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Genetics

Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57410
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Université de Sherbrooke
* These authors contributed equally

Summary

Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.

Abstract

La réponse de dommages ADN (DDR) utilise une pléthore de protéines pour détecter, signaler et réparer les lésions de l’ADN. Délimiter cette réponse est essentiel de comprendre les mécanismes de maintien du génome. Recrutement et échanges de protéines à des lésions étant très dynamiques, leur étude nécessite la capacité de générer des dommages à l’ADN de façon rapide et dans l’espace délimité. Nous décrivons ici les procédures pour induire localement des lésions de l’ADN dans les cellules humaines à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser couramment disponible équipé d’un faisceau de 405 nm. Accumulation de maintenance du génome à rayures de laser peut être évaluées par immunofluorescence (IF) ou en temps réel à l’aide de protéines fluorescents reporters le tag. À l’aide de phosphorylés histone H2A. X (γ-H2A.X) et Replication Protein A (RPA) comme marqueurs, la méthode fournit une résolution suffisante pour distinguer les facteurs recrutés localement de celles qui se propagent sur la chromatine adjacente. Nous fournir également des scripts basés sur ImageJ pour surveiller efficacement la cinétique de la relocalisation de la protéine à ADN endommagent des sites. Ces améliorations simplifient grandement l’étude de la dynamique de la DDR.

Introduction

Les cellules sont constamment exposés à des sources de dommages à l’ADN endogènes et exogènes qui menacent leur intégrité génomique. Le DDR est un ensemble de voies que détecter et réparer les lésions de l’ADN pour maintenir la stabilité du génome de signaux de signalisation. Cassures double-brin d’ADN (CDB), le DDR se produit principalement sur les deux plateformes complémentaires : γ-H2A.X-étiqueté de la chromatine et une région d’ADN (ADN simple brin) simple brin réséquée généralement recouvertes d’ADNsb-liaison complexe Apr1,2.

UV-laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec la thymidine analogique 5-bromo-2' désoxyuridine (BrdU) ou la teinture d’ADN bisbenzimide éthylate TRIHYDROCHLORURE (BBET, Hoechst 33342) crée un mélange de lésions de l’ADN y compris cassures simple brin ( BSN) et CDB qui suscitent un DDR localisé sur la chromatine et ADN simple brin plates-formes3,4. Des travaux antérieurs ont montré que recrutement des facteurs d’entretien de génome de ces deux plateformes distinctes à ORD peut être distinguée en utilisant des lasers de haute énergie UV-A (335-365 nm) combinés avec IF2,5. Microscopes équipés de ces lasers sont coûteuses car elles nécessitent un laser à haute énergie et dédiés objectifs transmission UV-A, ce qui les rend beaucoup moins répandue dans les milieux universitaires et pharmaceutiques que les microscopes confocaux à balayage laser avec laser à 405 nm lignes. L’étude du recrutement de protéines et d’échange sur les sites de micro-irradiés s’oppose également à l’analyse d’image manuel laborieux pour décrire le comportement dynamique des facteurs d’entretien de génome.

Ici, nous montrons que la sensibilisation préalable des cellules avec des taches d’acide nucléique BrdU ou BBET suivie par micro-irradiation utilisant un laser à 405 nm sur un microscope confocal commun permet de contrôler la dynamique de facteur de maintenance du génome aux lésions de l’ADN. À l’aide de γ-H2A.X ou sous-unités complexes de l’armée patriotique rwandaise comme marqueurs de la plate-forme avec empilement z pour une plus grande profondeur de champ et déconvolution pour une résolution améliorée permet l’expérimentateur de discriminer les facteurs qui sont recrutés localement à la CDB de celles qui se propagent à domaines de chromatine grand entourant la lésion initiale. Cette sous-classification selon différents compartiments intra nucléaires contribue à affiner les rôles possibles des protéines non caractérisés recrutés aux sites de micro-irradié. En outre, nous fournissons des protocoles pratiques et optimisée des pipelines pour rapidement analyser la dynamique des facteurs d’entretien de génome en utilisant le logiciel open-source Fidji (une distribution de ImageJ)6,7,8. Ces raffinements aux méthodes actuelles de micro-irradiation de l’étude du processus de DDR rendent possible dans pratiquement n’importe quel arrangement de laboratoire.

