Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de constrição transversal da aorta (TAC) através de uma toracotomia lateral. Esta técnica é um procedimento cirúrgico minimamente invasivo, fechado no peito, com o objetivo de simular a sobrecarga de pressão e de insuficiência cardíaca em ratos utilizando as configurações padrão de laboratório de TAC.
Abstract
Pesquisa sobre a hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca baseia-se frequentemente a modelos de rato sobrecarga de pressão induzidos pela TAC. O procedimento padrão é a realização de uma toracotomia parcial para visualizar o arco aórtico transverso. No entanto, o trauma cirúrgico causado pela toracotomia em modelos de peito aberto altera a fisiologia respiratória como as costelas são dissecadas e deixou solteira após fechamento do peito. Para evitar isso, estabelecemos uma abordagem minimamente invasiva, fechado no peito através de toracotomia lateral. Aqui nos aproximamos da aorta através do espaço intercostal 2nd sem entrar nas cavidades torácica, deixando o mouse com uma lesão menos traumática para recuperar. Realizamos esta operação usando as configurações padrão de laboratório para procedimentos de peito aberto TAC com as taxas de sobrevivência igual. Além de manter os padrões de respiração fisiológica devido a abordagem de peito fechado, os ratos parecem beneficiar, mostrando recuperação rápida, como a técnica menos invasiva aparece para facilitar um processo de cura rápido e reduzir a resposta imune após trauma.
Introduction
Modelos de mouse são frequentemente usados para imitar doenças humanas1. Constrição da aorta transversa (TAC) é usada para induzir sobrecarga de pressão e hipertrofia de ventrículo esquerdo2. O modelo de TAC de peito aberto em camundongos foi validado por Rockman et al 3 e o procedimento cirúrgico é descrito em detalhes por DeAlmeida et al 4. faixas da aorta transversa é mais favorável em comparação com a constrição da aorta abdominal, porque uma parcela maior da circulação pode compensar os efeitos negativos deste último procedimento2.
A borda da aorta transversa leva a um aumento da pressão arterial na aorta ascendente e artéria Braquiocefálica mas deixa suficiente perfusão dos órgãos através dos vasos distais (ou seja, a artéria carótida comum esquerda, a subclávia esquerda artéria e aorta descendente). Isto leva a uma aumentada pós-carga cardíaca e um estresse de parede cardíaca elevada. O estresse de parede posteriormente diminui devido ao espessamento de fibra5. A alteração hemodinâmica cardíaca crônica resulta em alostática e dilatação do ventrículo esquerdo. Desta forma o TAC cria um modelo reproduzível de hipertrofia cardíaca levando a insuficiência cardíaca.
O procedimento padrão para TAC como descrito por DeAlmeide et al . 4 aproxima-se da aorta através de uma toracotomia parcial superior através de dissecação de costelas ou do esterno e entrar do mediastino, bem como a cavidade pleural. Isto permite uma boa visão da aorta e seus ramos colaterais. Infelizmente, as costelas dissecadas não podem ser recolocadas, o que deixa-los flutuar livremente e, assim, alterar a dinâmica da respiração.
Nós, portanto, estabelecida uma abordagem minimamente invasiva de peito fechado para o arco aórtico, usando uma abordagem cirúrgica lateral através do espaço intercostal 2nd . A maior vantagem deste modelo é a capacidade de executar o TAC sem mesmo corte pelas costelas. O trauma cirúrgico é limitado para a incisão da pele e a dissecação dos músculos intercostais. Este procedimento minimiza o trauma em si e ajuda a manter a estabilidade adequada no peito.
Aqui descrevemos um procedimento passo a passo detalhado para realizar cirurgia de TAC em camundongos sem executar o total ou a toracotomia superior. Doppler de alta frequência foi usado para garantir o sucesso do TAC como descrito anteriormente, 6,7.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética para experimentação de Animal LANUV Recklinghausen (#84-02.04.2016.A374). Geralmente, este procedimento é realizado em ratos adultos > 10 semanas de idade. No entanto, é possível realizar essa cirurgia em animais mais jovens também. Instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados antes do uso, e todas as etapas devem ser executadas sob condições assépticas.
