Summary
Studera DNA skador reparation kinetik kräver ett system att inducera lesioner vid definierade sub nukleära regioner. Vi beskriver en metod för att skapa lokaliserade dubbelsträngat raster med laserskanning confocal Mikroskop utrustad med en 405 nm laser och tillhandahålla automatiserade procedurer för att kvantifiera dynamiken i reparation faktorer vid dessa skador.
Abstract
DNA skador svar (DDR) använder en uppsjö av proteiner för att upptäcka, signal och reparera DNA lesioner. Avgränsar detta svar är avgörande att förstå genomet underhåll mekanismer. Eftersom rekrytering och utbyte av proteiner vid lesioner är mycket dynamisk, kräver deras studie förmågan att generera DNA-skador i en snabb och rumsligt-avgränsat sätt. Här, beskriver vi procedurer för att lokalt inducerar DNA-skador i mänskliga celler med allmänt tillgängliga laserskanning confocal Mikroskop utrustad med en 405 nm laserlinje. Ansamling av genomet underhåll faktorer på laser ränder kan bedömas genom immunofluorescens (om) eller i realtid med hjälp av proteiner med fluorescerande reportrar etiketten. Använda fosforyleras Histon H2A. X (γ-H2A.X) och replikering Protein A (RPA) som markörer, metoden ger tillräcklig upplösning att diskriminera lokalt rekryterade faktorer från dem som sprids på intilliggande kromatin. Vi tillhandahåller ytterligare ImageJ-baserade skript för att effektivt övervaka kineticsen av protein relocalization på DNA skada platser. Dessa förbättringar underlättar studier av DDR dynamiken.
Introduction
Celler utsätts ständigt för endogena och exogena källor av DNA-skada som hotar deras genomisk integritet. DDR är en ensemble av signalering vägar att upptäcka, signal och reparera DNA skador för att upprätthålla genomet stabilitet. Vid DNA dubbelsträngat raster (DSBs), DDR uppstår främst på två kompletterande plattformar: γ-H2A.X-märkt kromatin och en opererande enkelsträngat DNA (ssDNA) region vanligtvis belagd med ssDNA-bindande komplexa RPA1,2.
UV-laser mikro-bestrålning av celler som redan sensibiliserats med den tymidin analoga 5-brom-2' deoxiuridin (BrdU) eller bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA färgen skapar en blandning av DNA lesioner inklusive enkelsträngat raster) SSBs) och DSBs som framkalla en lokaliserad DDR på både kromatin och ssDNA plattformar3,4. Tidigare arbete visade att rekrytering av genomet underhåll faktorer dessa två distinkta plattformar på DSB kan diskrimineras använder energirika UV-A laser (335-365 nm) kombinerat med om2,5. Mikroskop utrustat med sådana lasrar är kostsamma eftersom de kräver en hög energi laser och dedikerad UV-A sändande mål vilket gör dem betydligt mindre utbredd i akademiska och farmaceutiska inställningar än laserskanning confocal Mikroskop med 405 nm laser linjerna. Studien av protein rekrytering och utbyte på mikro-bestrålade platser hindras också av den mödosamma manuell bildanalys som krävs för att beskriva dynamiska beteende av genomet underhåll faktorer.
Här visar vi att det före sensibilisering av celler med BrdU eller BBET nukleinsyra fläcken följt av mikro-bestrålning med en 405 nm laser på gemensamma confocal Mikroskop tillåter övervakning av genomet underhåll faktor dynamics på DNA lesioner. Med γ-H2A.X eller RPA komplexa subenheter som plattform markörer tillsammans med z-stapling för större skärpedjup och deconvolution för förbättrad upplösning tillåter försöksledaren att diskriminera faktorer som rekryteras lokalt att DSBs från dem som spridit sig till stora kromatin domäner kring första lesionen. Denna sub klassificering enligt olika transaktioner inom nukleär fack hjälper till att förfina de potentiella rollerna av uncharacterized proteiner som rekryteras till mikro-bestrålade platser. Dessutom, vi tillhandahåller bekväm protokoll och optimerad rörledningar för att snabbt analysera dynamiken i genomet underhåll faktorer med hjälp av den programvara med öppen källkod Fiji (en ImageJ distribution)6,7,8. Dessa förbättringar gällande micro-bestrålning metoder göra studiet av DDR möjligt i praktiskt taget alla laboratoriemiljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. före sensibilisering av celler
- 24 h före mikro-bestrålning experimentet, utsäde 40.000 U2OS celler per brunn i 1 x DMEM innehållande 10% FBS i 8-väl kultur glider med 170 µm tjock täckglas-liknande glas/polymer bottnar att säkerställa maximal transmittans 405 nm laserljus och utmärkta imaging med en laser-scanning inverterad confocal mikroskopet. Om en 8-väl microslide Använd 500 µL av media eller lösningar per brunn för alla efterföljande behandlingar och tvätta steg i protokollet.
