Summary
نحن الحاضرين هنا تطبيق لتقنية مناعية قياسية (كفسي الملون OT--أنا انتشار) تهدف إلى رصد سرعة توليد اللمفاويات T السامة للخلايا بوساطة adjuvant (CTL) المجراة في. هذا تقدير سريع لقدرات CTL مفيد لتطوير لقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلايا، فضلا عن لقاحات السرطان العلاجية.
Abstract
تقييم لقاحات الوحدة الفرعية الحديثة يكشف عن أن جيل تحييد الأجسام المضادة مهم لكنه غير كاف لتحديد adjuvant. ولذلك، هناك حاجة ماسة في المواد المساعدة مع قدرات المناعية تنشيطية كل خلطيه والخلوية التي تكون قادرة على تعزيز استجابات الخلايا الليمفاوية (CTL) T السامة للخلايا. وهكذا، رصد المؤمنين من المرشحين adjuvant حمل الصليب-فتيلة وتعزز بعد إنشاء CTL يمثل خطوة حاسمة في تطوير اللقاحات. هنا نقدم طلبا لأسلوب يستخدم سيينفيكل على حدة (OT--أنا) خلايا T لرصد الصليب-عرض نموذج مستضد ovalbumin (OVA) في فيفو حضور المرشحين adjuvant مختلفة. ويمثل هذا الأسلوب إجراء اختبار سريع لتحديد المواد المساعدة مع قدرات فتيلة عبر أفضل. انتشار CD8+ تي الخلايا هي إشارة أثمن من فتيلة الصليب وهو أيضا يعتبر ربط العرض التقديمي عبر المستحثة adjuvant. ويمكن تقييم هذه الميزة في مختلف أجهزة المناعة مثل العقد الليمفاوية والطحال. مدى جيل CTL يمكن أيضا رصدها، مما يعطي أفكاراً حول طبيعة محلية (استنزاف العقدة الليمفاوية أساسا) أو استجابة على نطاق المنظومة (العقد الليمفاوية البعيدة و/أو الطحال). يسمح هذا الأسلوب أيضا العديد من التعديلات لاختبار العقاقير التي يمكن أن تمنع محددة العرض التقديمي عبر مسارات، ويوفر أيضا إمكانية استخدامها في سلالات مختلفة من الفئران التقليدية والمعدلة وراثيا. وباختصار، ستكون مفيدة لمختبرات اللقاحات في الصناعة أو في الأوساط الأكاديمية أن تطوير أو تعديل المواد الكيميائية لبحوث اللقاحات وتطوير التطبيق الذي نحن الحاضرين هنا.
Introduction
السامة للخلايا تي اللمفاويات (CTL) حمل اللقاحات هي التدخلات العلاجية الرئيسية التي تم وضعها لمكافحة أنواع معينة من السرطان1. CTL أيضا هامة للقاحات وقائية ضد العوامل الممرضة داخل الخلية2. وعلاوة على ذلك، CTL هي إحدى آليات الدفاع المناعي القليلة نشطة وظيفيا في السكان خطر مثل الولدان3،4 منهم تعتمد أيضا على CTL لمكافحة العدوى الحياة المبكرة5. وفي هذا الصدد، اللقاحات ضد الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) التي تم تطويرها مع أخرى الأعشاب التي لا تثير استجابات CTL (الشب) أدت إلى فشل كامل اللقاح مما يؤدي إلى مضاعفات خطيرة على الإصابات في الرضع6. يمكن عكس هذه الآثار السلبية للتطعيم من CD8+ استجابة الخلية تي7. وقد أثبتنا سابقا أن السيتوكينات الرئيسي (النوع الأول من تداخلين) حظيت ببعض مشجعا من الانترفيرون الجينات (اللدغة) يضع ضروريان للردود CTL التي تولدها هذه المواد8، في جزء منه عن طريق