Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.
L’évaluation des vaccins sous-unité moderne révèle que la production d’anticorps neutralisants est important mais insuffisant pour le choix de l’adjuvant. Par conséquent, les adjuvants grâce aux fonctions cellulaires et humorales immuno-stimulant qui sont en mesure de promouvoir les réponses (CTL) les lymphocytes T cytotoxiques sont urgent. Ainsi, la surveillance fidèle des candidats adjuvant qui induisent des croix-amorçage et ensuite améliorent la génération de CTL représente une étape cruciale dans le développement de vaccins. Ici, nous présentons une demande pour une méthode qui utilise SIINFEKL-spécifique (OT-je) les cellules T pour surveiller la présentation croisée du modèle antigène ovalbumine (OVA) in vivo en présence de candidats différents adjuvants. Cette méthode représente un test rapide pour sélectionner les adjuvants avec les meilleures capacités de croix-amorçage. La prolifération des CD8+ T cellules est la plus précieuse indication de croix-amorçage et il est également considéré comme un corrélat de la présentation croisée induite par le traitement adjuvant. Cette fonctionnalité peut être évaluée dans les différents organes du système immunitaire comme les ganglions lymphatiques et la rate. L’étendue de la génération de CTL peut être également surveillée, ce qui donne des idées sur la nature d’un local (drainage ganglionnaire principalement) ou une réponse systémique (ganglions éloignées et/ou la rate). Plus loin, cette technique permet plusieurs modifications pour tester des médicaments qui peuvent inhiber les voies spécifiques de présentation croisée et offre également la possibilité d’être utilisé dans différentes souches de souris classiques et génétiquement modifiées. En résumé, l’application que nous vous présentons ici sera utile pour les laboratoires de vaccin dans l’industrie ou des universités qui développent ou modifient des adjuvants chimiques pour la recherche sur les vaccins et le développement.
Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisant des vaccins sont les principales interventions thérapeutiques qui ont été développées pour lutter contre certains types de cancer1. CTL sont également importants pour les vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires2. En outre, CTL sont l’un de ses mécanismes de défense immunitaires peu fonctionnellement actifs dans les populations à risque tels que les nouveaux-nés3,4 dont dépendent aussi de CTL pour lutter contre le début vie infections5. À cet égard, les vaccins contre le Virus Respiratoire Syncytial (RSV) qui ont été élaborés avec un adjuvant qui ne pas permis d’obtenir les réponses CTL (alun) a abouti à un échec complet du vaccin conduisant à des complications graves sur les infections chez les nourrissons de6. Ces effets négatifs de la vaccination peuvent être renversés par un CD8+ réaction de lymphocytes T7. Nous avons démontré précédemment que les principales cytokines (interférons de type I) provoquées par certains stimulateur d’agonistes de gènes (STING) interféron sont essentiels pour les réponses CTL générés par ces adjuvants8, en partie par la mesure de la prolifération des OT-I T cellules après vaccination et en utilisant ces résultats comme une mesure de CTL induisant des capacités fait observer dans l’extension de vaccination annexes9. La mesure de la prolifération des OT-j’ai CD8+ T des cellules dans une souris destinataire C57BL/6 de type sauvage (WT) de colorant de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) dilution est une estimation fiable de la capacité de l’adjuvant du vaccin à générer Croix-amorçage de SIINFEKL, (le peptide immuno-dominante de l’ovalbumine, ovules). Les variations de cette technique sont largement utilisées pour l’évaluation de la prolifération des OT-j’ai CD8+ et OT-II CD4+ T des cellules. Par exemple, il a été utilisé en l’absence de certaines cytokines (souris KO) ou pour mesurer l’efficacité du vaccin après rappel antigène chez les animaux de WT. Nous mis au point un protocole court (4 jours experiment) dans lequel après transfert passif des OT CFSE teinté-j’ai CD8+ T cells, une vaccination sous-cutanée de (c.s.) consistant en une seule dose de 50 µg d’ovules exempte d’endotoxine additionnée d’adjuvants de test est administré (Figure 1). Le suivi des résultats 48 heures après la vaccination fournit une preuve fiable de la capacité de l’adjuvant pour générer des réponses CTL. Par cette stratégie, il est possible d’évaluer la puissance de la réponse immunitaire locale dans le ganglion lymphatique drainant après vaccination ainsi que l’ampleur de la réponse en mesurant l’activité CTL dans la rate (ou d’éloignés des ganglions).
Idéalement, les vaccins modernes sont composedof antigène purifié et adjuvants, avec l’ajout éventuel d’un système de livraison comme les liposomes, les Pseudo-particules virales, les nanoparticules ou les vecteurs vivants. Un aspect clé lors de la conception d’un vaccin consiste à choisir le bon adjuvant selon les besoins cliniques. Partie du champ d’application pourrait impliquer favorisant un humorale vs réponse immunitaire cellulaire (ou les deux), l’élection d’un local par rapport à une répons…
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes redevables à nos assistants techniques : Bröder U. et H. Shkarlet, qui nous ont aidé au cours de procédures expérimentales. Ce travail a été financé en partie par des subventions de l’UE (UniVax, contrat n° 601738 et TRANSVAC2, contrat n° 730964) et une subvention de l’Association Helmholtz (HAI-IDR). Les sources de financement n’a pas influencé la recherche conception, génération de manuscrit ou décision de le soumettre pour publication.
BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |