dissektion av bukaorta från IVC
- Utför trubbig dissektion runt IVC omedelbart distalt från den vänstra njurvenen. Bukaorta är kopplad till IVC via fascia, därför utföra inledande trubbig dissektion runt både IVC och bukaorta.
Försiktighet: Undvika punktering eller venen. Inte brista eller punktera antingen fartyg. Detta är den mest kritiska delen av förfarandet med den högsta risken för kärlskada. - Fortsätta att gälla lätt tryck via trubbig dissektion tills ett tydligt fönster görs mellan stora kroppspulsådern och IVC.
- Utför trubbig dissektion runt IVC omedelbart distalt från den vänstra njurvenen. Bukaorta är kopplad till IVC via fascia, därför utföra inledande trubbig dissektion runt både IVC och bukaorta.
- Sutur placering och IVC ligatur
- Passera ett avsnitt av 6-0 silk suturen under IVC och bukaorta.
- Leta upp sutur genom fönstret skapas mellan IVC och aorta. Använd tång för att dra suturen och tråd det mellan bukaorta och IVC. Gänga sutur genom noggrant, försöker att inte dra/punktering av IVC och bukaorta.
- Göra en kirurgisk ligation runt IVC med sutur pincett, säkerställa en total ocklusion av venen. Återigen, gör ligering omedelbart distalt från den vänstra njurvenen.
- Gör tre suturen kast att säkra ligering.
Obs: Det är också möjligt att passera suturen under IVC och aorta före separera två som ett alternativ. 7-0 Prolene suturer kan alternativt användas för ligering av sidogrenar och IVC.
- Sårslutning och postoperativ vård
- Kontrollera att bukaorta har lämnats utan avbrott och att alla sidogrenar har varit sammanskrivna. IVC visas vidgade distala från webbplatsen ligering och inget blod flöde kommer att vara synlig.
- Placera alla peritoneal fett och tarmarna tillbaka i bukhålan.
- Nära såret med sutur pincett och 6-0 silk suturen. Använd en rinnande sutur (enkel kontinuerlig) och säkerställa att suturen inte blir för trång. En tight sutur kommer att brista när djuret vaknar upp och flyttar runt sin bur.
- Alternativt använda PDS, Ethilon, Vicryl, Moa eller rostfritt stål klipp för tillslutning av sår.
- Sutur lagret av bukmuskeln först med lämplig sutur kopplingsförbehåll teknik.
- Upprepa sutur teknik för huden och verifiera sårslutning räcker.
Obs: Om du använder samma suturen nål och tråd för flera djur, sterilisera både i 70% etanol före varje användning. - Ta bort djuret från narkos gas och placera dem i en inkubator med 34 ° C i minst 30 minuter.
- Igen, administrera 0,2 - 0,5 mL isoton vätska per 10 g kroppsvikt subkutant. Vätskor kan ges i följande dagar att behålla preoperativ kroppsvikt, om nödvändigt.
- Övervaka djuret tills återhämtning att säkerställa framgångsrika kirurgi och bedöma den allmänna hälsan hos djuret.
Varning: Förvänta sig en liten krökt kroppshållning för en invasiv förfarande som denna, men djuret beter sig normalt så tidigt som 30 minuter efter operationen. - Placera djuret i sin egen bur och placera den inte med andra djur tills återhämtat sig helt.
- Re administrera smärtstillande dagligen för upp till 48 h postop.
- Placera mat på golvet i buren den animaliska tag i återhämtning. Andra särskilda vård behövs vanligen inte.
- Granska webbplatsens sår för rodnad, svullnad, eller ansvarsfrihet och några andra tecken på infektion.
- Om det behövs ta bort suturer efter 7-10 dagar.
- Utföra eutanasi omedelbart om operationen misslyckas (t.ex. signifikant fartyget skada och/eller blod förlust) eller djur inte förbättras med postoperativ vård. Eutanasi utförs vanligtvis på 48 h postop. För längre experiment, använda 7-0 Prolene för att ligera sidogrenar och IVC och 5-0 Vicryl suturer Stäng bukhålan.
- Utföra eutanasi genom anesthetization av djuret i en induktion som tidigare beskrivits, utom på 5% isofluran. Detta följs av kvävning med 100% CO2 medan bedövas.
