Vivo में तेजी का आकलन वैक्सीन के विकास के लिए सहायक की साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों जनरेशन क्षमताएं
Summary
हम यहां एक मानक प्रतिरक्षा तकनीक (CFSE सना हुआ OT-I प्रसार) के लिए एक आवेदन पेश करने के लिए तेजी से सहायक मध्यस्थता साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (CTL) vivo में पीढ़ी की निगरानी करने का इरादा । CTL क्षमताओं का यह तेजी से आकलन intracellular रोगजनकों के साथ ही चिकित्सीय कैंसर के टीके के खिलाफ नियत्रंण टीकों के विकास के लिए उपयोगी है ।
Abstract
आधुनिक उप इकाई टीके के आकलन से पता चलता है कि एंटीबॉडी को बेअसर करने की पीढ़ी महत्वपूर्ण है लेकिन सहायक चयन के लिए पर्याप्त नहीं है । इसलिए, adjuvants दोनों विनोदी और सेलुलर इंयूनो-stimulatory क्षमताओं है कि साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTL) प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने में सक्षम है के साथ तत्काल जरूरत है । इस प्रकार, सहायक उंमीदवारों की वफादार निगरानी कि पार भड़काने प्रेरित और बाद में CTL पीढ़ी बढ़ाने के टीके के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है । यहां हम में एक विधि है कि SIINFEKL-विशिष्ट (OT-I) टी कोशिकाओं का उपयोग करता है के लिए एक आवेदन प्रस्तुत मॉडल प्रतिजन ovalbumin (ओवा) के पार प्रस्तुति की निगरानी के लिए vivo में अलग सहायक उंमीदवारों की उपस्थिति में । इस विधि का सबसे अच्छा क्रॉस-भड़काना क्षमताओं के साथ adjuvants का चयन करने के लिए एक तेजी से परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है । सीडी 8+ टी कोशिकाओं के प्रसार क्रॉस भड़काना का सबसे मूल्यवान संकेत है और यह भी सहायक के सहसंबंधी के रूप में माना जाता है पार-प्रस्तुति । यह सुविधा लिम्फ नोड्स और तिल्ली की तरह अलग प्रतिरक्षा अंगों में मूल्यांकन किया जा सकता है । CTL पीढ़ी की सीमा पर भी नजर रखी जा सकती है, जिससे एक स्थानीय (लिम्फ नोड को मुख्य रूप से draining) या प्रणालीगत प्रतिक्रिया (दूर लिम्फ नोड्स और/या तिल्ली) की प्रकृति पर अंतर्दृष्टि दे । इस तकनीक आगे दवाओं है कि विशिष्ट पार प्रस्तुति रास्ते को बाधित कर सकते है और भी संभावना प्रदान करता है पारंपरिक और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के विभिंन उपभेदों में इस्तेमाल किया जा परीक्षण के लिए कई संशोधनों की अनुमति देता है । संक्षेप में, आवेदन है कि हम यहां वर्तमान उद्योग या शिक्षा में वैक्सीन प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी है कि विकसित या वैक्सीन अनुसंधान और विकास के लिए रासायनिक adjuvants को संशोधित किया जाएगा ।
Introduction
साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTL) टीके उत्प्रेरण प्रमुख चिकित्सीय हस्तक्षेप है कि1कैंसर के कुछ प्रकार से लड़ने के लिए विकसित किया गया है । CTL भी intracellular रोगजनकों के खिलाफ नियत्रंण टीके के लिए महत्वपूर्ण है2। इसके अलावा, CTL कुछ प्रतिरक्षा रक्षा तंत्र में से एक है कार्यात्मक जोखिम आबादी में सक्रिय ऐसे नवजात शिशुओं के रूप में3,4 जिसे भी CTL पर निर्भर करने के लिए जल्दी जीवन संक्रमण5का मुकाबला । इस संबंध में, श्वसन Syncytial वायरस (RSV) है कि एक सहायक है कि CTL प्रतिक्रियाओं (फिटकिरी) में लाना नहीं है के साथ विकसित किया गया टीकों के खिलाफ टीके6शिशुओं में संक्रमण पर गंभीर जटिलताओं के लिए अग्रणी टीका की एक पूरी विफलता के परिणामस्वरूप । टीकाकरण के इन नकारात्मक प्रभाव एक सीडी 8+ टी सेल प्रतिक्रिया7द्वारा उलट जा सकता है । हम पहले दिखा दिया है कि मुख्य साइटोकिंस (प्रकार मैं interferons) इंटरफेरॉन जीन (स्टिंग) एगोनिस्ट के कुछ उत्तेजक द्वारा बटोरा CTL इन8adjuvants द्वारा उत्पंन प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं, हिस्से में के प्रसार को मापने के द्वारा OT-मैं टीकाकरण के बाद टी कोशिकाओं और CTL उत्प्रेरण क्षमताओं का एक उपाय के रूप में इन परिणामों का उपयोग कर विस्तारित टीकाकरण कार्यक्रम9में मनाया । OT के प्रसार की माप-I सीडी 8+ टी कोशिकाओं में एक जंगली प्रकार (WT) C57BL/6 प्राप्तकर्ता माउस द्वारा carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) डाई कमजोर पड़ने एक वैक्सीन के सहायक की क्षमता का एक मजबूत अनुमान है पैदा करने के लिए SIINFEKL की क्रॉस-भड़काना, (इंयूनो-प्रमुख पेप्टाइड के ovalbumin, ओवा). इस तकनीक के रूपांतरों को व्यापक रूप से ot-I सीडी 8+ और ot-II CD4+ टी कोशिकाओं के प्रसार के आकलन के लिए उपयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, यह चयनित साइटोकिंस (KO चूहों) के अभाव में इस्तेमाल किया गया है या WT पशुओं में प्रतिजन याद करने के बाद वैक्सीन प्रभावकारिता को मापने