قياس انتشار ت-أنا تي الخلايا بعد التطعيم، واستخدام هذه النتائج كما لوحظ قدر من CTL يحفز القدرات في تمديد مواعيد التطعيم9. قياس انتشار OT--أنا CD8+ تي الخلايا في ماوس المتلقية C57BL/6 نوع البرية (WT) بصبغ إستر (CFSE) سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين التخفيف تقدير قدرة adjuvant لقاح لتوليد قوي الصليب-فتيلة سيينفيكل، (الببتيد المناعية المهيمنة من أوفالبومين، البويضات). أشكال مختلفة من هذه التقنية تستخدم على نطاق واسع لتقييم انتشار OT-أنا CD8+ وخلايا CD4 بعد التمديد الثاني+ تي الخلايا. على سبيل المثال، قد استخدمت في غياب السيتوكينات مختارة (كو الفئران) أو لقياس فعالية لقاح بعد استدعاء مستضد في وزن الحيوانات. نحن وضع بروتوكول قصيرة (التجربة 4 أيام) الذي بعد نقل السلبي الملون كفسي OT-أنا CD8+ تي الخلايا، تحصين (الليبي) تحت الجلد تتكون من جرعة واحدة من 50 ميكروغرام البويضات خالية من الذيفان وتستكمل مع اختبار المواد المساعدة ويدار (الشكل 1). متابعة نتائج 48 ساعة بعد التطعيم يوفر دليلاً موثوق بها من قدرة adjuvant على توليد استجابات CTL. بهذه الاستراتيجية، من الممكن لتقييم فاعلية الاستجابة المناعية المحلية في العقدة الليمفاوية تجفيف بعد التحصين، فضلا عن مدى الاستجابة بقياس نشاط CTL في الطحال (أو العقد الليمفاوية البعيدة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من الخلفية C57BL/6. وأبقى كل الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض. جميع التجارب التي أجريت وفقا لمعياري لقانون حماية الحيوانات الألمانية (تيرشج بجبل. أنا S 1105؛ 25.05.1998) ووافقت عليها "اللجنة ساكسونيا السفلي" في "أخلاقيات التجارب الحيوانية" ومكتب الدولة (انخفاض ساكسونيا الدولة مكتب لحماية المستهلك وسلامة الأغذية)، تحت رقم تصريح 33.4-42502-04-13/1281 و 162280.
1. كفسي تلطيخ من OT--أنا تي الخلايا ونقل التبني
ملاحظة: OT--أنا الفئران هي ترانسجينيكالي التي تم إنشاؤها من الحيوانات التي تعبر عن مستقبلات خلية تي (تكر) مع α ثابت وسلاسل β معا تعترف الببتيد المناعية المهيمنة من البويضات، سيينفيكل10،11. كنتيجة لذلك، قد هذه الفئران عدد كبير إلى حد كبير من CD8 الخاصة سيينفيكل+ تي الخلايا (97%)12 عند مقارنة بالفئران العادية أو تلقيح البويضات (≤ 1 ٪)13.
- عزل CD8 يمكن تتبعها الخلايا+ ر من ت-أنا الفئران التعبير عن اليل خاصة اللمفاويات T Thy1 (Thy1.1):
- Euthanize OT 6-9 أسابيع من العمر--أنا الفئران باستنشاق أول أكسيد الكربون2 متبوعاً بخلع عنق الرحم14. تشريح الطحال والغدد الليمفاوية الرئيسية (أزواج الاربية وابطي وعنق الرحم فقط) بقطع الجلد مع المقص الجراحي، فصل الجلد من الجسم بالمساعدة من كماشة الجراحية والملقط ووضعها في أطباق بتري (60 × 15 ملم) التي تحتوي على كل 100 ميكرومتر المسامية مش كأس للإفراج عن طحن وخلايا الأنسجة.