1. indução da anestesia e intubação
- Injete o peso do corpo de buprenorfina 0,1 µ g/g intraperitonealmente para alívio da dor. Repita as injeções intraperitoneal de buprenorfina 0,1 mg/kg cada 8 h para os próximos três dias após a cirurgia.
- Por indução, posicione o mouse em uma caixa de indução de anestesia que está conectada para o vaporizador conjunto 3,0% Vol de isoflurano com um fluxo de oxigênio de 1 L/min.
- Certifique-se de profunda narcose por induzir um estímulo tátil.
Nota: Aumento Vol % de isoflurano até 5%, se falha de indução de anestesia ou narcose não é suficientemente forte. - Belisca o rabo do rato para garantir a ausência de reflexa. Em caso de total ausência de reflexos, pesar o mouse para a instalação do ventilador ideal (ver 1.12).
- Mova o mouse para uma mesa de operação temperatura controlada para manter a temperatura corporal de 37 ° C durante todo o procedimento.
- Coloque o nariz do mouse em um cone de plástico que está ligado à caixa de indução de anestesia para manter a narcose.
- Corrigi os incisivos superiores do mouse com uma sutura de nylon. Fixa as extremidades com uma fita adesiva.
- Aplica pressão sobre a pata traseira com a ponta da pinça para garantir uma adequada narcose novamente. Na ausência de um reflexo de retirada, prossiga com as etapas a seguir.
Nota: Aumentar volume % de isoflurano se falha de indução de anestesia ou narcose não é suficientemente forte e esperar que a ausência do reflexo de retirada. - Coloque lubrificante oftálmico estéril sobre as córneas para evitar dessecação sob anestesia.
- Lubrifique a sonda rectal para evitar trauma retal. Inserir uma sonda de temperatura retal para garantir uma temperatura de 37 ° C.
- Depilar a garganta e a parte superior do tórax com creme depilatório de acordo com as instruções do fabricante. Limpe o creme após 1 min. Se necessário, repita este passo até o sucesso.
Nota: Use cotonetes com ponta de algodão, em caso de sangramento. - Limpe a área depilada com etanol a 70%. Em seguida, aplique iodo-povidona para desinfecção de pele local 3 vezes e pelo menos de 3 min.
- Ajuste as configurações do ventilador para parâmetros fisiológicos. Defina a taxa respiratória de 150/min e Volume tidal para 8-10 µ l/g de massa corporal (BW).
- Colocar um novo par de luvas estéreis. Coloque o mouse sob um microscópio cirúrgico e coloque um pano fenestrado estéril sobre o mouse.
- Faça uma incisão na pele em linha média cerca de 3 mm sob o mandibular até a costela 2nd . Identifica a linha média e os tecidos conjuntivos da glândula submandibular. Em seguida, use fórceps intracapsular angular delicadamente divide a glândula na linha sem rodeios com duas pinças e explorar o músculo traqueal.
- Prepare a traqueia suavemente, separando os músculos para-traqueal sem rodeios com fórceps intracapsular.
- Puxe a língua com fórceps para endireitar a garganta para as condições de intubação fácil e suavemente Introduza uma cânula de intubação (OD 1.2 mm) dentro da traqueia. Confirme a intubação por visualização direta do tubo dentro da traqueia e verificando o movimento adequado no peito.
- Ajuste a concentração de isoflurano após intubação de 2% de isoflurano com um fluxo de 1,0 L/min e 100% O2.
Nota: Se os movimentos de respiração não pare ou ratos mexe, primeiro aumente a frequência respiratória até 180/min. Se necessário, aumente a concentração de isoflurano em até 3,5% secundariamente até o mouse para de respirar por conta própria. Avalie as fugas ou preenchimento inadequado do vaporizador como os problemas mais comuns. - Alternativamente, realize intubação como sugerido nas etapas a seguir sub.