Obs: På grund av deras platta morfologi, god vidhäftning och stora kärnor, U2OS celler underlätta upptäckt av protein rekrytering på mikro-bestrålade platser men andra fastsittande celltyper kan användas efter behov. Cellerna bör helst vara runt 80% konfluens vid tidpunkten för mikro-bestrålning att öka antalet bestrålade celler per experiment. Mycket hög sammanflödet kan resultera i cellcykeln förändringar som kan störa specifika reparation vägar såsom homolog rekombination som äger rum under de S och G2 faserna av cellcykeln9. - Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C med 5% CO2, och sedan pre medvetandegöra cellerna med (steg 1.3) BrdU eller (steg 1.4) BBET (Hoechst 33342).
Obs: För att observera levande rekrytering av ett protein av intresse (POI) för DNA-skador, transfect eller transduce plasmid DNA bär en fusion mellan en fluorescerande protein och en POI 24 h efter cell sådd. 24 h efter-transfection/transduktion, pre känslig och mikro-bestråla cellerna för att övervaka rekryteringen av POI på DNA skada platser i realtid. - För att öka antalet DSBs genereras av exposition till 405 nm laser, lägga till 10 µM av BrdU media för 24 h före mikro-bestrålning. Innan mikro-bestrålning, med hjälp av en mikropipett, skölj cellerna två gånger med medium utan fenolrött att säkerställa maximal exponering av cellerna till 405 nm laser.
- Alternativt kan behandla celler för 15 min med BBET på 10 µg/mL i lämpligt medium i en cellkultur inkubator vid 37 ° C. Efter behandling, skölj två gånger med medium utan fenolrött före mikro-bestrålning.
2. micro-bestrålning av celler
- Välj lämplig laserskanning confocal Mikroskop.
Obs: De experiment som presenteras här utfördes på ett Mikroskop system utrustade med en 50 mW 405 nm laserlinje och ett 63 X 1.4 numeriska bländaröppningen olja mål. För att generera DSBs, celler var mikro-bestrålade 1 X scan zoom på 1 024 x 1 024 pixlar/field (0.21 µm/pixel på 63 X förstoring) och i enkelriktad läge på 8 µs/pixel. Laser kraft används var 25% och 80% för BBET - och BrdU-pre-sensibiliserade celler, respektive. För att hjälpa användarna att konfigurera sina system, mättes laser power efter målet på systemet presenteras med hjälp av en kraftmätare enligt tillverkarens anvisningar. Mätningarna motsvarar 2,6 mW och 7.0 mW för BBET - och BrdU-pre-sensibiliserade celler, respektive. -
Slå på mikroskopet och klimatkammare.
- Ställa in kammaren till 37 ° C med 5% CO2 innan prover placeras på scenen inkubatorn att undvika onödig stress i cellerna och att säkerställa homogen DDR kinetik hela experiment.
-
Välj fält med väl distribuerade celler, justera fokus och registrera sin ställning för att underlätta bild förvärv efter om protokollet. Skaffa minst en bild som kommer att tjäna som före skadan referenspunkt att övervaka kineticsen av protein rekrytering efter mikro-bestrålning.
Obs: Inrutade odlingskärl kan också användas för att underlätta lokaliseringen av mikro-bestrålade celler vid efterföljande steg.- För om experiment med BBET-märkt celler, justera fokus på celler med 405 nm laser vid den lägsta lasereffekten som är tillräcklig för att visualisera cellerna för att undvika omotiverade DNA-skador.
- Undvik att använda widefield fluorescens för att justera fokus på BBET-färgade celler som UV-ljuset som avges av lampan kommer inducerar DNA-skador på belysta objekt.
- Om du använder BrdU-märkt celler, justera skärpan med hjälp av differentiell störningar kontrast (DIC) eller faskontrast avbildning genom att titta på sub nukleära funktioner såsom nukleolerna.