- المحافظة على أطباق بتري (مع كوب واحد مش كل) في 3-5 مل من إكمال ربمي المتوسطة (RPMI 1640، 10% v/v FCS، 100 البنسلين U/mL، ستربتوميسين 50 ميكروغرام/مل) أبقى على الجليد.
- الهريس الأجهزة مع المساعدة من المكبس المحاقن أو صك مماثل عقيمة (قطع السابقة غير مطلوبة) وجمع تعليق وحيد الخلية الناتجة في أنابيب الطرد المركزي 15 مل.
- الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. تغسل الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بالطرد المركزي وفي الكريات الحمراء من الطحال بإعادة تعليق بيليه في 1 مل/الطحال من كلوريد الأمونيوم المخزن المؤقت (ACK العازلة، متوفرة تجارياً). احتضان الخلايا لمدة 1.5 دقيقة على الجليد وبعد ذلك تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بالطرد المركزي (كما فعلت من قبل).
- إعادة تعليق بيليه في الأنبوب نفسه في 1 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.2) التي تحتوي على 5% الجنين البقري مصل للعزل المغناطيسي.
- لإجراء العزل المغناطيسي، تابع إلى الانتقاء السلبي من CD8+ تي نشر البروتوكولات15أو الخلايا باستخدام مجموعة أدوات عزل مغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- القيام بتلوين كفسي، العد الأول عدد CD8+ تي الخلايا التي تم الحصول عليها من الأراضي المحتلة--أنا الفئران باستخدام عداد الآلي خلية (عداد الجسيمات). 1-5 × 107 خلايا/مل في وحدة تخزين مل 1-5 مع 5 ميكرومتر كفسي في برنامج تلفزيوني لمدة 7 دقائق على 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء في أنبوب صقر 15 مل وصمة.
- إخماد تلطيخ كفسي بإضافة نفس الحجم (1:1) من مصل الدم البقري الجنين إلى الخلايا، واحتضان لهم لمدة دقيقة 7 إضافية عند 37 درجة مئوية محمية من الضوء. تغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مرتين.
- عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية. تعيين عدد الخلايا إلى 3-5 × 107 خلايا/مل من برنامج تلفزيوني من أجل حقن 3-5 × 106 خلايا/الماوس في 100 ميليلتر عن طريق الوريد (رابعا) عن طريق الوريد الذيل.
- لإجراء حقن الوريد الذيل، شل الفئران في ريسترينيرس المناسبة. الحارة بمنطقة الظهر وذيل الفئران بالحقن باستخدام مصباح الضوء الأحمر، وضعت بين 20 إلى 25 سم بعيداً عن الفئران لمدة 1-3 دقيقة للسماح للذيل المنطلق توسع الأوعية.
ملاحظة: وهذا يساعد على سهولة كشف الوريد والإدارة تعليق خلية. - ضمان (باليد توضع بين الفئران والمصباح) أنه ليس جداً الساخنة للفئران وعندما الأوردة الذيل تكون مرئية بوضوح، المضي قدما بالحقن. حقن الخلايا في الوريد الذيل الأفقي أو الظهرية استخدام حقنه 1 مل مع إبرة قياس 2516.
2-التحصين (خالية من إندو البويضات +/-Adjuvant)
- مكان الفئران زرعها مع OT-الخلايا (الخطوة 1، 7، الشكل 1) في تشكيل غرفة تخدير، وإدارة إيسوفلوراني في الأكسجين آلة تخدير14.
- عندما يكون الماوس نائماً تماما تحت التخدير، إخراجه من الدائرة ويحلق فرو الماوس على المنطقة على مدى السطحية عضلة (الأفقي أسفل الظهر) باستخدام جهاز تشذيب شعر كهربائية، من أجل القيام حقن نظيفة مع عرض جيد لمجال التطبيق.
- حقن 50 ميليلتر من اللقاح، الليبي في منطقة حلق باستخدام إبرة قياس 25.