- Posicione o mouse sobre uma mesa em um ângulo de 60°.
- Fixar as extremidades do mouse com fita adesiva e reclinar a cabeça.
- Coloque uma fonte de luz fria diretamente sobre a pele acima da laringe.
- Puxe a língua suavemente com fórceps para visualizar as cordas vocais.
- Inserir um tubo de plástico de uma cânula-IV (24 G) através de cordas vocais e ligar o tubo plástico para as configurações do ventilador.
- Conecte o ventilador da cânula para confirmar a intubação por synchrone movimentos de peito.
Nota: Se os movimentos de respiração não pare ou ratos mexe, primeiro aumente a taxa respiratória até 180 por min. Se necessário, aumente secundariamente a concentração de isoflurano em até 3,5% até o mouse para de respirar por conta própria. Avalie as fugas ou preenchimento inadequado do vaporizador como os problemas mais prováveis.
2. pré-operatório Doppler medição
- Prepare-se ambas as artérias carótidas que leigos adjunto para a traqueia puxando levemente o tecido conjuntivo separados com fórceps.
- Coloque a ponta da sonda MHz Doppler 20 com algum gel de ultra-som estéril à direita e a carótida esquerda em um ângulo menor que 45°.
- Gire lentamente a sonda para movê-lo lateral e medial para encontrar um sinal Doppler e incline a sonda para otimizar o sinal.
- Use um software de Doppler para exibir e armazenar velocidades de fluxo nas artérias carótidas comuns direita e esquerdas em um computador.
3. toracotomia
- Use um conjunto de luvas esterilizadas para cada mouse individual para prevenir infecções do sítio cirúrgico.
- Expanda a incisão da pele até o espaço intercostal 2nd com uma tesoura.
- Identificar o espaço intercostal 2nd visualmente pela contagem das costelas e então sem rodeios penetrar neste espaço com fórceps intracapsular.
Nota: 1st costela está localizada abaixo da clavícula e, portanto, não é visível porque o espaço intercostal 2nd encontra-se entre a primeira costela visível (isto é, 2nd costela) e a costela de 3rd . - Abra o espaço intercostal 2nd com a ajuda de dicas de fórceps e inserir os afastadores.
- Ajuste os afastadores com uma faixa de borracha ligada à mesa de operações para ter uma visão clara do timo.
- Em caso de sangramento use uma ponta de algodão e pressione sobre os vasos superficiais por 2 min.
4. borda da Aorta transversa
- Ajuste a ampliação para 200% para identificar a linha média e os tecidos conjuntivos. Em seguida, use fórceps angular suavemente dividir o timo. Remova o tecido adiposo até o arco aórtico pode ser visto claramente.
- Prepare um túnel com angulado Pinca sob a aorta transversal entre a artéria Braquiocefálica e artéria carótida comum esquerda (ver Figura 1). Segure a extremidade de uma sutura 6.0 com a ajuda de uma pinça fina e passe a linha sob o arco aórtico.
- Leve o thread com a segunda pinça do outro lado do arco.
- Cortar uma parte longa de 3 mm de comprimento de um 27 G usar a agulha como um espaçador para TAC-ligadura para ratos com peso entre 19-25 g de massa corporal e uma agulha 26G como um espaçador para ratos > 25 g BW.
- Cuidadosamente coloque o espaçador paralelo à aorta transversa.
- Preparar um nó duplo solta o espaçador e garantir o posicionamento ideal do espaçador em paralelo para a aorta. Em seguida, amarre o primeiro lance e executar rapidamente um segundo lançamento contrário. Retire o espaçador de imediato.
- Para executar a farsa ratos de controle, siga o mesmo protocolo, omitindo a ligadura da aorta.
- Feche o espaço intercostal 2nd com uma sutura de polipropileno 6.0. Atenção especial para os vasos subclávios quando ligar.
- Sutura da pele usando uma sutura de polipropileno 6.0 em um padrão de sutura contínua.