- Om du använder celler som uttrycker fluorescently-märkt intressepunkter Välj ett fokalplan med representativa fluorescensintensiteten.
Obs: Undvik celler som uttrycker mycket höga nivåer av POI som starkt överuttryck kan resultera i artefaktiska lokalisering. Välj dessutom celler som uttrycker POI på jämförbara nivåer (urval av stabil kloner rekommenderas starkt att minimera variationer i POI uttryck och rekrytering).
- För om experiment med BBET-märkt celler, justera fokus på celler med 405 nm laser vid den lägsta lasereffekten som är tillräcklig för att visualisera cellerna för att undvika omotiverade DNA-skador.
- Konfigurera mikroskopet för mikro-bestrålning steg med fluorescens-återhämtningen efter fotoblekning (FRAP) _module av systemet.
Obs: De viktigaste parametrarna att överväga när inställning-upp det Mikroskop systemet för mikro-bestrålning experiment är: uteffekten från 405 nm laser, antalet iterationer (dvs. antal gånger lasern kommer att gå över samma koordinater), antal pixlar/fält (63 X förstoring och 1 024 x 1 024 upplösning, 1 pixel = 0.21 µm), och uppehållstid per pixel. Alla dessa faktorer kommer att påverka mängden energi som cellerna uppstå och därmed mängden och typen av DNA skada genererade (se diskussionen ytterligare dos optimering information). - Använda modulen FRAP Mikroskop systemet, mikro-bestråla cellerna.
Obs: På de flesta system, mikro-bestrålning av flera celler kan utföras i ett enda fält som fläckar eller linjer/rektanglar (vanligtvis 1-2 µm breda). När du utför live-imaging av fluorescently-märkta proteiner omedelbart efter skada, begränsa mikro-bestrålning till ett litet antal celler per fält eftersom den tid det tar att mikro-bestråla varje cell kommer att resultera i en fördröjd induktion av DDR. Detta är särskilt viktigt vid övervakning av proteiner som rekryteras mycket snabbt till DNA lesioner. -
Efter mikro-bestrålning, sätta tillbaka flera diabilder eller plattor i en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 under hela krävs före bearbetning prover för om (avsnitt 5) eller omedelbart gå vidare med live-imaging (avsnitt 3).
- Som ett första steg, fixa cellerna inom några minuter och upp till några timmar efter strålning för om protokollet. Beroende på POI, kan rekrytering kinetik variera. Vanligtvis proteiner som är kromatin-associerade på DSBs och SSBs kommer att lokalisera mycket snabbt att lesionen och ibland tas bort inom 5 min. Vissa faktorer såsom de som monterar på ssDNA kommer att rekryteras vid senare tidpunkter när resektion maskiner har varit engagerad och stanna kvar där i timmar (se figur 1 och referens4).
3. live-imaging av Fluorescently-märkta proteiner
- Utföra time-lapse avbildning av mikro-bestrålade cellerna. För proteiner som rekryteras mycket snabbt till lesioner, några sekunder per bildruta blir perfekt, men för proteiner som lokaliserar till det skadade området senare (t.ex., resektion faktorer), förvärv kan vara utfört varje 1 – 2 min tills en platå uppnås.
Obs: Minimera laser kraften för bild förvärv att undvika blekning så mycket som möjligt och se till att protein rekrytering på skada platser inte når mättnad som utesluter signal kvantifiering och efterföljande analyser (se dataanalys (Se avsnitt 4). På presenterade systemet, bildtagning utfördes med en 63 X / 1.4 objektiv med en 8 µs/pixel dröjtiden, 1 024 x 1 024 upplösning, 1 X zoom, och i genomsnitt 2. Observera att dessa parametrar kan behöva optimeras för andra system eller olika experiment. - Micro-bestråla cellerna i ytterligare fält tills kinetik mätningar erhålls för 15-30 celler. Upprepa experimenten minst 3 gånger i biologiska replikat att säkerställa noggrannheten och reproducerbarheten av rekrytering kineticsen.
Obs: När anpassa detta protokoll till en specifik confocal system, kan det vara användbart att starta genom att övervaka rekryteringen kineticsen av en känd fluorescently-märkt genomet bibehållningsfaktor (t.ex., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, etc.). Använda live-imaging för att optimera mikro-bestrålningsvillkoren tillåter att användaren att testa flera parametrar snabbt.