3-عزل الخلايا الليمفاوية وتلطيخ لتحليل التدفق الخلوي
- عزل الخلايا الليمفاوية وسبلينوسيتيس
- Euthanize الفئران جرى تطعيمهم باستنشاق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
- استخراج البعيدة وتجفيف الغدد الليمفاوية والطحال ووضعها في أطباق بتري منفصلة تحتوي على 100 ميكرومتر المسامية مش كوب للإفراج عن طحن وخلايا الأنسجة. اتبع الخطوات 1.1.2 من خلال 1.1.3.
- صب المادة طافية بعد الطرد المركزي، وإعادة تعليق الكريات خلية في نفس الحجم من بقايا PBS (ما يقارب 100 ميليلتر).
- تلوين لتحليل التدفق الخلوي
- في أنبوب الطرد 15 مل إعداد مزيج رئيسي الذي يحتوي على الأجسام المضادة المصبوغة في تركيزات المبينة في الجدول 1، وهكذا تسفر عن علامة x 2 تتركز ميكس المصبوغة. إعداد حجم ما يكفي من مزيج الرئيسي أن يكون 100 ميليلتر كل عينة. مزيج الخلايا ومزيج الرئيسي 1:1، واحتضان أنه عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم المصبوغة النهائية كل عينة 200 ميليلتر (100 ميليلتر من الخلية بيليه + 100 ميليلتر من جسم ميكس الرئيسي). - تغسل الخلايا مرتين بالطرد المركزي كما هو موضح في 1.1.3، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني، مرتين.
- تعليق إعادة الخلايا الملون في 0.5-1 مل من برنامج تلفزيوني لاقتناء ونقل التعليق لأنابيب تدفق سيتوميتير. دائماً الاحتفاظ بعينات على الجليد ومحمية من الضوء.
- في أنبوب الطرد 15 مل إعداد مزيج رئيسي الذي يحتوي على الأجسام المضادة المصبوغة في تركيزات المبينة في الجدول 1، وهكذا تسفر عن علامة x 2 تتركز ميكس المصبوغة. إعداد حجم ما يكفي من مزيج الرئيسي أن يكون 100 ميليلتر كل عينة. مزيج الخلايا ومزيج الرئيسي 1:1، واحتضان أنه عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4-التدفق الخلوي
- دائماً ما قبل تصفية عينات الخلايا باستخدام مرشحات 70-100 ميكرومتر.
- إعداد عناصر تحكم مفردة المصبوغة التعويض فلوروفوريس بالتفصيل في الجدول 1 (الخرز أو الخلايا).
ملاحظة: ينبغي أن يؤديها في سيتوميتير أو تحليل البرمجيات17،،من1819 التعويض وتطبيقها على جميع العينات. - اتبع هذه الاستراتيجية النابضة هو مبين في الشكل 2. بإيجاز، بوابة السكان في الارتفاع مبعثر الأمام مقابل منطقة المبعثر إلى الأمام (الشكل 2A)، ومرة أخرى الجانب مبعثر واسعة مقابل الجانب مبعثر المنطقة (منطقة أفريقيا جنوب الصحراء، الشكل 2) بغية استبعاد doublets.
- بوابة السكان من الشكل 2B بالتآمر BV 650 (السيارات-الأسفار) مقابل فيتك (CFSE) من أجل تميز كفسي الحقيقي الملون الخلايا من الخلايا السيارات-الفلورسنت عالية. وتشمل الخرز أو خلايا ملطخة بجسم مترافق إلى 650 بي إلى ضوابط التعويض. يستخدم هذه الأرض (الشكل 2) من 650 بي مقابل فيتك للبوابة في الأراضي المحتلة--أنا كفسي الملون الخلايا.
- بوابة السكان من الشكل 2 ج Pe-Cy7 (Thy1.1-CD90.1-) مقابل APC (CD8) لتمييز الخلايا المشتقة من المانحين مقابل الفئران المستفيدة.
