Summary
Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.
Abstract
De DNA schade reactie (DDR) maakt gebruik van een overvloed aan eiwitten te detecteren, signaleren en repareren van DNA laesies. Deze reactie uitgezet is cruciaal voor het genoom onderhoud mechanismen begrijpen. Aangezien werving en uitwisseling van eiwitten bij letsels hoogst dynamische zijn, vereist hun studie de capaciteit voor het genereren van DNA-beschadiging in een snelle en ruimtelijk gescheiden wijze. Hier beschrijven we procedures om lokaal de schade van DNA in menselijke cellen met behulp van een algemeen beschikbare laser-scannen confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser lijn. Accumulatie van genoom "onderhoud" factoren op laser strepen kunnen worden beoordeeld door immunofluorescentie (IF) of in real-time met behulp van eiwitten die zijn gelabeld met de fluorescerende verslaggevers. Met behulp van gefosforyleerd Histon H2A. X (γ-H2A.X) en replicatie eiwit A (RPA) als markeringen, de methode biedt voldoende resolutie te discrimineren lokaal aangeworven factoren die verspreid over de aangrenzende chromatine. Wij bieden verder ImageJ gebaseerde scripts aan efficiënt toezicht op de kinetiek van eiwit Herlokalisatie op DNA schade sites. Deze verfijningen vereenvoudigen sterk de studie van de dynamiek van de DDR.
Introduction
Cellen worden voortdurend blootgesteld aan endogene en exogene bronnen van DNA-schade die hun genomic integriteit bedreigen. De DDR is een ensemble van signalering van trajecten die detecteren, signaleren en repareren van DNA laesies te handhaven van de stabiliteit van het genoom. DNA-double-stranded einden (DSBs), de DDR gebeurt voornamelijk op twee complementaire platformen: γ-H2A.X-geëtiketteerden chromatine en een resected single-stranded DNA (ssDNA) regio meestal bekleed met de ssDNA-bindende complexe RPA1,2.
UV-laser-micro-bestraling van cellen vooraf gesensibiliseerde personen met de thymidine analoge 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) of de bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA kleurstof wordt gemaakt van een mengsel van DNA letsels, met inbegrip van single-stranded einden ( SSBs) en DSBs die een gelokaliseerde DDR op zowel de ssDNA als de chromatine platformen3,4te ontlokken. Vorige werk bleek dat rekrutering van het genoom onderhoud factoren aan deze twee verschillende platformen op DSB kan worden onderscheiden met behulp van energierijke UV-A lasers (335-365 nm) gecombineerd met als2,5. Microscopen uitgerust met dergelijke lasers zijn kostbaar, aangezien zij vereisen een hoge energie-laser en speciale UV-A-verzendende doelstellingen, waardoor ze veel minder gangbaar in academische en farmaceutische instellingen dan laser-scannen confocal microscopen met 405 nm laser lijnen. De studie van eiwit werving en uitwisseling op micro-bestraalde sites is ook uitgesloten door het moeizame handmatige beeldanalyse moet beschrijven het dynamisch gedrag van genoom onderhoud factoren.
Hier, laten we zien dat de pre sensibilisatie van cellen met BrdU of BBET nucleïnezuur vlek gevolgd door micro-bestraling met behulp van een 405 nm laser op een gemeenschappelijke confocal microscoop kan de bewaking van het genoom onderhoud factor dynamiek DNA laesies. Met behulp van γ-H2A.X of RPA complexe subeenheden als platform markers samen met z-stapelen voor groter scherptediepte en deconvolutie voor verbeterde resolutie kunt de experimentator te discrimineren factoren die lokaal worden gerekruteerd voor DSBs die verspreidde zich naar grote chromatine domeinen rondom de initiële laesie. Deze sub classificatie volgens verschillende intra nucleaire compartimenten helpt de potentiële rol van genfunctieonderzoek eiwitten gerekruteerd om micro-bestraalde sites te verfijnen. Bovendien, wij bieden handige protocollen en geoptimaliseerd pijpleidingen om snel de dynamiek van genoom onderhoud factoren met behulp van de open-sourcesoftware Fiji (een ImageJ distributie)6,7,8te analyseren. Deze verfijningen aan huidige micro-bestraling methoden maken de studie van de DDR mogelijk in vrijwel elke omgeving laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. pre sensibilisatie van cellen
- 24 uur vóór het experiment micro-bestraling zaad 40.000 U2OS cellen per putje in 1 x DMEM met 10% FBS in 8-well cultuur slides met 170 µm dik dekglaasje aan-achtige glas/polymeer bodem om ervoor te zorgen maximale doorlating van 405 nm laserlicht en uitstekende beeldvorming omgekeerde confocal microscoop met een laser-scanning. Als een 8-well-microslide, gebruik 500 µL van media of oplossingen per putje voor alle latere behandelingen en wassen stappen van het protocol.