4. rekrytering kinetik analys
- Installera den Microirradiation analysen plugin10 i Fiji bild analys programvara11.
-
Öppna de förvärvade bilderna i Fiji. Välj ”The skada Analyzer” från menyn pull-down plugins i programsviten Microirradiation analys. Följ anvisningarna för att definiera en bakgrund region av intresse (ROI) (vanligtvis 3 x 3 µm) och obestrålat och bestrålat ROIs i varje mikro-bestrålade cell.
- Användning ROIs i samma storlek att minimera potentiella fördomar i menar signal stödnivåer. För förvärvade bilder, även innehålla minst en före bestrålning ram som kommer att användas som en baslinje för att övervaka rekryteringen vid mikro-bestrålade platser.
- När alla ROI data har samlats under full time-lapse serien, spara den fil som skapas av plugin som innehåller resultaten som en csv (kommaavgränsad fil) eller txt fil (tabbavgränsad). Den här filen innehåller mätningar av genomsnittliga intensiteten för varje tidpunkt och varje ROI (menar intensitet bakgrund, menar intensitet icke-bestrålade, och menar intensitet bestrålade).
Obs: Plugin automatiskt subtraherar bakgrund intensiteten (jagb) från intensiteten i de bestrålade ROIs (jags) och de icke-bestrålade ROIs (jagn). Det beräknar också förhållandet mellan båda värdena (se formeln nedan) för att korrigera för fotoblekning (Irradiated/icke-bestrålade).
Insticksprogrammet beräknar också en normalisering mellan den första tidpunkten (värdet 1) och alla andra punkter för varje nucleus (förhållandet i förhållande till första tidpunkt). Ytterligare information kan hittas på plugin webbplats10.
-
Utför analysen använder plugin för alla micro-bestrålade celler (minst 15 – 30 celler) och diagram genomsnittliga relativa anrikningen på mikro-bestrålade regioner över tid. Beräkna medelvärdet för varje data standard fel peka och rita dem.
- Bekräfta skillnader i rekrytering kinetik mellan två experimentella förhållanden genom att utföra Student's t-test för varje datapunkt.
5. om protokoll
-
Förbered om lösningar. Förbereda pre/post-extraction lösning (iskall 1 x PBS som innehåller 0,25% Triton x-100), tvättlösningen (1 x PBS som innehåller 0,05% Tween-20), blockerar lösning (1 x PBS som innehåller 3% BSA och 0,05% Tween-20), och fixering lösning (PARAFORMALDEHYD 3% + sackaros 2% i PBS 1 x) i koniska polypropylene rören.
Anmärkning: För en enda 8-well-microslide, 10 mL pre/post-extraction lösning, 50 mL tvätt lösning, 10 mL blockerande lösning och 5 mL fixering lösning behövs.- Bered den fixering.
- Under en kemisk huva, blanda 400 mL dubbeldestillerat vatten (ddH2O) med 15 g PARAFORMALDEHYD och 30 µL 10 N NaOH i en 1 L Erlenmeyerkolv.
- Stäng behållare och värme vid 65 ° C på en magnetomrörare värmeplatta under omrörning för att solubilize PARAFORMALDEHYD helt.
- Med 25 mL pipett, tillsätt 50 mL 10 X PBS, rör och filter använder ett 0,45 µm filter.
- Tillsätt 10 g sackaros och komplett med ddH2O. till 500 mL
- Alikvot lösningen i 15 mL koniska rör; förvaras vid-20 ° C fram till användning.
- Förbereda atomkärnor färgning lösning genom att späda ut en stamlösning av 1 mg/mL 4,6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) 1:1,000 i 1 x PBS.
- Bered den fixering.
- Med hjälp av en mikropipett, ta försiktigt bort mediet från brunnarna av flera mikroskopi diabilder eller tallrikar och omedelbart tvätta med 500 µL av om tvättlösningen genom att ändra lösningen två gånger utan att vänta.