ملاحظة: الخلايا المستمدة من OT--أنا الفئران المانحة هي Thy1.1+ (CD90.1)، بينما تكون الخلايا المستمدة من الفئران (C57BL/6، المتلقي) WT Thy1.2+ (CD90.2) (الشكل 2D). لدى بعض المختبرات OT--أنا الفئران في خلفية Thy1.2 ووزن (C57BL/6) في Thy1.1. وفي هذه الحالة يجب عليك استخدام جسم مضاد ضد Thy1.2 للعبارات--أنا خلية النابضة. - إعادة بوابة CD8 الخلايا+ من السكان Thy1.1+ بالتآمر على بوابة تضم 450 BV (CD4) مقابل APC (CD8) (الشكل 2E).
- عرض السكان بوابات في 2E الشكل باستخدام عرض الرسم بياني CD8+ الخلايا تظهر كفسي (فيتك، قناة 530/15-الليزر الأزرق-)، بوابة السكان انتشرت بكثافة من 102 تصل إلى المستوى حيث السكان تحكم غير المجزأة هي (كثافة ~ 105، اعتماداً على كفاءة تلطيخ كفسي وإعداد cytometer تدفق التيار الكهربائي) (الشكل 2 واو).
- جعل بوابة إضافية (غير معروضة في الشكل 2) رسم فيتك مقابل L/D علامة (450/20 قناة والليزر الأشعة فوق البنفسجية) بغية تقييم الخلايا الميتة بالتوازي مع تقييم الانتشار.
- الحصول على مالا يقل عن 5000 الأحداث لعناصر التحكم التعويض ومن العينات في سيتوميتير تدفق أحداث 10.000 (البوابة الإلكترونية، الشكل 2). تشغيل في سيتوميتير في التدفق المنخفض أو المتوسط (لا تتجاوز معدلات التدفق من أحداث 20.000/s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من أجل اختبار علاجات استخدام مجموعة مختلفة من المواد المساندة (ADJ1 و ADJ2)، قمنا بتقييم قدرة توليد CTL بقياس انتشار العبارات المنقولة أدوبتيفيلي--أنا CD8+ تي الخلايا بالتدفق الخلوي (الشكل 2). لهذا، نحن سابقا الملون الخلايا المعزولة من استنزاف الليمفاوية والطحال (الجدول 1). عن طريق قياس انتشار CD8+ تي الخلايا في الغدد الليمفاوية والطحال، كنا قادرين على تأكيد قدرة توليد CTL أعلى من ADJ2 في استنزاف الليمفاوية (الشكل 3) بالمقارنة مع ADJ1 أو البويضات وحدة تحكم برنامج تلفزيوني. وفي المقابل، لاحظنا أن ADJ2 لم تكن قادرة على توليد استجابة CTL في حجرة الجهازية (الطحال)، بينما ADJ1 إظهار مستويات عالية من الانتشار ب CD8 الطحال الخلايا+ ر، لا فقط بالمقارنة مع عناصر التحكم (برنامج تلفزيوني والبويضات) لكن أيضا متفوقة إلى ADJ1. بتشريح عمل ADJ2 باستخدام هذا الفحص الانتشار السريع في فيفو ، يمكننا أن نؤكد عمله قوية محلي ولكن ليس مولد CTL الجهازية. وعلاوة على ذلك، ADJ1 الأفعال سواء على الموقع المحلي للحقن (تجفيف الغدد الليمفاوية) كذلك شكل منتظم مع التمديد زيادة--أنا الانتشار في الطحال. النتائج التي تم الحصول عليها تسمح لنا بوصف النشاط adjuvant ونطاقه، يتجلى في الآثار الملاحظة ADJ2 (المحلية) و ADJ1 (النظامية).