Opmerking: Als gevolg van hun platte morfologie, goede hechting, en grote kernen, U2OS cellen vergemakkelijken de detectie van eiwit werving op micro-bestraalde sites maar andere aanhangend celtypes kunnen desgewenst worden gebruikt. Cellen moeten idealiter circa 80% confluentie ten tijde van micro-bestraling te verhogen van het aantal cellen per experiment bestraald. Zeer hoge samenvloeiing kan resulteren in wijzigingen van de celcyclus die specifieke reparatie trajecten zoals homologe recombinatie die tijdens de S en G2 fasen van de celcyclus9 plaatsvindtkunnen erover. - Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C met 5% CO2, en dan vooraf het sensibiliseren van de cellen met (stap 1.3) BrdU of (stap 1.4) BBET (Hoechst 33342).
Opmerking: Om te observeren live aanwerving van een proteïne van belang (POI's) aan DNA laesies, transfect of transduce plasmide DNA uitvoering van een fusie tussen een fluorescente proteïne en een POI 24 h na het zaaien van de cel. 24u na-transfection/signaaltransductie, vooraf sensibiliseren en micro-bestralen van de cellen voor het controleren van de aanwerving van de POI op DNA schade sites in real-time. - Het vergroten van het aantal DSBs gegenereerd door expositie aan de 405 nm laser, voeg toe 10 µM van BrdU tot de media gedurende 24 uur voorafgaand aan micro-bestraling. Spoel de cellen tweemaal met medium zonder fenol red om ervoor te zorgen maximale blootstelling van de cellen aan de 405 nm laser voorafgaand aan micro-bestraling, met behulp van een micropipet.
- Als alternatief, het behandelen van cellen voor 15 min met BBET bij 10 µg/mL in het juiste medium in een celkweek incubator bij 37 ° C. Na de behandeling, spoel tweemaal met medium zonder fenol red voorafgaand aan micro-bestraling.
2. micro-bestraling van cellen
- Selecteer een geschikte laser-scannen confocal microscoop.
Opmerking: De hier gepresenteerde experimenten werden uitgevoerd op een systeem van de Microscoop uitgerust met een 50 mW 405 nm laser lijn en een doelstelling van 63 X 1.4 numerieke diafragma olie. Voor het genereren van DSBs, cellen waren micro-bestraalde op 1 X scan zoom bij 1024 x 1024 pixels/veld (0.21 µm/pixel bij 63 X vergroting) en in de unidirectionele modus op 8 µs/pixel. De kracht van de laser gebruikt was 25% en 80% voor BBET - en BrdU-pre-gesensibiliseerde cellen, respectievelijk. Om gebruikers te helpen hun systeem configureren, werd de laser macht na doelstelling op het voorgestelde systeem gemeten met behulp van een energiemeter volgens de instructies van de fabrikant. De afmetingen komen overeen met 2.6 mW en 7.0 mW voor BBET - en BrdU-pre-gesensibiliseerde cellen, respectievelijk. -
Zet de Microscoop en het milieu kamer.
- De kamer op 37 ° C met 5% CO2 instellen voordat de monsters worden geplaatst in de on-stage incubator om te voorkomen dat onnodige stress op de cellen en om te zorgen voor homogene DDR kinetiek in experimenten.
-
Velden met goed gedistribueerde cellen selecteren, aanpassen van de focus en registreren hun positie om Beeldacquisitie na het als protocol. Verwerven van ten minste één beeld dat als een pre schade referentiepunt dienen zal moet controleren de kinetiek van eiwit werving na micro-bestraling.
Opmerking: Gerasterde kweekvat kunnen ook worden gebruikt om de lokalisatie van micro-bestraalde cellen in opeenvolgende stappen.- Aanpassen voor als experimenten cuvetten BBET-label, de focus op cellen met behulp van de 405 nm laser op de laagste laser kracht voldoende te visualiseren de cellen om ongerechtvaardigde DNA-schade te voorkomen.
- Vermijd het gebruik van widefield fluorescentie te passen de focus op BBET gebeitste cellen zoals het UV-licht door de lamp uitgestraalde DNA-beschadiging op verlichte sites zal veroorzaken.
- Als cuvetten BrdU-label, past u de focus met behulp van differentiële interferentie contrast (DIC) of fase contrast imaging door te kijken naar sub nucleaire functies zoals nucleoli.
- Als cuvetten uiting van fluorescently-geëtiketteerden POI's, selecteert u een brandvlak met representatieve fluorescentie intensiteit.
Opmerking: Vermijd cellen die uitdrukking geven aan zeer hoge niveaus van de POI als sterke overexpressie in artefactuele lokalisatie resulteren kan. Daarnaast Selecteer cellen die uitdrukking geven aan de POI op vergelijkbare niveaus (selectie van stabiele klonen is sterk aanbevolen om te minimaliseren van de variaties in POI expressie en rekrutering niveaus).