Obs: Om data presenteras här erhölls använder celler odlade i 8-väl mikroskopi bilder som var tvättas och inkuberas i 500 µL av alla lösningar. Volymer ska justeras beroende på de cell kultur behållare som används av praktiker. Dessutom utför om protokollet med extrem omsorg som cellerna kan enkelt loss från glas/polymer botten. Använd en mikropipett för alla ändringar som lösning för att minimera cellförlust. - Inkubera på is för 5 min med 500 µL av iskall om pre/post-extraction lösning och snurra försiktigt för hand för 15 – 30 s att utföra före extraktion steg som tar bort mest cytoplasmiska och nucleoplasmic proteiner och maximerar signalen från kromatin / DNA-associerade faktorer.
- Tvätta två gånger med 500 µL av om tvättlösningen.
- Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur i 500 µL om fixering lösning. Alternativt använda en färdiga PARAFORMALDEHYD lösning (3 – 4%) för fixering steg.
- Tvätta två gånger med 500 µL av om tvättlösningen.
- Inkubera på is för 5 min i 500 µL av iskall om pre/post-extraction lösning och snurra bilden försiktigt för hand att utföra steget permeabilisering.
- Tvätta två gånger med 500 µL av om tvättlösningen.
- Inkubera i minst 30 min i rumstemperatur med 500 µL om blockerande lösning.
- Ta bort blockering lösning med hjälp av en mikropipett och inkubera över natten i en fuktig kammare vid 4 ° C med 250 µL primära antikroppar utspätt i blockering lösning.
Obs: Det är god praxis att utföra inkubering med primära antikroppar sekventiellt för att undvika potentiella artefakter av samtidig lokalisering. När lämpliga kontroller har utförts, samtidigt Inkubera primära antikroppar för att påskynda processen. - Tvätta fyra gånger för 5 min i 500 µL av om tvättlösningen med mild agitation (60 varv på en rotator).
- Inkubera i 1 timme vid 37 ° C med 250 µL av sekundära antikroppar utspätt i blockerande lösning i en fuktig kammare.
Obs: Ljuskänsligt proverna vid tillägg av fluorescently-märkta sekundära antikroppar. - Tvätta fyra gånger varje för 5 min i 500 µL om tvättlösningen med försiktig skakning.
- Odla i rumstemperatur i 5 min i 500 µL 1 x PBS med 1 µg/mL DAPI att färga atomkärnor.
- Tvätta två gånger med 500 µL 1 x PBS och lämna celler i 500 µL av 1 x PBS lösning för avbildning.
- Med inrutade diabilder eller registrerade scenen positioner, hitta mikro-bestrålade celler med en välkarakteriserad DNA skador markör (t.ex., γ-H2A.X, RPA32, etc.).
- Bild den flera kultur diabilder eller plattor i alla relevanta kanaler med lämpliga inställningar på laserskanning confocal Mikroskop.
Obs: På presenterade systemet, gjordes av imaging med en 63 X / 1.4 objektiv med en 8 µs/pixel dröjtiden, 1 024 x 1 024 upplösning, 1 X zoom, och i genomsnitt 2. Observera att dessa parametrar kan behöva optimeras för andra system eller olika experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter mikro-bestrålning får cellerna att återhämta sig under en viss tid beroende på genomet underhåll proteiner1,12. DSBs kommer att behandlas av nukleaser, mest omfattande under de S och G2 faserna av cellcykeln, att skapa en begränsad region i ssDNA som snabbt täckas av RPA och andra genomet underhåll faktorer9. Denna ssDNA region omges av kromatin i stor utsträckning ändras under DDR att reglera rekrytering och utbyte av andra DDR faktorer13. Protein rekrytering till mikro-bestrålade områden kan övervakas av IF (figur 1A). Typiskt, kromatin-associerade faktorer (t.ex., γ-H2A.X, 53BP1, etc.) är detekterbara tidigare (1 – 5 min) tidpunkter än ssDNA-bundna proteiner eftersom nuclease-medierad resektion av DSB slutar krävs att generera RPA-ssDNA plattformen (≥10 min). För att underlätta bildanalys och offentliggörande, har vi utarbetat en Fiji script (The Outliner)10 som automatiskt skisserar cellkärnan via en DNA dye-associerad kanal (t.ex., DAPI), vilket gör det lättare att skilja mikro-bestrålning ränder och enskilda celler genom att utelämna intetsägande DNA färgning från de slutliga bilderna samtidigt bevara nukleära definition (figur 1B).