رقم 1: جدول زمني المقايسة. يمثل المخطط الزمني المقايسة بعد التمديد الأولى-نقل الخلية تي في اليوم 0، تطعيم الليبي في اليوم 1، والطحال أخذ العينات وتجفيف الغدد الليمفاوية بعد 2 أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: رسم تخطيطي لسير استراتيجية النابضة اتباعها لقياس انتشار CD8+ تي الخلايا (OT-الأول، Thy1.1+) بالتدفق الخلوي- يتم تمثيل عينتين بألوان مختلفة (أحمر والضوء الأزرق) لوضع تصور أفضل. ألف-باء. يتعرضون للخلايا المفردة من doublets تباعا في الأبواب الأول والثاني برسم الأمام-مبعثر-الارتفاع مقابل الأمام-مبعثر-المنطقة والجانب-مبعثر-العرض مقابل الجانب-مبعثر-المنطقة. جيم عرض الخلايا عن طريق بوابة في ب التي بها كثافات fluorescence قناة BV 650 (صف السيارات) تآمروا ضد قوتها كفسي (حيث يشير ديمينج إلى الشعب/انتشار الخلايا) في قناة YG 530/30. هذه البوابة يسمح تحديد الخلايا إيجابية كفسي الحقيقية التي تميز تلك التي لديها صف السيارات عالية. دال كفسي الخلايا إيجابية كانت بوابات مع قوتها الفلورية العالية من Pe-Cy7 (Thy1.1، علامة للتمديد--أنا الخلايا) مقابل قوتها APC (CD8). هاء BV 450 (CD4) تآمروا ضد الجيش الشعبي الكونغولي (CD8) سابقا عن طريق بوابة Thy1.1 الخلايا إيجابية لتحديد دقة CD8+ تي الخلايا. واو سابقا عن طريق بوابة CD8+ رسم الخلايا في الرسم بياني ضد كثافة كفسي بوابة السكان انتشرت أخيرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: Adjuvant مدفوعة جيل CTL. ويرد القدرة على الحصول على ردود CTL المحلية أو النظمية لعلاجات مختلفة adjuvant 2 (ADJ1 و ADJ2) على طول مستضد وعناصر التحكم في برنامج تلفزيوني. انتشار العبارات المنقولة أدوبتيفيلي--أنا تي يتم فحص الخلايا في العقدة الليمفاوية تجفيف (الاربية، للإدارة (الليبي) مثال ذلك تحت الجلد) وفي الطحال، كما هو مبين في الشكل الصفوف. تكاثر الخلايا يقاس في علاجات ذات الصلة (الأعمدة) من أجل مقارنة بدقة مدى الاستجابة المناعية في المحلي (العقدة الليمفاوية تجفيف) أو الجهازية (الطحال) مجموعة من الإجراءات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الأصباغ-الأجسام المضادة | استنساخ | فلوروفوري/قناة-التصفية | تركيز 2 X |
| Thy1.1 (CD90.1) | HIS51 | PE-Cy7-YG 780/60 | 1:750 |
| CD8 | 53-6.7 | آسيا والمحيط الهادئ-670/14 ص | 1:280 |
| خلايا CD4 | RM4-5 | BV 421-450/50 الخامس | 1: 100 |
| كفسي | - | فيتك-YG 530/30 | (وفقا للبروتوكول تلطيخ كفسي) |
| • قرار مجلس الوزراء (علامة خلية الميت) | - | --/الأشعة فوق البنفسجية-450/50 الأشعة فوق البنفسجية | 1: 500 |