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Protocol

1. sensibilisation préalable des cellules

  1. 24 h avant l’expérience de micro-irradiation, graines 40 000 U2OS cellules / puits dans 1 x DMEM contenant 10 % FBS dans 8 puits culture glisse avec fond de 170 µm d’épaisseur type lamelle verre/polymère afin d’assurer la transmission maximale de 405 nm lumière laser et l’imagerie excellent avec un laser à balayage confocal microscope inversé. Si vous utilisez un micro-lames 8 puits, utilisez 500 µL des solutions ou des médias / puits pour tous les traitements ultérieurs et les étapes de lavage du protocole.
    Remarque : En raison de leur morphologie plate, bonne adhérence et gros noyaux, U2OS cellules facilitent la détection du recrutement de protéines dans les sites de micro-irradié mais d’autres types de cellules adhérentes peuvent être utilisés selon les besoins. Cellules devraient idéalement être d’environ 80 % irradiés de confluence au moment de l’irradiation micro pour augmenter le nombre de cellules par expérience. Confluence très élevé peut entraîner des altérations de cycle cellulaire qui peuvent perturber les voies de réparation spécifiques tels que la recombinaison homologue qui a lieu pendant les phases S et G2 du cycle cellulaire9.
  2. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO2et puis les sensibiliser les cellules avec (étape 1.3) BrdU ou (étape 1.4) BBET (Hoechst 33342).
    Remarque : Pour observer le recrutement direct d’une protéine d’intérêt (POI) pour les lésions de l’ADN, transfecter ou transduce ADN plasmidique transportant une fusion entre une protéine fluorescente et un POI 24h après l’ensemencement de la cellule. 24h après-transfection/transduction, les sensibiliser et micro-irradier les cellules pour surveiller le recrutement de l’IPE à sites de dommages d’ADN en temps réel.
  3. Pour augmenter le nombre des CDB générés par exposition au laser 405 nm, ajouter 10 µM de BrdU aux médias pendant 24 h avant micro-irradiation. Avant irradiation micro, à l’aide d’une micropipette, rincer les cellules deux fois avec support sans rouge de phénol pour assurer une exposition maximale des cellules au laser 405 nm.
  4. Vous pouvez également traiter les cellules pendant 15 minutes avec BBET à 10 µg/mL dans le milieu approprié dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C. Après le traitement, rincez deux fois avec support sans rouge de phénol avant micro-irradiation.