Γ-H2A.X och RPA komplexa subenheter fungera som markörer för kromatin - och ssDNA-associerade faktorer, respektive. RPA-ssDNA visas som punktuell foci omgiven av stora fluorescerande kromatin ränder dekorerat av γ-H2A.X antikroppen (figur 1 c). Samtidig lokalisering med dessa markörer kan användas för att exakt definiera positionen för genomet underhåll faktorer på DNA lesioner. Till exempel, lokaliserar 53BP1, ett kromatin-associerade protein som styr DSB reparation väg valet, Co väl med γ-H2A.X signal13. Omvänt, PRP19, en E3 ubiquitin ligase att funktioner på RPA-ssDNA att främja ATR aktivering och DNA reparation har rekryterats som punktuell foci som nära matchar RPA32 distribution14,15,16,17 (Figur 1 d). Notera, vissa faktorer kan också anställas på kromatinet i anslutning till de ursprungliga lesionerna men sprids inte till stora domäner kring DSBs som γ-H2A.X och 53BP1. I sådana fall dessa faktorer skulle visas som punktuell foci men skulle inte perfekt Co lokalisera med ssDNA-bundna proteiner.
För levande cell imaging, celler som uttrycker en POI med en fluorescerande markör etiketten kan vara detaljerade mikro-bestrålade och avbildas i realtid för att få mycket rekrytering kinetik (figur 2A–C). Flera olika proteiner kan observeras samtidigt under förutsättning att deras fluorescerande etiketter spektralt kan skiljas från varandra. För att underlätta analys av tidsserier, har vi skapat två Fiji skript som tillåter användaren att producera filmfiler som innehåller tidsserier information (Movie Maker, se filmer av figur 2 c som Online kompletterande Material) och kvantifiera protein Rekrytering på mikro-bestrålade platser (skada Analyzer)10. I stället för den tidskrävande manuella bild curation normalt krävs att beskriva beteendet hos ett protein, vägleder skada Analyzer skriptet användaren genom strömlinjeformad steg som övervaka signalen berikning på mikro-bestrålade platser, medan automatiskt korrigera för cell rörelse, bild drift, bakgrund signal och blekning vid alla tidpunkter av experimentet. Den genererade data kan sedan enkelt sammanställs i ett kalkylbladsprogram och ritade som behövs (figur 2D).
Figur 1: Lokalisering av genomet underhåll faktorer till kromatin och RPA-ssDNA plattformar på mikro-bestrålning-inducerad lesioner. (A) Laser mikro-bestrålning i förväg sensibiliserade celler leder till produktion av DNA dubbelsträngat raster, som är resected av endo - och exo-nukleaser att generera ssDNA. SsDNA sub facket kan visualiseras som punktuell foci med antikroppar mot replikering Protein A eller andra ssDNA-lokaliserad faktorer. Däremot visas proteiner eller ändringar som spridit sig till stora kromatin domäner som stora ränder på webbplatsen mikro-bestrålade liknar mönstret observerats med antikroppar riktade fosforyleras Histon varianten H2A. X (Γ-H2A.X). (B) celler redan sensibiliserats med BBET eller BrdU var mikro-bestrålade, pre extraherade, fasta och färgade för de angivna proteinerna. 12-bitars bilder samlades på 1 X zoom och bearbetas med hjälp av skriptet Outliner Fiji. (C) Z-stapling av BBET eller BrdU pre sensibiliserade celler tillåter resolutionen ssDNA - och kromatin-associerade faktorer (maximal intensitet Z-projektion visas). (D) använda denna metod, 53BP1 och PRP19 kan klassificeras som kromatin - och ssDNA-associerade genomet underhåll faktorer, respektive. Skala barer = 10 µm; bilder i D är alla på samma skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Live-imaging RPA komplexa rekryteringen till platser av DNA skada. (A) stabil eller övergående transfection av plasmider kodning kandidat proteiner märkta med fluorescerande reportrar följt av mikro-bestrålning av transfekterade celler tillåter övervakning av protein rekrytering till DNA lesioner i realtid. (B) celler var transfekterade med en pDEST47-RPA32-GFP-plasmid och lyserat 24 h senare. Proteinuttryck bekräftades av immunoblotting. (C) celler transfekterade med pDEST-SFB andra eller pDEST47 RPA32-GFP plasmider pre sensibiliserats med BrdU var mikro-bestrålade och avbildas på 12-bitars på 1 X zoom en gång per minut efter strålning. Tidpunkten är i minuter efter strålning. 00:00 tid punkt bilden togs före mikro-bestrålning. Filmfiler skapades med hjälp av Movie Maker Fiji skriptet och referensbilder visas. Skala barer = 10 µm. (D) rekrytering av RPA32-GFP till mikro-bestrålning ränder övervakades kvantitativt med hjälp av skriptet skada Analyzer Fiji. Utdata var ritade med hjälp av Microsoft Excel. Den svarta linjen är genomsnittlig anrikning-luckan av RPA32-GFP på mikro-bestrålade platser i förhållande till signalen före bestrålning och felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet av 15 självständigt mikro-bestrålade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: Micro-bestrålning time-lapse av SFB-GFP uttrycker celler. Celler som övergående transfekterade med en pDEST-SFB GFP plasmid var pre sensibiliserade 24 h med BrdU, mikro-bestrålade och avbildas en gång per minut för 29 min. vänligen klicka här för att ladda ner denna film.