- Aanpassen voor als experimenten cuvetten BBET-label, de focus op cellen met behulp van de 405 nm laser op de laagste laser kracht voldoende te visualiseren de cellen om ongerechtvaardigde DNA-schade te voorkomen.
- Configureren van de Microscoop voor de stap van de micro-bestraling met de fluorescentie-Systeemherstel na photobleaching (FRAP) _module van het systeem.
Opmerking: De belangrijkste parameters te overwegen bij het opzetten van het systeem van de Microscoop voor micro-bestraling experimenten zijn: het vermogen van de 405 nm laser, aantal iteraties (dat wil zeggen, aantal keren de laser over dezelfde coördinaten gaat), aantal pixels/veld (op 63 X vergroting en 1 pixel resolutie 1024 x 1024 = 0,21 µm), en Nadruktijd per pixel. Al deze factoren zullen gevolgen voor de hoeveelheid energie die de cellen ervaren en bijgevolg gegenereerde (Zie discussie Zievoormeerinformatie dosis optimalisatie) schade toebrengt aan de hoeveelheid en het type van DNA. - Met behulp van de FRAP-module van het systeem van de Microscoop, micro-bestralen de cellen.
Opmerking: Op de meeste systemen, micro-bestraling van meerdere cellen kan worden uitgevoerd in een enkel veld als vlekken of lijnen/rechthoeken (meestal 1-2 µm breed). Bij het uitvoeren van live-imaging van fluorescently gelabelde proteïnen onmiddellijk na schade, beperken de micro-bestraling tot een klein aantal cellen per veld omdat de tijd genomen om elke cel micro-bestralen zal resulteren in een vertraagde inductie van de DDR. Dit is vooral belangrijk bij de bewaking van de eiwitten die zeer snel worden gerekruteerd voor DNA laesies. -
Na micro-bestraling, zet terug de multi goed dia's of platen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 , voor de vereiste duur voorafgaand aan de verwerking van de monsters voor als (sectie 5) of direct doorgaan met leven-imaging (sectie 3).
- Als een eerste stap, en vast te stellen de cellen binnen een paar minuten tot een paar uur na bestraling voor het als protocol. Afhankelijk van het POI variëren werving kinetiek. Meestal eiwitten die chromatine-geassocieerde op DSBs en SSBs zeer snel zal localiseren naar de laesie en soms worden verwijderd binnen 5 min. Sommige factoren zoals die bij de ssDNA verzamelen zullen worden aangeworven op latere tijdstippen zodra de resectie machine bezig heeft gehouden en blijven er urenlang (Zie Figuur 1 en referentie4).
3. live-imaging van Fluorescently gelabelde proteïnen
- Time-lapse beeldvorming van het micro-bestraalde cellen uit te voeren. Voor de eiwitten die zeer snel worden gerekruteerd voor laesies, een paar seconden per frame zal zijn ideaal, maar voor de eiwitten die naar het beschadigde gebied later (b.v., resectie factoren) acquisitie lokaliseren kunnen worden uitgevoerd elke 1-2 minuten totdat een plateau is bereikt.
Opmerking: De kracht van de laser voor Beeldacquisitie te vermijden bleken zo veel mogelijk en om ervoor te zorgen dat eiwit werving op schade sites niet bereikt verzadiging die signaal kwantificering uitsluiten zou minimaliseren en latere analyseert (Zie data-analyse Punt 4). Op het voorgestelde systeem, de beeldvorming werd gedaan met een 63 X / 1.4 olie objectieve met behulp van een 8 µs/pixel nadruktijd, 1024 x 1024-resolutie, 1 X zoom, en gemiddeld van 2. Merk op dat deze parameters mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor andere systemen en/of verschillende experimenten. - Micro-bestralen cellen in extra velden tot kinetiek metingen voor 15-30 cellen worden verkregen. Herhaal de experimenten ten minste 3 keer in biologische replicatieonderzoeken de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de kinetiek van de aanwerving te waarborgen.
Opmerking: Bij de aanpassing van dit protocol aan een specifieke confocal systeem, het wellicht nuttig om te beginnen door het toezicht op de kinetiek van de aanwerving van een bekende fluorescently-geëtiketteerden genoom onderhoudsfactor (b.v., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, enz.). Met behulp van live-imaging voor het optimaliseren van micro-bestraling voorwaarden, kan de gebruiker voor het testen van meerdere parameters snel.
4. aanwerving kinetiek analyse
- De analyse van de Microirradiation plugin10 in de Fiji beeld analyse software11installeren
-
Open de verworven afbeeldingen in Fiji. Selecteer "De schade Analyzer" in het pull-down plugins menu in de Microirradiation Analysis suite. Volg de aanwijzingen naar een gebied op de achtergrond van belang (ROI) (meestal 3 x 3 µm) en niet-bestraalde en bestraalde ROIs in elke cel van micro-bestraalde definiëren.