2. micro-irradiation des cellules

  1. Sélectionnez un approprié microscope confocal à balayage laser.
    Remarque : Les expériences présentées ici ont été réalisés sur un système de microscope équipé de 50 mW 405 nm laser ligne et un objectif à huile 63 X 1.4 ouverture numérique. Pour générer le CDB, cellules ont été irradiés micro à 1 X zoom scan à 1 024 x 1 024 pixels/field (0,21 µm/pixel à un grossissement de X 63) et en mode unidirectionnel à 8 µs/pixel. La puissance du laser utilisée était de 25 % et 80 % pour les cellules BBET et BrdU-pre-sensibilisée, respectivement. Pour aider les utilisateurs à configurer leur système, post-l’objectif laser sur le système présenté a été mesurée à l’aide d’un wattmètre conformément aux instructions du fabricant. Les mesures correspondent à 2,6 mW et 7,0 mW pour BBET et BrdU-pre-sensibilisés à cellules, respectivement.
  2. Allumez le microscope et la chambre environnementale.
    1. La valeur de la chambre à 37 ° C, avec 5 % de CO2 avant que les échantillons sont placés dans l’incubateur sur scène pour éviter un stress inutile aux cellules tout en assurant la cinétique homogène de DDR à travers des expériences.
  3. Sélectionnez les champs avec des cellules bien réparties, ajuster la mise au point et inscrire leur position pour faciliter l’acquisition d’images après le protocole de l’IF. Acquérir au moins une image qui servira de point de référence dommages avant de suivre la cinétique du recrutement de protéines après une irradiation micro.
    Remarque : Récipients de culture maillées peuvent également servir pour faciliter la localisation des cellules irradiées micro à des étapes ultérieures.
    1. Pour les expériences d’IF à l’aide de cellules marquées BBET, ajuster le focus sur les cellules à l’aide de 405 nm laser à la plus faible puissance laser permettant de visualiser les cellules afin d’éviter des dommages à l’ADN injustifié.
      1. Évitez d’utiliser widefield fluorescence pour ajuster le focus sur cellules BBET comme la lumière ultraviolette émise par la lampe va entraîner des lésions de l’ADN à des sites illuminés.
    2. Si vous utilisez les cellules marquées BrdU, ajuster le focus à l’aide de contraste interférentiel différentiel (DIC) ou l’imagerie de contraste de phase en regardant nucléaire des fonctionnalités telles que les nucléoles.
    3. Si à l’aide de cellules exprimant fluorescent marqué POI, sélectionnez un plan focal avec une intensité de fluorescence représentatif.
      Remarque : Évitez les cellules qui expriment des niveaux très élevés de l’IPE car localisation artéfactuelle peut entraîner une forte surexpression. En outre, sélectionnez les cellules qui expriment le POI à des niveaux comparables (sélection des clones stables est fortement recommandée afin de minimiser les variations des niveaux de recrutement et d’expression POI).
  4. Configurer le microscope pour l’étape de micro-irradiation à l’aide de la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) _module du système.
    Remarque : Les paramètres les plus importants à considérer lors de mise en place du système de microscope pour des expériences de micro-irradiation sont : la puissance du laser 405 nm, nombre d’itérations (c.-à-d., nombre de fois le laser risque de dépasser les mêmes coordonnées), nombre de pixels/domaine (63 X grossissement et résolution de 1 024 x 1 024, 1 pixel = 0,21 µm) et les temps de pause par pixel. Tous ces facteurs auront une incidence la quantité d’énergie que les cellules expérience et ainsi la quantité et le type d’ADN endommagent généré (voir la Discussion pour plus amples renseignements sur les doses optimisation).
  5. Grâce au module FRAP du système microscope, micro-irradier les cellules.
    Remarque : Sur la plupart des systèmes, micro-irradiation des cellules multiples peut être effectuée dans un seul champ en taches ou lignes/rectangles (généralement 1 à 2 µm de large). Lors de l’exécution en direct-imagerie de protéines marquées fluorescent immédiatement après dommages, limiter l’irradiation micro à un petit nombre de cellules par champ parce que le temps pris pour micro-irradient chaque cellule se traduira par une induction retardée de la DDR. Ceci est particulièrement important pour l’analyse des protéines qui sont recrutés très rapidement à des lésions de l’ADN.
  6. Après micro-irradiation, remettre les puits multiples lames ou plaques dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant la durée nécessaire avant de traiter des échantillons pour si (Section 5) ou procéder immédiatement à vivre-imagerie (Section 3).
    1. Dans un premier temps, fixer les cellules en quelques minutes et jusqu'à quelques heures après irradiation pour le protocole de l’IF. Selon le POI, cinétique de recrutement peut varier. En règle générale, les protéines qui sont associées à la chromatine à la CDB et BSN localiserez très rapidement à la lésion et disparaissent parfois moins de 5 min. Certains facteurs tels que ceux qui assemblent à ADN simple brin seront recrutés à des moments plus tard une fois que l’appareil de la résection a été engagé et d’y restent pendant des heures (voir Figure 1 et référence4).

3. vivre-imagerie de protéines marquées fluorescent

  1. Effectuer le Time-lapse imagerie des cellules irradiées micro. Pour des protéines qui sont recrutés très rapidement aux lésions, quelques secondes par image seront idéal, mais pour les protéines qui localiser à la zone endommagée par la suite (p. ex., facteurs de résection), acquisition peuvent être effectuée toutes les 1 à 2 min jusqu'à l’obtention d’un plateau.
    Remarque : Réduire la puissance du laser pour l’acquisition d’images pour éviter le blanchiment autant que possible tout en assurant que le recrutement de protéines dans les sites de dommages n’atteint pas saturation qui empêcherait la quantification du signal et des analyses subséquentes (Voir l’analyse des données Section 4). Sur le système présenté, l’imagerie a été fait avec un 63 X / 1.4 huile objective à l’aide d’un temps de pause de 8 µs/pixel, résolution de 1 024 x 1 024, zoom de X 1 et une moyenne de 2. Notez que ces paramètres peuvent devoir être optimisé pour les autres systèmes et/ou des expériences différentes.
  2. Micro-irradier les cellules dans des champs supplémentaires jusqu'à la cinétique sont obtenus pour des cellules de 15-30. Répéter les expériences au moins 3 fois dans les réplicats biologiques afin d’assurer l’exactitude et la reproductibilité de la cinétique de recrutement.
    Remarque : Lors de l’adaptation de ce protocole se rapportant à un système confocal spécifique, il peut être utile de commencer par la surveillance de la cinétique de recrutement d’un facteur de maintenance génomiques connues fluorescent marqué (par exemple, 53BP1-GFP, RPA32-GFP, etc.). À l’aide d’images en direct afin d’optimiser les conditions d’irradiation-micro permettra à l’utilisateur de tester rapidement les paramètres multiples.

4. recrutement cinétique analyse

  1. Installer le plugin de Microirradiation analyse10 dans les Fidji image analyse logiciel11.
  2. Ouvrez les images acquises dans les îles Fidji. Sélectionnez «L’analyseur de dégâts» dans le menu déroulant plugins dans la suite de l’analyse Microirradiation. Suivez les invites pour définir une région de fond d’intérêt (ROI) (généralement 3 x 3 µm) et les ROIs irradiés et non irradiés dans chaque cellule micro-irradié.
    1. ROIs d’utilisation de la même taille pour minimiser les biais potentiels en moyenne intensités du signal. Pour les images acquises, inclure au moins une frame avant irradiation qui sera utilisée comme point de référence pour surveiller le recrutement sur les sites de micro-irradié.
    2. Une fois que toutes les données ROI ont été collectées au cours de la série complète de Time-lapse, enregistrez le fichier créé par le plugin contenant les résultats dans un fichier csv (fichier délimité par des virgules) ou txt (fichier délimité par des tabulations). Ce fichier contient des mesures de l’intensité moyenne pour chaque instant et chaque ROI (moyenne intensité fond, moyenne intensité Non irradiées et moyenne intensité irradié).
      Remarque : Le plugin soustrait automatiquement l’intensité de l’arrière-plan (jeb) de l’intensité de la ROIs irradiée (jes) et la ROIs non irradiées (j’ain). Il calcule également un rapport entre les deux valeurs (voir la formule ci-dessous) pour corriger la photoblanchiment (irradié/Non-irradiés).
      Equation 1
      Le plugin calcule également une normalisation entre le premier point du temps (valeur 1) et tous les autres points dans le temps pour chaque noyau (ratio par rapport au premier point de temps). On trouvera des renseignements supplémentaires sur le site Web de plugin10.
  3. Effectuer l’analyse en utilisant le plugin pour toutes les cellules irradiées micro (au moins 15 à 30 cellules) et graphique de l’enrichissement relatif moyen dans les régions irradiées micro au fil du temps. Calculer les erreurs-types de la moyenne pour chacune des données point et tracer.
    1. Confirmer les différences de cinétique de recrutement entre deux conditions expérimentales en effectuant de Student t-tests pour chaque point de données.