के लिए । हम एक छोटे प्रोटोकॉल (4 दिन प्रयोग) में CFSE के निष्क्रिय हस्तांतरण के बाद-सना हुआ OT-मैं सीडी 8+ टी कोशिकाओं, एक चमड़े के नीचे (एस॰सी॰) प्रतिरक्षण के ५० µ जी की एक खुराक से मिलकर तैयार endotoxin-मुक्त ओवा परीक्षण के साथ पूरक adjuvants प्रशासित है (चित्रा १). परिणामों के अनुवर्ती ४८ ज टीकाकरण के बाद सहायक की क्षमता का एक विश्वसनीय सबूत प्रदान करता है CTL प्रतिक्रियाओं उत्पंन करते हैं । इस रणनीति के द्वारा, यह प्रतिरक्षण के बाद draining लिम्फ नोड में स्थानीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शक्ति का आकलन करने के लिए संभव है के रूप में अच्छी तरह से तिल्ली (या दूर लिम्फ नोड्स) में CTL गतिविधि को मापने के द्वारा प्रतिक्रिया की हद तक.
Protocol
Representative Results
Discussion
आधुनिक टीके आदर्श composedof शुद्ध प्रतिजन और adjuvants, liposomes, वायरस की तरह एक वितरण प्रणाली के संभव इसके अलावा के साथ कर रहे हैं, कणों की तरह, नैनोकणों या जीना वैक्टर । एक महत्वपूर्ण पहलू है जब एक टीका डिजाइनिंग के लिए…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने तकनीकी सहायकों के ऋणी हैं: Bröder और H Shkarlet, जिंहोंने प्रायोगिक प्रक्रियाओं के दौरान हमारी सहायता की । यह काम आंशिक रूप से यूरोपीय संघ अनुदान (UniVax, अनुबंध no. ६०१७३८, और TRANSVAC2, अनुबंध no. ७३०९६४), और एक Helmholtz एसोसिएशन अनुदान (HAI-IDR) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । धन स्रोतों अनुसंधान डिजाइन, पांडुलिपि या यह प्रकाशन के लिए प्रस्तुत करने का निर्णय की पीढ़ी को प्रभावित नहीं किया ।
Materials
| BD LSR Fortessa Cell Analyzer | BD | Special Order | Flow Cytometer |
| CFSE | Molecular Probes | C34554 | Proliferation Dye |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells. |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Molecular Probes | L23105 | Dead Cell Marker |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0900-82 | antibody |
| APC anti-mouse CD8a Antibody | BioLegend | 100712 | antibody |
| BV421 Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 740007 | antibody |
| Z2 coulter Particle count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 9914591DA | Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter |
| EndoGrade Ovalbumin (10 mg) | Hyglos(Germany) | 321000 | Ovalbumin endotoxin free tested. |
| Cell Strainer 100µm nylon | Corning | 352360 | Cell strainer (100 µm pore mesh cups). |
| Sample Vials | Beckman Coulter | 899366014 | Sample vials for Z2 automated counter |
| C57BL/6 mice (CD90.2) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Company is now Envigo | |
| OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) | Harlan (Rossdorf, Germany) | Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo | |
| FACS tubes | Fischer (Corning) | 14-959-5 | Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes |
| Falcon 15 mL tubes | Fischer (Corning) | 05-527-90 | Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes |
| PBS (500 mL) | Fischer (Gibco) | 20-012-027 | Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 |
| Red lamp (heating lamp) | Dirk Rossmann GmbH (Germany) | 405096 | Heating infrred lamp (100 wats) |
| IsoFlo (Isoflurane) | Abbott Laboratories (USA) | 5260.04-05. | Isoflurane anesthesic (250 mL flask). |
| Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber | Parkland Scientific | V3000PK | Isoflurane anesthesia machine. |
| RPMI 1640 medium | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 11-875-093 | Base medium with Glutamine (500 mL) |
| Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 15-140-148 | Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) |
| Fetal Bobine Serum (Gibco) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | 10082147 | Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin |
| ACK Lysing Buffer (100 ml) | Gibco (distributed by ThermoFischer) | A1049201 | Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also |
| Plastic Petri Dishes | Nunc (distributed by ThermoFischer) | 150340 | 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated |
| Cell Clump Filter | CellTrics (Sysmex) | 04-004-2317 | CellTrics® 50 μm, sterile |
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