Movie 2: Micro-bestrålning time-lapse av RPA32-GFP uttrycker celler. Celler som övergående transfekterade med en pDEST47 RPA32-GFP plasmid var pre sensibiliserade 24 h med BrdU, mikro-bestrålade och avbildas en gång per minut för 29 min. vänligen klicka här för att ladda ner denna film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med metoderna som beskrivs ovan, tillåter 405 nm laser mikro-bestrålning av celler som redan sensibiliserats med BBET eller BrdU lokaliserade generering av DNA lesioner inklusive DSBs inom atomkärnor av vidhäftande mänskliga celler. Kinetiken av DDR på dessa DSBs liknar dem som skapas med andra metoder i eukaryota celler9,18,19. DSB resektion vid mikro-bestrålade platser leder till ssDNA-generation som kan följas med hjälp av en RPA32-inriktning antikropp eller en RPA32-GFP-fusion. Kromatin-associerade faktorer, däremot, kan placeras med γ-H2A.X som referens. Några kromatin-associerade faktorer inte kan spridas från den inledande DSB så mycket som γ-H2A.X och visas som punktuell foci som kan vara skild från ssDNA-bindande proteiner foci.
När DSBs genereras, kan protein rekrytering och clearance från skada platser övervakas av om på fasta celler. Utför dessa experiment kräver endast en lämplig om antikropp mot POI. Om IF-kompatibel antikroppar är otillgänglig, plasmider kan vara konstruerad bär gener sevärdheter i ram med specifika epitoper (t.ex.: flagga, hans-tag) eller fluorescerande proteiner. Övergående eller stabil transfection/transduktion av dessa plasmider i vidhäftande celler kan sedan användas för att avgöra huruvida en viss faktor aktivt rekryteras till skadat DNA. Överuttryck av proteiner kan leda till felaktig lokalisering och artificiellt kan öka sin rekrytering till mikro-bestrålade ränder. För att få resultat som är mer representativ för endogena proteiner, kan CRISPR-Cas9-teknik nu användas rutinmässigt att tagga någon gen av intresse med lämplig epitoper20,21.
De Python skript i mikro-bestrålning analys Fiji Plugin underlätta visualisering, presentation, publicering och analys av DDR proteiner kinetik. Denna analyspaket är öppen källkod och funktioner oavsett den Mikroskop plattform används för att utföra mikro-bestrålning experiment och bild förvärv. Allt som krävs är att bilder tagna på mikroskopi plattformen sparas som Bio-format kompatibla filer22. Sedan bakgrunden, drivande och blekning korrigeringar utförs automatiskt, analys av proteinnivåer på DNA skada platser med PowerShellskript är enkel och mycket snabb jämfört med typiska manuell signal kvantifiering utförs med mikroskopet förvärv bildbehandlingsprogram.