5. a confirmação de sucesso da ligadura da Aorta transversa
- Coloca uma sonda MHz Doppler 20 em ambos os lados do pescoço em um ângulo de 45° como na seção 2.
- Documente as velocidades de fluxo em cada lado.
Nota: Um TAC bem sucedido pode ser validado pela velocidade de fluxo Doppler como mostrado na Figura 2. Uma relação de velocidade do fluxo de 4-10, entre a artéria carótida direita e esquerda geralmente garante TAC adequado (ver Figura 2).
6. colheita de coração
- Induzem narcose de acordo com as etapas 1,2. e 1.3.
- Coloque o mouse em uma câmara de eutanásia e ajustar a taxa de fluxo de dióxido de carbono para deslocar 10-30% do volume/minuto.
- Fixa o mouse sobre uma mesa de cirurgia. Abra o abdômen com tesoura e colheita de sangue da veia cava inferior com uma cânula para posterior análise.
- Corte o diafragma e o osso esterno com uma tesoura forte e retirar o coração.
- Remova todos os arteriais e tecido conjuntivo antes da pesagem do coração.
- Separar o ventrículo direito e o septo do ventrículo esquerdo e pesar ambas as amostras.
- Congele as duas amostras de tecido em nitrogênio líquido.
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Representative Results
Uma bem sucedida TAC garante a indução de sobrecarga de pressão e hipertrofia ventricular esquerda. Uma validação ad hoc de sobrecarga de pressão pode ser alcançada usando a medição de velocidade de fluxo Doppler, como mostrado na Figura 2. Enquanto a velocidade do fluxo de sangue pré-operatório é igual em ambas as artérias carótidas, TAC faz com que uma velocidade aumentada do sangue na artéria carótida direita devido à elevada pressão no ventrículo esquerdo e aorta enquanto causando a velocidade do fluxo de sangue atenuada pós estenóticas na artéria carótida esquerda.
A eficácia do TAC e sua hipertrofia resultante foi validada por cálculo de coração peso corporal peso rácios (HW/BW; mg/g) de camundongos C57BL/6J do sexo masculino no pós-operatório de dia 3, 6 e 21 dias. Os rácios de HW/BW aumentaram significativamente em camundongos TAC comparados com ratos não-atado 6 dias após a cirurgia (4,78 ± 0,18 vs7.66±1,43 mg/g, p < 0,0001). Esta relação foi quase constante após 21 dias (4,8 ± 0,11 vs7.81 ± 0,65 mg/g, p < 0,0001) (ver Figura 3). A taxa de sobrevivência é principalmente dependente do sangramento intra-operatório: pode ser reduzido para menos de 5% através da prática regular. A taxa de sobrevivência após 21 dias depende principalmente do genótipo. Para os ratos não sofre de doenças funcionais do coração, os montantes de taxa de sobrevivência a > 85%. A taxa de sobrevivência nas camundongos C57BL/6J apresentados após 21 dias foi de 88%.
Função cardíaca e pressão arterial sistólica foi medido em anestesia de intubação e realizada com um 1.4 pressão francês condutância cateter8 como descrito por outros. 9 a frequência cardíaca (FC) tem um efeito significativo na esquerda contratilidade ventricular de (LV). Não houve diferença nas taxas de coração (HR) de aórtica ratos com anilhas anilhas e não-aórtica (p = 0.1456) após 21 dias ( Figura 4A). Uma constante de borda da aorta (p = < 0,0001) foi comprovada por uma maior pressão arterial sistólica, medida após 21 dias ( Figura 4B).
Como foi discutido na literatura, camundongos C57BL/6J são comumente conhecidos para desenvolver hipertrofia excêntrica com disfunção sistólica10 após TAC. Verificou-se um aumento do diâmetro ventricular esquerdo, que também aparece significativa em medições de volume de pressão. Volume final-sistólica aumentou de 16.25 µ l (± 1.935 µ l) 23.31 µ l (± 1.617µL). Esta mudança foi significativa (p = 0.0131) (ver Figura 4). Volume diastólico final aumentou de 25.81 µ l (± 1,852 µ l) 31.24 µ l ± (1.093 µ l). Esta mudança foi significativa (p = 0.0268) (ver Figura 4).
One-Way ANOVA seguido Bonferroni posthoc testes foi realizada para comparar o TAC e sham a grupos. No caso de medições de volume de pressão, grupos foram comparados usando um teste t não pareado com correção de Welch. Todos os dados tem sido apresentado como média ± SEM (barras de erros).
Figura 1: A abordagem cirúrgica através do espaço intercostal 2nd na ampliação de 200%. Esta foto foi tirada com o microscópio cirúrgico e exibe o arco aórtico com um segmento entre a artéria carótida comum esquerda e a artéria Braquiocefálica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representante onda pulsada Doppler imagem de ambas as artérias carótidas (sham vs ratos de TAC). A) imagem de Doppler pulsado-onda da artéria carótida esquerda antes de TAC. B) imagem de Doppler pulsado-onda da artéria carótida direita antes de TAC. C) imagem ofPulsed-onda Doppler da artéria carótida esquerda após TAC. A velocidade de fluxo de sangue é reduzida em comparação com a Figura 2A. D) onda pulsada Doppler da artéria carótida direita após TAC. A velocidade de fluxo de sangue é aumentada em comparação com a figura 2B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: coração peso / peso do corpo. Hipertrofia cardíaca é induzida devido a TAC. Isso é demonstrado por um aumento significativo na relação de peso de peso corporal de coração. Os ratos sem borda aórtica (i. e. Souza ratos; barras brancas) foram comparados aos ratos TAC operado (barras pretas) após 3, 6 e 21 dias. 6 dias após o TAC a relação peso do coração peso /body aumentou significativamente em ratos do TAC. Este efeito é apenas ligeiramente pronunciado após 21 dias. Significância foi definida como p = < 0,05. NS = não significativo; p < 0,0001. Os dados são apresentados como média ± SEM (barras de erros). n = 6-9 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: parâmetros hemodinâmicos medidos através de cateter de pressão-volume em ratos (C57BL/6J) com e sem TAC 21 dias após a cirurgia: A) frequência cardíaca (FC) em batidas por minuto (bpm). Não houve diferença na HR em ambos os grupos, indicando uma narcose comparável durante as medições invasivas. B) pressão arterial sistólica na artéria carótida comum direita (sBP). O aumento significativo de sBP após 21 dias indica uma constante constrição do arco aórtico. C) final-sistólica volumes (ESV) são aumentou significativamente (p = 0.0131) após 21 dias e mostrar uma aumentada pós-carga devido ao TAC induzida dilatação do ventrículo. D) volume diastólico final (ESV) é aumentada (p = 0.0268. Significância foi definida como p = < 0,05. NS = não significativo; * p < 0,05; p < 0,0001. Os dados são apresentados como média ± SEM (barras de erros); n = 8-13 por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O início rápido da hipertensão devido TAC difere clinicamente relevante hipertrofia causada por estenose aórtica ou hipertensão. No entanto, o uso de modelos animais pequenos para induzir insuficiência cardíaca tem muitas vantagens e é, portanto, escolhido por muitos investigadores11. Este modelo de peito fechado melhora os modelos já existentes da técnica cirúrgica para induzir a constrição da aorta transversa em ratos4.
O passo mais crítico é a passagem sob o arco aórtico. Uma sutura apertada em torno da aorta pode causar uma redução fatal do fluxo de sangue para órgãos importantes como os rins. De acordo com a lei de Hagen-Poiseuille, o fluxo é principalmente dependente do raio. Portanto, alguns espaçadores adaptado de peso foram utilizados em nosso protocolo. Este procedimento faz com que este modelo mais universalmente aplicável, particularmente no que diz respeito a ratos muito jovens ou velhos, dependendo da configuração experimental individual.