- Gebruik ROIs van de zelfde grootte te minimaliseren van potentiële fouten in betekenen signaal intensiteit. Voor verworven beelden, omvatten ook ten minste één pre bestraling frame die worden gebruikt als een basislijn voor het controleren van aanwerving op micro-bestraalde sites.
- Zodra alle ROI gegevens zijn verzameld over de volledige time-lapse serie, sla het bestand gemaakt door de plugin met de resultaten als een csv (door komma's gescheiden bestand) of txt bestand (tab is scheidingsteken). Dit bestand bevat metingen van de gemiddelde intensiteit voor elk tijdstip en elke ROI (bedoel intensiteit achtergrond, betekenen intensiteit nietdoorstraald, en bedoel intensiteit bestraald).
Opmerking: De plugin wordt automatisch afgetrokken de achtergrond intensiteit (ikb) van de intensiteit van de bestraalde ROIs (iks) en de niet-bestraalde ROIs (ikn). Het berekent ook een verhouding tussen beide waarden (Zie de onderstaande formule) om te corrigeren voor photobleaching (Irradiated/niet-bestraalde).
De plugin ook berekent een normalisatie tussen het eerste punt van de tijd (waarde ingesteld op 1) en alle andere tijd punten voor elke kern (verhouding ten opzichte van het eerste punt van de tijd). Meer informatie vindt u op de website plugin10.
-
Het uitvoeren van de analyse met behulp van de plugin voor alle micro-bestraalde cellen (ten minste 15 – 30 cellen) en grafiek de gemiddelde relatieve verrijking op micro-bestraalde regio's na verloop van tijd. Bereken de standaardfouten van de gemiddelde voor elk punt en plot ze.
- Bevestigen van de verschillen in werving kinetiek tussen twee experimentele omstandigheden door het uitvoeren van de Student t-tests voor elk gegevenspunt.
5. Indien Protocol
-
ALS oplossingen voor te bereiden. Bereid de oplossing van de pre/post-extraction (ijskoude 1 x PBS met 0,25% Triton X-100), oplossing wassen (1 x PBS met 0,05% Tween-20), blokkeren van oplossing (1 x PBS met 3% BSA en 0,05% Tween-20), en fixatie oplossing (Paraformaldehyde 3% + sacharose 2% in PBS 1 x) in conische polypropyleen-buizen.
Opmerking: Voor een enkel 8-well microslide, 10 mL pre/post-extraction oplossing, 50 mL oplossing van blokkerende 10 mL en 5 mL van de oplossing van de fixatie te wassen zijn.- Bereid de oplossing van de fixatie.
- Onder een chemische motorkap, meng 400 mL tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O) met 15 g paraformaldehyde en 30 µL van 10 N NaOH in een erlenmeyer van 1 L.
- Sluit de container en warmte bij 65 ° C op een warmhoudplaat magneetroerder tijdens het roeren om te solubilize de paraformaldehyde volledig.
- Met behulp van een precisiepipet 25 mL, voeg 50 mL 10 X PBS, roer en filter door middel van een 0,45 µm filter.
- Voeg 10 g van sacharose en vul tot 500 mL met ddH2O.
- Aliquot de oplossing in de conische buisjes 15 mL; bewaren bij-20 ° C tot gebruik.
- De kernen kleurstofoplossing door verdunning van een stamoplossing van 1 mg/mL van 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 in 1 x PBS voor te bereiden.
- Bereid de oplossing van de fixatie.
- Met behulp van een micropipet, zorgvuldig Verwijder het medium van de putten van de multi goed microscopie dia's of platen en onmiddellijk wassen met 500 µL van als wassen oplossing door het veranderen van de oplossing twee keer zonder te wachten.
Opmerking: De hier gepresenteerde als gegevens werden verkregen met behulp van cellen gekweekt in 8-well microscopie dia's die werden gewassen en geïncubeerd in 500 µL van alle oplossingen. Volumes moeten worden aangepast afhankelijk van de cel cultuur recipiënten die worden gebruikt door onderzoekers. Bovendien voeren het als protocol met uiterste zorg zoals cellen gemakkelijk van de onderkant van de glazen/polymeer losmaken kunnen. Gebruik een micropipet voor alle wijzigingen van de oplossing om te minimaliseren van cel verlies. - Incubeer op ijs voor 5 min met 500 µL van ijskoud als pre/post-extraction oplossing en swirl zachtjes met de hand voor 15 – 30 s voor het uitvoeren van de pre-winning stap die meest cytoplasmatische en nucleoplasmic eiwitten verwijdert en het signaal van de chromatine maximaliseert / DNA-geassocieerde factoren.
- Wassen tweemaal met 500 µL van als wassen oplossing.
- Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 500 µL van als fixatie oplossing. Ook gebruiken een pre-en-klare paraformaldehyde-oplossing (3-4%) voor de fixatie stap.
- Wassen tweemaal met 500 µL van als wassen oplossing.
- Incubeer op ijs gedurende 5 min. in 500 µL van ijskoud als pre/post-extraction oplossing en swirl van de dia voorzichtig met de hand de permeabilization stap moet uitvoeren.
- Wassen tweemaal met 500 µL van als wassen oplossing.
- Incubeer ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur met 500 µL van als blokkerende oplossing.
- Verwijderen van blokkerende oplossing met behulp van een micropipet en na een nacht bebroeden in een bevochtigde ruimte bij 4 ° C met 250 µL primaire antilichamen verdunde oplossing te blokkeren.
Opmerking: Het is raadzaam voor het uitvoeren van de incubatie met primaire antilichamen opeenvolgend om te voorkomen dat potentiële artefacten van co lokalisatie. Zodra de nodige controles zijn verricht, incubeer gelijktijdig primaire antilichamen om te versnellen het proces. - Wassen vier keer gedurende 5 min. in 500 µL van als wassen oplossing met zachte agitatie (60 rpm op een rotator).
- Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met 250 µL van secundaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing in een bevochtigde kamer.
Opmerking: De monsters behoeden voor licht op toevoeging van secundaire antilichamen fluorescently-label. - Was viermaal voor 5 min in 500 µL van als wassen oplossing met zachte agitatie.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. in 500 µL van 1 x PBS, met 1 µg/mL DAPI om vlek kernen.
- Wassen tweemaal met 500 µL van 1 x PBS en laat cellen in 500 µL 1 x PBS oplossing voor imaging.
- Met behulp van gerasterde dia's of geregistreerde podium posities, vinden de micro-bestraalde cellen met behulp van een goed gekarakteriseerd DNA schade markering (b.v., γ-H2A.X, RPA32, enz.).
- Het imago van de multi goed cultuur dia's of platen in alle relevante kanalen met behulp van de juiste instellingen op een laser-scanner confocal microscoop.
Opmerking: Op het voorgestelde systeem, de beeldvorming werd gedaan met een 63 X / 1.4 olie objectieve met behulp van een 8 µs/pixel nadruktijd, 1024 x 1024-resolutie, 1 X zoom, en gemiddeld van 2. Merk op dat deze parameters mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor andere systemen en/of verschillende experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naar aanleiding van micro-bestraling, cellen zijn toegestaan om te herstellen voor een bepaalde periode van tijd, afhankelijk van de aard van het genoom onderhoud eiwitten1,12. DSBs zullen worden verwerkt door nucleasen, meest uitgebreid tijdens de S en G2 fasen van de celcyclus, maken een beperkt gebied van ssDNA die snel is bekleed door RPA en andere genoom onderhoud factoren9. Deze ssDNA regio is omgeven door chromatine die uitgebreid tijdens de DDR te regelen van de rekrutering en de uitwisseling van andere DDR factoren13is gewijzigd. Eiwit werving aan micro-bestraalde regio's kan worden gecontroleerd door IF (figuur 1A). Chromatine-geassocieerde factoren (bijvoorbeeldγ-H2A.X, 53BP1, etc.) zijn meestal detecteerbare op eerdere (1 – 5 min) tijd punten dan ssDNA-gebonden eiwitten omdat nuclease-gemedieerde resectie van DSB uiteinden is vereist voor het genereren van het RPA-ssDNA-platform (≥10 min). Ter vergemakkelijking van de beeldanalyse en publicatie, hebben wij bedacht een Fiji script (The Outliner)10 waarin automatisch celkernen met behulp van een DNA kleurstof-geassocieerde kanaal (b.v.DAPI), waardoor het makkelijker om te onderscheiden van micro-bestraling strepen en afzonderlijke cellen door het weglaten van de uninformative DNA kleuring van de laatste beelden met behoud van de nucleaire definitie (figuur 1B).
Γ-H2A.X en RPA complexe subeenheden fungeren als markers voor chromatine - en ssDNA-geassocieerde factoren, respectievelijk. RPA-ssDNA wordt weergegeven als punctate foci omringd door grote fluorescerende chromatine strepen versierd door het antilichaam van de γ-H2A.X (Figuur 1 c). Co lokalisatie met deze markers kan precies bepalen de positie van genoom onderhoud factoren op DNA laesies worden gebruikt. Bijvoorbeeld, lokaliseert 53BP1, een chromatine-geassocieerde proteïne die controles van de DSB reparatie traject keuze, mede goed met de γ-H2A.X signaal13. Omgekeerd, PRP19, een E3 ubiquitin ligase dat functies op RPA-ssDNA ATR activering en DNA-herstel te bevorderen is aangeworven als punctate foci die aansluiten op de RPA32 distributie14,15,16,17 (Figuur 1 d). Van de nota, sommige factoren kunnen ook op de chromatine grenzend aan de eerste letsels worden aangeworven, maar verspreiden niet te grote domeinen rondom de DSBs zoals γ-H2A.X en 53BP1. In dergelijke gevallen, deze factoren weergegeven als punctate foci maar zou niet perfect samen lokaliseren met ssDNA-gebonden eiwitten.