Som beskrivs i protokollet, användare noggrant måste konfigurera deras respektive-laserskanning confocal Mikroskop system för att uppnå lämplig mängd skador och inducera DSBs som följer normala DDR kinetik. Faktiskt, beror mängden och typen av DNA lesioner genereras av mikro-bestrålning på laser våglängd och dos samt på metoderna före sensibilisering. Användare behöver ha i åtanke att även om DSBs genereras av de villkor som beskrivs här, 405 nm laser mikro-bestrålning av photosensitized celler också kommer att generera en blandning av andra DNA-skador, inklusive cyclopyrimidine dimerer (CPDs), SSBs, och oxiderade baser, som kommer att variera mellan Mikroskop system och inställningar23,24,25. Således behöver en noggrann övervakning av lesioner på mikro-bestrålade platser utföras för att få en heltäckande bild av skadan genererade och den respons som framkallas. Ännu viktigare, för att studera svaret på DSBs, bör varje Mikroskop system optimeras genom att övervaka kineticsen av kanoniska DNA skador proteiner och post-translationella modifieringar på mikro-bestrålade platser. Till exempel, γ-H2A.X och RPA komplexa subunitsna (RPA70, RPA32 eller RPA14) kan användas bekvämt eftersom de är ganska lätta att upptäcka och snabbt ackumuleras på DSBs. Som en tumregel, γ-H2A.X signal bör visualiseras som ränder på tidig (5 min) och sent (upp till 3 – 4 h) tid pekar efter skador medan RPA ska börja ackumulera som punktuell foci cirka 10-15 min efter-micro-bestrålning. Om en pan-nukleära γ-H2A.X signal observeras, mängden energi som tas emot av cellerna är icke-fysiologisk och kommer att resultera i snabb celldöd.
Det finns vissa begränsningar som måste beaktas när du använder en 405 nm laser för att studera specifika DNA reparation vägar. Till exempel, även om BBET-405 nm kombinationen ger lätt en kombination av SSBs och DSBs, det genererar inte 6 – 4 ljusprodukter (6 – 4 PPs) och följaktligen kinetiken för rekrytering av nucleotide excision repair proteiner är annorlunda än de observerats med hjälp av UV-C micro-bestrålning. De kinetics och omfattningen av rekrytering av olika proteiner involverade i att bemöta DSBs kan också variera beroende DNA skada metoden som för tillfället används23. På grund av dessa variationer rekommenderar vi att användare anpassa sina system för att maximera typ av lesioner som potentiellt identifieras av deras intressepunkter. Även om sådana system är mindre lättillgängliga, använder andra typer av lasrar inklusive UV-A (337 – 355 nm) eller femtosekund nära infrarött (800 nm) tillsammans med olika sensibilisering reagens (t.ex.: tri-metyl psoralen) kan tillåta användare att generera mer specifika DNA skador beroende på DNA reparerar vägar enligt studien24,26.
När nya villkor testas, är det bekvämt att använda fluorescently-märkt väletablerade DNA reparation proteiner att testa doser, våglängder och före sensitizer kombinationer, och se till att lesionen sevärdheter genereras effektivt. Till exempel PARP1 och XRCC1 kan fungera som markörer för SSB och base-excision reparation, XPA är en bra indikator på nucleotide excision repair och 53BP1 kommer att rekryteras till DSBs och funktion i icke-homolog slutet-anslutning (referenser23,25 ,27,28). Antikroppar som känner igen modifieringar som är associerade med specifika typer av DNA-skador kan också användas för att kvantifiera nivåerna av DNA addukter eller bryter. Det är således möjligt att övervaka oxiderat baser, cyclopyrimidine dimerer, 6 – 4 PPs, SSBs (med poly-ADP ribos antikropp) och DSBs (γ-H2A.X och 53BP1) om och bestämma parametrarna som uppnår den högsta nivån av önskad lesioner23, 27 , 29. med noggrann övervakning, bör användarna kunna studera deras reparation väg av intresse med hjälp av mikro-bestrålning.
Alldeles, användning av wide-spread laserskanning confocal Mikroskop utrustat med 405 nm laserlinjer att generera lokaliserade DSBs, kombinerat med plattformsspecifik DNA skador markörer att sub klassificera genomet underhåll faktorer och strömlinjeformad data bearbetning med hjälp av mikro-bestrålning analys Fiji plugin, bör göra studiet av DDR faktorer dynamics mer tillgängliga än någonsin tidigare för både erfarna och nybörjare utredare av fältet genomet underhåll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada [Discovery grant 5026 till Arwidson] och av en Nästa Generation av forskare stipendium från Cancer Research Society [21531 till Arwidson]. Vi tacka Jean-François Lucier för att ge utmärkt kvalitetskontroll av Fiji Python skript och råd på statistisk analys. Vi tackar Dr. Stephanie A. Yazinski för om fixering lösning receptet. Vi tackar Paul-Ludovic Karsenti för hjälp med laser power mätningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