Trauma cirúrgico em si induz uma resposta imune e deve ser reduzido a um mínimo absoluto para evitar efeitos de distorção. Recuperação rápida e taxas de sobrevivência de alta são obrigatórias, especialmente em modelos animais complexos. Historicamente, ao contrário de toracotomia em pacientes humanos, a caixa torácica em ratos não é restaurada após cirurgia de TAC. Portanto, a restituição aos movimentos de respiração fisiológica é limitada devido as enciclopédia costelas flutuantes, que não são reconectadas ao esterno.
Técnicas minimamente invasivas para TAC também são usados por outros12,13. Em ambos os modelos, o arco aórtico é alcançado através de uma incisão mediana e uma esternotomia parcial superior. Embora ambos os modelos são menos invasivos do que os modelos de peito aberto, os cirurgiões têm que remover as costelas ou partes do esterno para atingir a aorta. Acreditamos que a manutenção da fisiologia da SIDA toda caixa toráxica recuperação mais rápida. Portanto, este protocolo melhora a protocolos já existentes e ajuda a minimizar o trauma cirúrgico em si.
Devido ao acesso cirúrgico mais apical, uma hiperinflação pós-cirúrgica dos pulmões para a prevenção de atelectasia ou pneumotórax, como tem sido descrito às vezes4,14, não é necessária. Este acesso impede um barotrauma dos pulmões, que pode ser induzida por aperto o tubo expiratório abrir atelectasis em modelos existentes. Este protocolo inclui também uma estratégia individualizada de ventilação fisiológica. É tentador especular que uma ventilação adaptada individualmente auxilia na redução associada a complicações como barotrauma. Uma estratégia de ventilação adaptado de peso foi usada para evitar efeitos sobre a produção de citocinas sistêmicas pela ventilação em si15.
Em conclusão, essas técnicas representam um modelo alternativo e melhorado para induzir hipertrofia cardíaca em ratos.
Embora o trauma é minimizado, evitando a toracotomia, o efeito superior sobre a redução da inflamação não é mostrado nesta publicação. Infelizmente, limitações definidas pelas leis de proteção animal não nos permitiu realizar TAC de peito aberto em paralelo com TAC invasiva mínima para comparação, porque este modelo minimamente invasivo foi estabelecido há anos já. Portanto, estas declarações baseiam-se nas experiências anteriores de nosso grupo.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Stilla Frede e Susanne Schulz por sua assistência técnica. Este estudo não recebeu nenhum financiamento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pressure-volume catheter | Millar Instruments, USA | SPR-839 | |
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus GmbH, Germany | Minivent - TYPE 845 | |
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus GmbH, Germany | Y-connection with intubation cannula OD 1.2mm 73-2844 | |
| Vaporizer | Dräger Medical AG&CO.KG, Germany | 19.3 Isofluran-Vaporizer (a newer version is available under catalog number D-877-2010) | |
| Microscope | Leica Microsystems, Germany | MZ 7.5 | |
| Light source | Schott AG, Germany | KL 1500 LCD | |
| 6-0 Prolene | Ethicon, USA | Polypropylene suture BV-1 9.3 mm 3/8c | suture for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner, Germany | USP 5/0 schwarz; IC108000 | suture for constriction |
| Homoeothermic Controlled Operating Tables | Harvard Apparatus GmbH, Germany | Typ 872/3 HT with tripod stand and homoeothermic controller Type 874; 73-4233 | |
| Flexible Rectal Probe | Harvard Apparatus GmbH, Germany | 1.6 mm OD; 55-7021 | |
| Doppler Signal Visualisation Instrument | Indus Instruments, USA | Doppler Signal Processing Workstation (DSWP) with 20MHz Pulsed Doppler Module | |
| Arruga Intracapsular Forceps | Altomed, UK | A5400 | |
| Doppler Probe | Indus Instruments, USA | 20MHz Tubing-mounted Probe | |
| Jaffe Lid Retractor | Altomed, UK | A3513 |
References
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