5. si protocole

  1. Préparer des solutions de IF. Préparer la solution de pré/post-extraction (glacée 1 x PBS contenant 0,25 % Triton X-100), solution de lavage (1 x PBS contenant 0,05 % Tween-20), bloquant la solution (1 x PBS contenant 3 % de BSA et 0,05 % Tween-20) et la solution de fixation (paraformaldéhyde 3 % + 2 % de saccharose dans du PBS 1 x) dans des tubes coniques en polypropylène.
    Remarque : Pour un seul micro-lames 8 puits, 10 mL de solution de pré/post-extraction, 50 mL de solution de 10 mL de solution de saturation et 5 mL de solution de fixation de lavage sont nécessaires.
    1. Préparer la solution de fixation.
      1. Sous une hotte chimique, mélanger 400 mL d’eau bidistillée (ddH2O) avec 15 g de paraformaldéhyde et 30 µL de 10 N NaOH dans une fiole d’Erlenmeyer de 1 litre.
      2. Fermer le récipient et la chaleur à 65 ° C sur une plaque chauffante d’agitateur magnétique tout en remuant pour solubiliser la paraformaldéhyde complètement.
      3. À l’aide d’une pipette 25 mL, ajouter 50 mL de 10 X PBS, remuer et filtre à l’aide d’un filtre de 0,45 µm.
      4. Ajouter 10 g de saccharose et compléter à 500 mL avec FD2O.
      5. Partie aliquote de la solution dans les tubes coniques 15 mL ; conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
    2. Préparer les solution de coloration en diluant une solution mère de 1 mg/mL de 4, 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) 1 : 1 000 dans du PBS 1 x des noyaux.
  2. À l’aide d’une micropipette, retirez soigneusement les médias par les puits des lames de microscope multipuits ou plaques et se laver immédiatement avec 500 µL de solution de lavage IF en changeant la solution deux fois sans attendre.
    NOTE : Les données de cas présentées ici ont été obtenues à l’aide de cellules cultivées dans des lames de 8 puits microscopie qui ont été lavés et incubés dans 500 µL de toutes les solutions. Des volumes doivent être ajustées selon les contenants de culture cellulaire utilisés par les expérimentateurs. En outre, effectuer le protocole IF avec un soin extrême que les cellules peuvent facilement se détacher du fond verre/polymère. Utiliser une micropipette pour toutes les modifications de la solution pour minimiser la perte de cellules.
  3. Incuber sur glace pendant 5 min avec 500 µL de glacé si solution de pré/post-extraction et agiter doucement à la main pendant 15 à 30 s effectuer l’extraction avant l’étape qui supprime la plupart des protéines cytoplasmiques et nucléoplasmiques et maximise le signal de la chromatine / Facteurs associés à l’ADN.
  4. Laver deux fois avec 500 µL de solution de lavage IF.
  5. Incuber pendant 15 min à température ambiante dans 500 µL de solution de fixation IF. Alternativement, utiliser une solution de paraformaldéhyde pré-faites (3-4 %) pour l’étape de fixation.
  6. Laver deux fois avec 500 µL de solution de lavage IF.
  7. Incuber sur glace pendant 5 min à 500 µL de solution à pré/post-extraction de glacee IF et agiter la diapositive doucement à la main pour effectuer l’étape perméabilisation.
  8. Laver deux fois avec 500 µL de solution de lavage IF.
  9. Incuber au moins 30 min à température ambiante avec 500 µL de solution de saturation IF.
  10. Enlever la solution de saturation à l’aide d’une micropipette et incuber pendant la nuit dans une chambre humidifiée à 4 ° C avec des anticorps primaires de 250 µL dilués en bloquant la solution.
    Remarque : Il est conseillé d’effectuer l’incubation avec l’anticorps primaires dans l’ordre pour éviter d’éventuels artefacts de co-localisation. Une fois que les contrôles appropriés ont été effectués, en même temps incuber des anticorps primaires pour accélérer le processus.
  11. Laver quatre fois pendant 5 min dans 500 µL de solution de lavage IF avec agitation modérée (60 RPM sur un agitateur).
  12. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C, avec 250 µL d’anticorps secondaires dilué dans une solution de blocage dans une chambre humidifiée.
    NOTE : Protéger les échantillons de lumière lors de l’addition d’anticorps secondaires marqué fluorescent.
  13. Laver quatre fois chacun pendant 5 min à 500 µL de solution de lavage IF avec agitation douce.
  14. Incuber à température ambiante pendant 5 min à 500 µL de 1 x PBS contenant 1 µg/mL DAPI pour colorer les noyaux.
  15. Laver deux fois avec 500 µL de PBS 1 x et laisser les cellules de 500 µL de solution de PBS pour l’imagerie 1 x.
  16. À l’aide de diapositives maillées ou positions de la scène enregistrée, trouver les cellules irradiées micro à l’aide d’un marqueur des dommages bien caractérisé (p. ex., γ-H2A.X, RPA32, etc.).
  17. Image de la culture multipuits diapositives ou des plaques sur les canaux pertinents en utilisant les paramètres appropriés sur un microscope confocal à balayage laser.
    Remarque : Sur le système présenté, l’imagerie a été fait avec un 63 X / 1.4 huile objective à l’aide d’un temps de pause de 8 µs/pixel, résolution de 1 024 x 1 024, zoom de X 1 et une moyenne de 2. Notez que ces paramètres peuvent devoir être optimisé pour les autres systèmes et/ou des expériences différentes.