Voor levende cellen imaging, cellen, uiting geven aan een POI gelabeld met een fluorescerende marker kan micro-bestraalde en beeld in real time gedetailleerde om te verkrijgen zeer werving kinetiek (figuur 2A-C). Meerdere verschillende eiwitten kunnen gelijktijdig worden waargenomen, mits hun fluorescerende etiketten spectraal kunnen worden gescheiden van elkaar. Om de analyse van tijdreeksen, hebben we twee Fiji scripts waarmee de gebruiker om filmbestanden met tijd-serie informatie (Movie Maker, zie films van figuur 2C als Online aanvullend materiaal) te maken en te kwantificeren van eiwit Recruitment micro-bestraalde sites (schade Analyzer)10. In plaats van de tijdrovende manuele afbeelding curatie gewoonlijk vereist is voor het beschrijven van het gedrag van een eiwit, begeleidt het manuscript van de Analysator van de schade de gebruiker door gestroomlijnde stappen die signaal verrijking op micro-bestraalde sites, terwijl automatisch controleren correctie voor cel verkeer, tijde afbeelding drift, achtergrond signaal, en bleken ten allen punten van het experiment. De gegenereerde gegevens kan vervolgens worden gemakkelijk wordt verzameld in een spreadsheetprogramma en uitgezet als nodig (figuur 2D).
Figuur 1: Lokalisatie van genoom onderhoud factoren de chromatine en RPA-ssDNA platforms op micro-bestraling-geïnduceerde laesies. (A) Laser-micro-bestraling in vooraf gesensibiliseerde cellen leidt tot de productie van DNA double-stranded einden, waarmee zijn gereseceerd door endo - en exo-nucleasen voor het genereren van ssDNA. De ssDNA sub compartiment kan worden gevisualiseerd als punctate foci met behulp van antilichamen tegen replicatie EiwitA of andere ssDNA-gelokaliseerde factoren. Daarentegen weergegeven eiwitten of wijzigingen die verspreidde zich naar grote chromatine domeinen als grote strepen op de micro-bestraalde site is vergelijkbaar met het patroon waargenomen met antilichamen gericht op de gefosforyleerd Histon variant H2A. X (Γ-H2A.X). (B) cellen vooraf gesensibiliseerde met BBET of BrdU waren micro-bestraalde, vooraf uitgepakte, vaste en gekleurd voor de aangegeven eiwitten. 12-bits afbeeldingen werden verzameld op 1 X zoom en verwerkt met behulp van het script Outliner Fiji. (C) Z-stapeling van BBET of BrdU vooraf gesensibiliseerde cellen kunt de resolutie van ssDNA - en chromatine-geassocieerde factoren (maximale intensiteit Z-projectie komt te staan). (D) gebruiken die deze methode, de 53BP1 en de PRP19 kan worden aangemerkt als chromatine - en ssDNA-geassocieerde genoom onderhoud factoren, respectievelijk. Schaal bars = 10 µm; beelden in D zijn allemaal op dezelfde schaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Live-imaging van RPA complexe recruitment naar sites van DNA-schade. (A) stabiel of voorbijgaande transfectie van plasmiden codering kandidaat-eiwitten gelabeld met de fluorescerende verslaggevers gevolgd door micro-bestraling van transfected cellen zorgt voor de de opvolging van eiwit werving aan DNA laesies in real-time. (B) cellen transfected waren met een pDEST47-RPA32-GFP plasmide en lysed 24 h later. Eiwit expressie werd bevestigd door immunoblotting. (C) cellen transfected met pDEST-SFB EGFP of pDEST47 RPA32-GFP plasmiden vooraf gesensibiliseerde personen met BrdU werden micro-bestraalde en beeld op 12-bit op 1 X zoom eenmaal per minuut na bestraling. Timing is in minuten na bestraling. De afbeelding van 00:00 tijd werd genomen voorafgaand aan micro-bestraling. Filmbestanden zijn gemaakt met behulp van het script van de film Maker Fiji en sleutelframes worden weergegeven. Schaal bars = 10 µm. (D) werving van RPA32-GFP aan micro-bestraling strepen was kwantitatief gecontroleerd met behulp van de schade Analyzer Fiji-script. Uitvoergegevens waren uitgezet met behulp van Microsoft Excel. De zwarte lijn is de gemiddelde verrijking-vouw van RPA32-GFP op micro-bestraalde plaatsen ten opzichte van het pre bestraling signaal en de foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde van 15 onafhankelijk micro-bestraalde cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: Micro-bestraling time-lapse van SFB-GFP waarin cellen. Transient met een pDEST-SFB GFP plasmide transfected cellen waren vooraf gesensibiliseerde 24u met BrdU, micro-bestraalde en verbeelde eenmaal per minuut voor 29 min. gelieve Klik hier om deze film te downloaden.