- Efter bekräftelse av dödshjälp genom kvävning (förlust av hjärtslag och ingen andning), utföra cervikal dislokation för att säkerställa fullständig dödshjälp.
2. hög frekvens ultraljud protokoll
Obs: Detta protokoll är anpassade från Lady Davis Institute gnagare fenotypning Core SOP för hög frekvens ultraljudsundersökningar. Detta protokoll genomförs 24 h postoperativt, men kan göras förr så länge djuret svarar väl till kirurgi. Protokollet kan utföras när som helst på friska möss och ofta görs så att jämföra före och efter operation.
-
Beredning av djur
- Placera djuret i en induktion kammare och söva djuret med en blandning av 100% syre och 2,5% isofluran.
- Slå på puls och temperaturvakt. Ställning värmelampa över bord att hålla djur varm under förfarandet.
- Ta bort djuret från induktion kammaren och tillämpa öga smörjmedel för att förebygga korneal uttorkning. Placera djuret på analys-plattformen och anbringa bedövningsmedel röret till djurets mun/näsa.
- Varma ultraljud gel till 37 ° C och placera gelen på magen av djuret. Ultraljud gelen är värmas med hjälp av ett vatten-värmesystem att pumpar varma vatten genom spolar som är lindade runt flaskan med gel.
- För mätningar av hjärtfrekvens (vid behov), pålagt analys plattformen 4 elektroder elektrodgel och fixa tassarna djurets plattform/elektroderna med kirurgisk tejp. Placera djuret i ryggläge för avbildning av IVC. Ultraljudet imaging system inkluderar en analysplattform som värms och innehåller elektroder för övervakning av djuret.
- För temperaturmätningar, sätta elektrodgel på termometern och infoga i rektum från djuret.
- Justera värmelampa och isofluran som krävs för att säkerställa att djuret är bekväm, har en respiration mellan 30-70 bpm och hålls vid 37 ° C.
- Om nödvändigt, raka buken av djur eller ta bort hår med hårborttagningskräm. Applicera 1-2 minuter och torka rent med gasväv och destillerat vatten.
Obs: För mycket hår kan påverka kvaliteten på bilderna. - Placera gasbinda under eller vid sidan av djuret att fånga någon överflödig ultraljud gel.
-
Imaging av IVC och tromb
- Slå på avbildningsprogrammet och påbörja en ny studie.
- Välj en lämplig skanningshuvud för avbildning. Den skanningshuvud som används här är för bukorganen (frekvens: 35 MHz, brännvidd: 12,8 mm).
- Registrera all relevant information om djuret. Detta kan omfatta djur-ID, kön, vikt, födelsedatum, stam, etc.
- Sänk skanningshuvud ner tills det är rörande ultraljud gelen på djuret.
- Starta skanningshuvud sonden för att påbörja 2D-avbildning av djuret. I det här läget presenteras bilder som två dimensioner, i olika nyanser av grått.
- Hitta IVC och bukaorta genom att flytta musen plattformen under hela den x- eller y-planet, medan du också flyttar skanningshuvud genom z-planet.
Obs: Blod fartyg visas med deras väggar vita och blodet inuti nästan svart. Bukaorta kommer att pulsera intensivt och har tjockare väggar, medan IVC kommer har tunnare väggar och komprimera/expandera enkelt på bilden skärmen när skanningshuvud flyttas och ned. Webbplatsen för ligering skall framgå, som venen kommer vara dilaterade och ven väggen kommer till en punkt. Någon tromb bildas inuti blir fast under ultraljudsundersökningar och komprimeras inte enkelt som ven väggen gör. Venen kommer att komprimera endast över den ligering, där ingen tromb bildas. - Vid lokalisering av IVC och webbplatsen ligatur, centrera dem på brännpunkten av ultraljud, för att uppnå den mest korrekta bilden.
- Om bilden är för mörkt för att se klart, justera gelen och avlägsna eventuella luftbubblor med bomull tip applikator.
- Om det behövs, luta skanningshuvud 45° åt vänster eller höger och justera djur plattformen för att tydligt se venen. Detta görs om det är störningar med skanningshuvud. I det här fallet behöver venen avbildas på en sida-vinkel att undvika suturen.