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Representative Results

Après irradiation micro, les cellules sont autorisés à récupérer pendant un certain temps selon la nature du génome entretien protéines1,12. CDB est traitées par les nucléases, plus intensivement durant les phases S et G2 du cycle cellulaire, pour créer une région limitée de l’ADN simple brin qui est rapidement recouvert par l’armée patriotique rwandaise et autres génome entretien facteurs9. Cette région de l’ADN simple brin est entourée de la chromatine qui est largement modifiée au cours de la DDR à réglementer le recrutement et l’échange d’autres facteurs DDR13. Recrutement de protéines aux régions irradiées micro peut être surveillé par IF (Figure 1 a). En règle générale, les facteurs associés à la chromatine (p. ex., γ-H2A.X, 53BP1, etc.) sont détectables au plus tôt (1-5 min) temps de points que les protéines liées à ADN simple brin parce que nucléase induite par la résection des extrémités de l’ORD est requis pour générer la plateforme de l’armée patriotique rwandaise-ADN simple brin (≥ 10 min). Pour faciliter l’analyse d’image et de publication, nous avons mis au point un script (l’Outliner) de Fidji10 qui définit automatiquement les noyaux cellulaires utilisant un ADN associées à colorant canal (p. ex., DAPI), rendant plus facile à distinguer des micro-irradiation rayures et des cellules individuelles en excluant imprécis ADN coloration au final des images tout en préservant la définition nucléaire (Figure 1 b).