Movie 2: Micro-bestraling time-lapse van RPA32-GFP waarin cellen. Transient met een pDEST47 RPA32-GFP plasmide transfected cellen waren vooraf gesensibiliseerde 24u met BrdU, micro-bestraalde en verbeelde eenmaal per minuut voor 29 min. gelieve Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven methoden kunt, 405 nm laser-micro-bestraling van vooraf met BBET of BrdU gesensibiliseerde cellen de gelokaliseerde generatie van DNA letsels, met inbegrip van DSBs binnen de kernen van aanhangend menselijke cellen. Kinetiek van de DDR op deze DSBs zijn vergelijkbaar met die worden gegenereerd met andere methoden in eukaryote cellen9,18,19. DSB resectie op micro-bestraalde sites leidt tot ssDNA-generatie die kan worden gevolgd met behulp van een RPA32-targeting antilichaam of een RPA32-GFP-fusion. Chromatine-geassocieerde factoren, aan de andere kant, kunnen worden gelokaliseerd met behulp van de γ-H2A.X als referentie. Sommige factoren chromatine-geassocieerde kunnen niet worden verspreid vanaf de eerste DSB zoveel γ-H2A.X en zal verschijnen als punctate foci dat onderscheiden van ssDNA-bindende proteïnen foci worden kunnen.
Zodra de DSBs worden gegenereerd, kunnen eiwit werving en de ontmijning van schade sites worden gecontroleerd door als op vaste cellen. Om deze experimenten kunnen uitvoeren, moet alleen een geschikt als antilichaam tegen het POI. Als als-compatibele antilichamen niet beschikbaar zijn, plasmiden kunnen worden ontworpen in de genen van belang in frame met specifieke epitopes uitvoering (bijvoorbeeld: vlag, zijne-tag) of fluorescerende eiwitten. Voorbijgaande of stabiele transfectie/transductie van deze plasmiden in Adherente cellen kan vervolgens worden gebruikt om te bepalen of een specifieke factor actief aangeworven is beschadigd DNA. Overexpressie van eiwitten kan leiden tot verkeerde lokalisatie en kan kunstmatig te stimuleren hun aanwerving aan micro-bestraalde strepen. Om resultaten te verkrijgen die meer representatief voor endogene proteïnen zijn, kan CRISPR-Cas9-technologie nu worden gebruikt om te taggen van een gen van belang met geschikte epitopes20,21.
De Python scripts die in de micro-bestraling analyse Fiji Plugin vergemakkelijken de visualisatie, presentatie, publicatie en analyse van de DDR eiwitten kinetiek. Dit analyse pakket is open-source en functies ongeacht het platform van de Microscoop gebruikt micro-bestraling experimenten en beeldacquisitie uit te voeren. Alles wat nodig is is dat de opnamen op de microscopie platform zoals Bio-formaten-compatibele bestanden22worden opgeslagen. Sinds achtergrond, drijven, en bleken correcties worden automatisch uitgevoerd, analyse van eiwitniveaus op DNA schade sites met de meegeleverde scripts is eenvoudig en zeer snel in vergelijking met de kwantificering van de typische handmatige signaal uitgevoerd met Microscoop software voor de verwerving van de afbeelding.