الجدول 1: ستينينجس جسم للتدفق الخلوي- استنساخ جسم مترافق Fluorophore المستخدمة، وأوصى تلطيخ تركيزات (2 x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اللقاحات الحديثة هي من الناحية المثالية متميزة composedof مستضد المنقي والمواد المساعدة، مع إمكانية إضافة نظام توصيل مثل الدهنية أو جسيمات شبيهة بالفيروس، وجسيمات نانوية أو ناقلات حية. أحد جوانب رئيسية عند تصميم لقاح أن تختار adjuvant الصحيح وفقا للاحتياجات السريرية. يمكن أن يتضمن جزء من النطاق تحابي خلطيه مقابل الاستجابة المناعية الخلوية (أو كليهما)، وانتخاب محلي مقابل استجابة المناعة الجهازية (أو كليهما)، ونوع الذاكرة التي يجب أن تولد اللقاح في المجموعة السكانية المستهدفة. أحد الجوانب الهامة لتقييم adjuvant لسرعة تحديد قدرتها على توليد CTL. قدمنا هنا طريقة تستند إلى تقنيات معروفة بالفعل، لسرعة تحديد ميزات CTL استجابة في فيفو في طراز ماوس بقياس OT--أنا تي CD8 خلية انتشار. يسمح هذا الأسلوب للتنبؤ بفاعلية الاستجابة المناعية بمأمونية (انتشار OT--أنا تي الخلايا) في أيام العمل فقط 4. ويسهل هذا الأسلوب كذلك المقارنة بين أعمال المواد المساعدة من حيث الاستجابة المناعية (محلي مقابل الجهازية) والعمل الفعال. وهنا، لقد أظهرنا مثال على الكيفية التي ستؤثر بها التحصين مع العلاجات المختلفة adjuvant (ADJ1 مقابل ADJ2) الاستجابة المناعية. عمل ADJ2 كان يقتصر على مجال الإدارة المحلية حيث أنه ينشط الاستجابة المناعية في استنزاف الليمفاوية، في حين عمل ADJ1 بنفس الجرعة كانت أكثر انتشارا، توليد استجابة CTL كلا في ولكن مستوى وجهازيه مع أقل فاعلية من ADJ2 في استنزاف الليمفاوية.
خطوات حاسمة لتقييم القدرات CTL adjuvant نجاح يتم اختيار الشباب OT--أنا الحيوانات (كمصدر للخلايا التائية CD8) واستخدام البويضات خالية من الذيفان للتحصين. منذ التمديد--أنا الفئران هي الحيوانات المحورة وراثيا التي تم إنشاؤها لإنتاج الخلايا التائية CD8 التي تعترف بالبويضات الببتيد سيينفيكل في MHC-أنا السياق، اختيار الماوس تكر الاصطناعي يزيد من المظاهر من فرط CD8 التكاثري+ تي الخلايا20 مع التقدم في السن. التهاب الغدد الليمفاوية الإبطين هكذا سمة مشتركة أكثر من سنة بعد التمديد--أنا الفئران. مع أخذ ذلك في الاعتبار، يوصي باستخدام العبارات الشباب-أنا الحيوانات عندما يكون ذلك ممكناً (6-9-أسبوع الحيوانات) وتجنب عزل الخلايا من أي توسيع الأجهزة (أما الطحال من العقد الليمفاوية). سوف تؤثر على استخدام أجهزة الموسع مع تكاثر الخلايا التائية CD8 المقايسة كاملة نظراً لعدم الحصول على الاختلافات الأكثر احتمالاً في الانتشار بين الضوابط والمعالجات. يمكن أن تتولد من شرك مماثلة للتمييز الذي تتعرض له القدرة على توليد CTL adjuvant باستخدام البروتين البويضات مع آثار الذيفان، الذي يمكن الحصول استجابة مناعية أقوى بالمقارنة مع خالية من الذيفان البويضات21،22 (انظر المواد والمواد الكاشفة)، حيث endotoxins المغيرون المناعية قوية في حد ذاتها 23. ولذلك، يجب أن يكون البروتين البويضات المستخدمة لتحصين خالية من الذيفان. يعتمد استخدام 20 أو 50 ميكروغرام من البويضات خالية من الذيفان على طريق التحصين حاليا 50 ميكروغرام جرعة مناسبة لاختبار تحت الجلد للمواد المساعدة. بالإضافة إلى ذلك، استخدام تركيزات عالية من كفسي أبلغ في الأدب لقتل الخلايا الملون24 ويمكن أيضا نتيجة فشل الفحص.