Obs: Bilden störningar orsakas oftast av mörka fläckar på huden på djuret, dålig såret suturen placering eller bubblor i ultraljud gel.
- Använda programvaran, ta bilder av någon önskad strukturer och göra mätningar mätning verktyg. Gemensamma mått inkluderar tvärsnittsarea i tromben eller bredden på webbplatsen ligering.
- Ändra imaging läge att Pulse-wave Doppler att göra blod flöde mätningar. Detta läge tillåter bildtagning av vaskulär blodflödet och mätning av flödeshastigheten, bland andra variabler.
- Tilt analys plattformen för att sänka den bakre utgången av djuret.
- Ändra vinkel/position skanningshuvud så att det kommer att kontakta gelen i en vinkel på ca 30° från den bakre änden av djuret.
- Flytta djur plattform och skanningshuvud. Flytta den IVC och ligering vid behov.
- Gör blod flöde mätningar runt ligering platsen att bekräfta stasis och ta några bilder som önskas. Gemensamma mätningar av blodflödet omfatta genomsnittliga hastighet, maximal hastighet eller median hastighet.
- Spara alla mätningar eller bilder tagna.
-
Sanering och djurs återhämtning
- Höja den skanningshuvud utgångsställning och flytta djur plattform till dess ursprungliga position samt.
- Ta bort överflödigt gel off djuret med gasbinda. Gör detta försiktigt så att såret suturen inte kommer vara spruckit.
- Ta bort termometern från djurets ändtarmen och ta djuret på plattformen.
- Placera djuret i sin bur och en 34 ° C inkubator.
- Övervaka djuret tills återhämtning. Förfarandet är mycket mindre och icke-invasiv. Djuret kommer att vakna upp snabbt. Fortsätta att övervaka djur under de följande dagarna enligt punkt 1.6 i detta protokoll.
- Ren den animaliska plattformen med gasväv och desinfektionsmedel.
- Torka skanningshuvud rengör med gasväv och destillerat vatten.
Varning: Rengör skanningshuvud mycket försiktigt och endast med destillerat vatten. - Upprepa steg 2 för nästa djuret.
- Om gjort med alla ämnen, kontrollerar du att alla bilder och inspelningar har sparats. Stäng sedan av all utrustning och programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stasis venös trombos modell
Möss är sövda i stasis modellen, och ett snitt att exponera den sämre vena cava (IVC). Snittet görs på vänster eller höger sida av musen i stället för en mittlinjen laparotomi på ett sätt som inte skulle störa ultraljud sonden. Magmusklerna och huden är vik tillbaka för att exponera IVC (figur 1). Första är sida grenar sammanskrivna med en 6-0 silk sutur (figur 2). Sedan IVC separeras från aorta med trubbig dissektion och silke är placerade runt IVC (figur 3A-C). IVC är sammanskrivna med en 6-0 silk sutur. Dilatation av IVC nedanför webbplatsen ligatur är en indikation på framgångsrika avbrott av blodflödet (figur 3D). Slutligen är bukhålan och huden sys tillbaka på ett kontinuerligt sätt (figur 3E).
Övervakning av tromb bildas med hjälp av ultraljud
Som vi visat tidigare, kan högfrekvent ultraljud, som vanligen används för att bedöma venös trombos i kliniska inställningar, användas för att mäta tromb bildande och upplösning över tid i en experimentell murina modell. Vi använde en hög frekvens mikro-imaging system12. Före ligering, kan IVC identifieras i vyn längsgående. Efter ligering av venen, kan framgången för förfarandet visualiseras. PW-Doppler läget kan användas för att bestämma blod flödeshastighet innan (34,8 mm/s) och efter (5,6 mm/s) ligering. Eftersom tromboser är tätare än flyter blod, vi kunde uppskatta den bildade tromben inuti den IVC använder ultraljud, 24 timmar efter ligation (figur 4A). Ultraljud möjliggör kvantifiering av hastigheten av blodflöde i kärlen med färg Doppler. Som visas i figur 4B, kan vi mäta flödet i venen före ligering och uppskattar ett avbrott i flödet efter ligering, när tromben bildas. Data från vårt laboratorium visar en genomsnittlig tromb storlek på 4.85 ± 0,22 mm2 på 24 timmar och 5,05 ± 0,47 mm2 på 48 timmar (medelvärde ± SEM).