Zoals beschreven in het protocol, gebruikers zorgvuldig moeten configureren hun respectieve laser-scannen confocal microscoop systemen ter verwezenlijking van de juiste hoeveelheid schade veroorzaken DSBs die normale DDR kinetiek volgen. Inderdaad, de hoeveelheid en het type van DNA laesies gegenereerd door micro-bestraling zal afhangen van de golflengte van de laser en de dosis alsmede op de overgevoeligheid van de pre-methoden. Gebruikers moeten houden in het achterhoofd dat hoewel DSBs worden gegenereerd door de hier beschreven voorwaarden, 405 nm laser-micro-bestraling van de photosensitized cellen ook een mengsel van andere DNA letsels, met inbegrip van cyclopyrimidine Dimeren (CPDs), SSBs, zal genereren en geoxideerd grondslagen, die tussen de systemen van de Microscoop en instellingen23,24,25 variëren zal. Dus, een zorgvuldige controle van de letsels op micro-bestraalde sites moet worden uitgevoerd om een alomvattend beeld krijgen van de schade gegenereerd en de reactie ontlokte. Nog belangrijker is, om te studeren het antwoord op DSBs, moet elk Microscoop-systeem worden geoptimaliseerd door monitoring van de kinetiek van canonieke DNA schade eiwitten en posttranslationele modificaties op micro-bestraalde sites. Bijvoorbeeld, γ-H2A.X en de RPA complexe subeenheden (RPA70, RPA32 of RPA14) kunnen worden gebruikt een gunstige zoals ze vrij gemakkelijk zijn te detecteren en snel accumuleren op DSBs. Als een vuistregel, γ-H2A.X signaal moet worden gevisualiseerd als strepen op vroege (5 min) en laat (tot 3-4 h) tijd erop na schade terwijl het RPA moet beginnen zich ophopen als punctate foci ongeveer 10-15 min na-micro-bestraling. Als het signaal van een pan-nucleaire γ-H2A.X wordt waargenomen, wordt de hoeveelheid energie die zijn ontvangen door de cellen is niet-fysiologische en zal resulteren in snelle celdood.
Er zijn enkele beperkingen die worden beschouwd moet wanneer met behulp van een 405 nm laser voor de studie van specifieke DNA-reparatie studierichtingen. Bijvoorbeeld, hoewel de BBET-405 nm combinatie gemakkelijk een combinatie van SSBs en DSBs produceert, het genereert geen 6-4 photoproducts (6-4 PPs) en bijgevolg de kinetiek van de aanwerving van nucleotide excisie reparatie eiwitten zijn anders dan die waargenomen met behulp van UV-C micro-bestraling. De kinetiek en de omvang van de aanwerving van verschillende eiwitten die betrokken zijn in het antwoord op DSBs kunnen ook verschillen naargelang het DNA beschadigen van de methode die gebruikt23 wordt. Omwille van deze variaties, is het raadzaam dat gebruikers hun systemen passen te maximaliseren van het type van laesies die potentieel door hun POI's worden herkend. Hoewel dergelijke systemen minder breed beschikbaar zijn, gebruik maken van andere soorten lasers met inbegrip van UV-A (337-355 nm) of femtoseconde nabij-infrarood (800 nm) samen met verschillende sensibilisatie reagentia (bijvoorbeeld: tri-methyl psoralen) kunnen gebruikers genereren meer specifieke DNA laesies afhankelijk van het DNA herstellen trajecten onder studie24,26.
Wanneer nieuwe voorwaarden worden getest, is het handig om gebruik gevestigde eiwitten voor DNA-reparatie fluorescently-geëtiketteerden doses, golflengten, en pre sensibiliserende combinaties te testen, en om ervoor te zorgen dat de laesie van belang efficiënt wordt gegenereerd. Bijvoorbeeld, PARP1 en XRCC1 kan functioneren als markeringen voor SSB en base-excisie reparatie XPA is een goede indicator van de nucleotide excisie reparatie en 53BP1 zullen worden aangeworven DSBs en functie in niet-homologe einde-deelname aan (verwijst naar23,25 2827, ,). Antilichamen die herkent wijzigingen die zijn gekoppeld aan specifieke soorten DNA-beschadiging kunnen ook worden gebruikt voor het kwantificeren van de niveaus van DNA adducten of breekt. Het is dus mogelijk toezicht op geoxideerde basen, cyclopyrimidine Dimeren, 6-4 PPs, SSBs (met behulp van poly-ADP ribose antilichaam) en DSBs (γ-H2A.X en 53BP1) door als te bepalen van de parameters die zal het bereiken van het hoogste niveau van de gewenste laesies23, 27 , 29. met nauwlettend te worden gevolgd, moeten gebruikers kunnen bestuderen van hun traject van de reparatie van belang met behulp van micro-bestraling.
Over het geheel genomen het gebruik van wide-spread laser-scannen confocal microscopen uitgerust met 405 nm laserlijnen voor het genereren van gelokaliseerde DSBs, gecombineerd met platform-specifieke DNA-merkers voor schade aan het sub classificeren genoom onderhoud factoren, en gestroomlijnde gegevens verwerking met behulp van de micro-bestraling analyse Fiji plugin, zou moeten maken de studie van DDR factoren dynamiek toegankelijker dan ooit tevoren voor zowel ervaren en beginnende onderzoekers van het genoom onderhoud veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [Discovery subsidie 5026 A.M] en door een volgende generatie van wetenschappers beurs van de Cancer Research Society [21531 naar A.M]. Wij danken Jean-François Lucier voor het uitstekende kwaliteitscontrole van de Fiji Python scripts en advies verstrekken over statistische analyse. Wij danken Dr. Stephanie A. Yazinski voor de als recept voor de oplossing van de fixatie. We bedanken Paul-Ludovic Karsenti voor hulp met laser macht metingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