ونفذت بعض التعديلات أو التحسينات المدخلة على التقنيات المختلفة المستخدمة في البروتوكول بغية الحد من إجهاد الحيوانات، وزيادة إمكانية تكرار نتائج التجارب. على سبيل المثال، تقليل تدفئة الحيوانات بمجرد تدفئة الظهر وذيل الفئران ولا الحيوان كله، أو تجنب الحقن تحت الجلد المتصلة بالإجهاد من أنيسثيتيزينج الحيوانات قبل التطعيم. التخدير هو غير مطلوب من قبل أنظمة رعاية الحيوان حقن تحت الجلد ولكن في تجربتنا، أنه يحسن إمكانية تكرار نتائج عن طريق تقليل الاختلافات التي أدخلها استجابة الإجهاد.
حد كبير من هذا الأسلوب أنه منذ كفسي البقع غشاء الخلايا، يضعف سطوع عالية عادة الكشف عن الإشارات من سيتوسول. ولذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى تأكيد قدرة CTL، ينبغي تقييم إفراز IFN-γ ب مقايسة إفراز محددة 25، وليس تلطيخ سيتوكين داخل الخلايا.
استخدام قياس الانتشار لتقدير قدرة توليد CTL بالمواد المساعدة في 4 أيام فقط على استفادة الوقت أقصر اللازمة من CTL التقليدية فحوصات26 وجيد المحتملين التجربة في القضية حيث المزيد هناك حاجة إلى تأكيد بأساليب أخرى.
على الرغم من أن يقتصر على البويضات مستضد، وذلك باستخدام العبارات-أنا تي الخلايا، الأسلوب الذي قدم هنا يسمح لدراسة خصائص التنشيط الناجمة عن المواد المختلفة بعد فرز الخلايا المتكاثرة. واحد من التطبيقات الممكنة هو دراسة تواقيع الأيضي الناجمة عن المواد المختلفة في الأراضي المحتلة انتشرت--أنا تي الخلايا وعلاقاتها مع تطوير الذاكرة27. عروض ثانوية إضافية يمكن تقييم الخصائص البيولوجية لحفز الخلايا، مثل التعبير عن السيتوكينات أو علامات تحبب بالتدفق الخلوي أو قدرتها السامة للخلايا عن طريق إجراء اختبارات CTL المجراة في8، 26 , 28. منذ تطبيق هذا الحد استخدامها في الفئران، يمكن إجراء استقراء للبشر باستغلال العروض استناداً إلى الفئران أنسنة29،،من3031.
هذا الأسلوب كما قدمنا هنا قوية بما يكفي لاستخدامها كفحص أولى لاختيار تفعيل الاستجابة الخلوية وأيضا ما يكفي من المرونة تعديل أو بالإضافة إلى مزيد من التحليل للخلايا T انتشرت. باختصار، هذا التقييم المجراة في السريع adjuvant CTL توليد القدرة هو أداة مثالية لمختبرات اللقاحات في الأوساط الأكاديمية والصناعة التي تهتم بوصف سريع لطريقة عمل هذه الجزيئات المرشحة adjuvant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن مدينون للمساعدين التقنيين لدينا: Bröder شين وحاء شكارليت، الذين ساعدونا خلال الإجراءات التجريبية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنح الاتحاد الأوروبي (يونيب، والعقد رقم 601738، و TRANSVAC2، العقد رقم 730964)، ومنحة "رابطة هلمهولتز" (هاي-IDR). لم لا تؤثر مصادر تمويل البحوث تصميم وتوليد مخطوطة أو المقرر تقديمها للنشر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
References
- Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
- Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
- Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
- Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
- Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
- Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
- Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
- Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
- Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
- Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
- Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
- Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).
- Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).
- Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
- Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
- Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
- Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
- Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).
- Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. , 79-85 (2009).
- Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
- Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
- O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
- Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
- Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
- Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
- Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).