Figur 1. Stasis modell: förfarandet att exponera den sämre hålvenen. (A) mus hår från buken tas bort med hårborttagningskräm. (B) en första snittet görs på vänster sida av buken och en andra ventrala en (C) från vänster till höger. (D) en våt sterila blick används exteriorize tarmarna och exponera den sämre vena cava (IVC) och sida gren (SB). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Stasis modell: förfarandet att ligera grenen sida. (A) exposition av IVC och SB. (B) placering av suturen silke under den SB. (C) Ligation av den SB. LRV: vänster nedsatt ven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Stasis modell: förfarandet att ligera den sämre hålvenen. (A-B) Trubbig dissektion att separera IVC från aorta. (C) placering av suturen silke under IVC. (D) ligering av IVC. Dilatation av IVC observeras. (E) magmusklerna och huden är stängda separat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Övervakning av tromb bildas med hjälp av ultraljudsundersökningar. (A) representativa ultraljud bilder före, omedelbart efter och 24 timmar efter ligering av IVC. (B) företrädare bilder av blod flöde hastighet avbildas med färg Doppler med färgbehandling. Omfattningen av färgkodade blod flöde varierar från rött till gult att skildra högt till lågt flöde. I ligated djuren avbildas avsaknad av flödet av avsaknaden av färg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I området i närheten finns det flera kritiska steg för lyckad venös tromb bildas med hjälp av stasis modellen. Induktion av ventrombos är mer utmanande i gamla möss på grund av ansamling av fett kring den sämre vena cava och aorta. Möss som genomgår detta förfarande bör helst vara 8 - 10-veckor gammal. Stor omsorg bör tas inte att inducera endoteliala skador i IVC under trubbig dissektion och ligatur. Dessutom är det avgörande att hålla djuret i en inkubator med 34 ° C i minst 30 minuter efter operationen och att återgå till företaget av andra djur först efter fullständig återhämtning. När operationen görs korrekt, fungerar djuren anmärkningsvärt väl under postoperativ vård. De uppvisar inga allvarliga biverkningar såsom hälta, pares eller inkontinens. De kan uppvisa minskad rörlighet och en något krökt kroppshållning genast efter operationen, men detta ses inte ofta så länge smärtstillande är effektiv och operationen utförts korrekt.
Stasis modellen producerar en stor tromb med reproducerbara storlek mätningar från en mus till en annan. Som hos människor, anatomi av det venösa systemet varierar mellan möss och frågan om IVC gren avbrott har nyligen tagits upp i stenos och stasis modellerna DVT13,14. Brandt et al. visade att tromb bildandet induceras av flöde begränsning hindrades när sidogrenar var belägna på < 1,5 mm av webbplatsen IVC ligering. Dock påverkades DVT bildandet induceras av flöde begränsning hos möss inte av sida gren ligering13,15,16. Det rapporterades också att variabilityen av IVC sida grenar i C57Bl6 mus stam har en viktig inverkan på tromb bildas induceras av komplett ligering av IVC14. Det konstaterades att inte ligating sida grenar resultat i statistiskt mindre propp storlek jämfört med kontroller med sammanskrivna sidogrenar. Vår studie tyder också på att ligering av sida grenar producerade konsekvent tromb-formation och storlek. Den vanligaste anatomiska variationen i C57Bl/6 är dock förekomsten av 2 tillbaka grenar (98% av mössen)14. Det visades att avbryta tillbaka grenar har störst inverkan på tromb storlek. Den nuvarande metoden upp inte effekten av bakre grenar, som kan avbrytas med en låg temperatur diatermi pennan14. Vi visade dock att ligering av IVC och sida grenar resulterade i konsekvent tromb formation i C57Bl/6. Slutligen, som vi tidigare har visat, högfrekvent ultraljud systemet tillåter exakt mätning av tromb storlek och kan användas för långsiktiga studier av tromb bildande och upplösning12,13 ,15.
En stor nackdel av stasis modellen är fullständig obstruktion av blodflödet, vilket minskar den maximala effekten av intravenöst administrerad agenter på tromber och ven väggen. Detta blir en viktig fråga när man vill testa effekten av en farmakologisk agent. Om effekten av en specifik drog måste testas, skulle man föredrar att använda stenos modell13 eller elektrolytisk modell17. Båda modellerna producerar tromboser i närvaro av kontinuerlig blodflödet, vilket möjliggör testning av nya antikoagulantia agenter för DVT profylax och behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd genom bidrag från hjärtat och Stroke Foundation of Canada och The Morris och Bella Fainman Family Foundation. Författarna vill tacka Veronique Michaud hennes teknisk hjälp med VEVO770 ultraljud imaging system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 perma-hand silk suture | Ethicon | 706G | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| blunt forceps (straight and curved) | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria Spring Scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1ml syringes | BD Biosciences | ||
| 26G needles | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 High Resolution Imaging System | Visualsonics | No longer sold | |
| SR Buprenorphine | ZooPharm | Given to LDI by Vet | |
| Surgery Microscope | Leica | Leica M651 | |
| Systan eye oinment | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2x2 sterile Gauze | CDMV | #104148 | |
| Cotton Tip Applicators | from JGH | ||
| Transpore hypoallergenic surgical tape | CDMV | #7411 | |
| Ultrasound gel (Aquasonic-100) | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| Incubator | From JGH | ||
| Isoflurane | Dispomed | ||
| Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment | Dispomed | ||
| Hair remover | Nair | ||
| Water heated hard pad | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar heater water pump TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| Infra-red heating lamp | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| Mouse rectal temperature prope | emkaTECHNOLOGIES | ||
| Sterile water | From JGH |
References
- Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).
- McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes by experimental venous thrombi. Thromb Haemost. 85 (6), 1018-1024 (2001).
- Singh, I., et al. Failure of thrombus to resolve in urokinase-type plasminogen activator gene-knockout mice: rescue by normal bone marrow-derived cells. Circulation. 107 (6), 869-875 (2003).
- Itoh, K., Ieko, M., Hiraguchi, E., Kitayama, H., Tsukamoto, E. In vivo kinetics of 99mTc labeled recombinant tissue plasminogen activator in rabbits. Ann Nucl Med. 8 (3), 193-199 (1994).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89 (2), 256-263 (2003).
- Knight, L. C., Baidoo, K. E., Romano, J. E., Gabriel, J. L., Maurer, A. H. Imaging pulmonary emboli and deep venous thrombi with 99mTc-bitistatin, a platelet-binding polypeptide from viper venom. J Nucl Med. 41 (6), 1056-1064 (2000).
- Wakefield, T. W., et al. Venous thrombosis prophylaxis by inflammatory inhibition without anticoagulation therapy. J Vasc Surg. 31 (2), 309-324 (2000).
- Robins, R. S., et al. Vascular Gas6 contributes to thrombogenesis and promotes tissue factor up-regulation after vessel injury in mice. Blood. 121 (4), 692-699 (2013).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Bertin, F. R., Blostein, M. D. Prostaglandin E synthase is upregulated by Gas6 during cancer-induced venous thrombosis. Blood. 127 (6), 769-777 (2016).
- Laurance, S., et al. Gas6 (Growth Arrest-Specific 6) Promotes Inflammatory (CCR2hiCX3CR1lo) Monocyte Recruitment in Venous Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. , (2017).
- Diaz, J. A., et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 556-562 (2012).
- Aghourian, M. N., Lemarie, C. A., Blostein, M. D. In vivo monitoring of venous thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (3), 447-452 (2012).
- Brandt, M., et al. Deep vein thrombus formation induced by flow reduction in mice is determined by venous side branches. Clin Hemorheol Microcirc. 56 (2), 145-152 (2014).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemost. 13 (4), 660-664 (2015).
- Luther, N., et al. Innate Effector-Memory T Cell Activation Regulates Post-Thrombotic Vein Wall Inflammation and Thrombus Resolution. Circ Res. , (2016).
- Subramaniam, S., et al. Distinct contributions of complement factors to platelet activation and fibrin formation in venous thrombus development. Blood. 129 (16), 2291-2302 (2017).
- Diaz, J. A., et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104 (2), 366-375 (2010).