Γ-H2A.X et sous-unités complexes de l’armée patriotique rwandaise fonctionnent comme marqueurs de la chromatine et ADN simple brin-facteurs associés à, respectivement. L’armée patriotique rwandaise-ssDNA apparaît comme foyers ponctuées entourés de chromatine fluorescent grandes rayures décorés par les anticorps de la γ-H2A.X (Figure 1). Co-localisation avec ces marqueurs permet de définir précisément la position des facteurs d’entretien de génome aux lésions de l’ADN. Par exemple, 53BP1, une protéine associée à la chromatine qui contrôle le choix de voie de réparation ORD, co se localise bien avec le signal de γ-H2A.X13. À l’inverse, PRP19, une E3 ubiquitine ligase que fonctions sur l’armée patriotique rwandaise-ssDNA pour promouvoir l’activation de la RTA et la réparation de l’ADN est recruté comme foyers ponctuées qui correspondent étroitement à la RPA32 distribution14,15,16,17 (Figure 1). À noter, certains facteurs peuvent aussi être recrutés sur la chromatine adjacente aux lésions initiales mais ne se propagent pas aux grands domaines entourant la CDB comme γ-H2A.X et 53BP1. Dans ce cas, ces facteurs apparaissent comme ponctuées foyers mais n’auraient pas parfaitement co localiser avec ADNsb lié aux protéines.

D’imagerie de cellules vivantes cellules exprimant un POI le tag un marqueur fluorescent peut être micro-irradié imagé en temps réel pour obtenir très détaillé et cinétique de recrutement (Figure 2 a–C). Plusieurs protéines différentes peuvent être observés simultanément, pourvu que leurs étiquettes fluorescentes peuvent être spectralement séparés les uns des autres. Afin de faciliter l’analyse des séries temporelles, nous avons créé deux scripts de Fidji qui permettent à l’utilisateur de produire des fichiers de film contenant des informations chronologiques (Movie Maker, voir des films de la Figure 2 que du matériel supplémentaire en ligne) et de quantifier les protéines recrutement au sites de micro-irradié (analyseur de dommages)10. Au lieu de la curation d’image manuel fastidieux normalement requise pour décrire le comportement d’une protéine, le script de dommages Analyzer guide l’utilisateur à travers des étapes simplifiées qui surveillent le signal enrichissement sur les sites de micro-irradiés, tandis qu’automatiquement correction pour le mouvement cellulaire, dérive de l’image, signal de fond et de blanchiment à tout moment les points de l’expérience. Les données générées soient facilement compilées dans un tableur et tracées que nécessaire (Figure 2D).

Figure 1
Figure 1 : Facteurs de localisation d’entretien du génome à la chromatine et l’armée patriotique rwandaise-ssDNA plates-formes à des lésions induites par l’irradiation-micro. (A) micro-irradiation Laser dans les cellules présensibilisées mène à la production des cassures d’ADN double brin, qui sont réséqués par endo - et exo-nucléases pour générer l’ADN simple brin. Le compartiment secondaire d’ADNsb peut être visualisé comme foyers ponctuées à l’aide d’anticorps dirigés contre la protéine A de réplication ou autres facteurs ADNsb localisée. En revanche, les protéines ou les modifications qui se propagent aux domaines de la chromatine grand apparaissent sous forme de grandes rayures sur le site de micro-irradié semblable au modèle observé avec des anticorps ciblant la variante phosphorylés histone H2A. X (Γ-H2A.X). (B) les cellules pré sensibilisées avec BBET ou BrdU ont été irradiés micro, des extraits, fixe et colorés pour les protéines indiqués. 12-bit images ont été recueillies à 1 X zoom et traitées en utilisant le script Outliner Fidji. (C) Z un empilement de cellules présensibilisées BBET ou BrdU permet de résoudre des ADN simple brin et la chromatine-associées aux facteurs (intensité maximale Z-projection montré). (D) en utilisant que cette méthode, les 53BP1 et les PRP19 peuvent être classés comme chromatine et ADN simple brin-associées à des facteurs de maintenance du génome, respectivement. Barreaux de l’échelle = 10 µm ; images de D sont tous à la même échelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Live-imagerie de recrutement complexe de l’armée patriotique rwandaise aux sites des dommages à l’ADN. (A) la transfection Stable ou transitoire des plasmides codant des protéines de candidats estampillés fluorescents reporters suivies par micro-irradiation des cellules transfectées permet le suivi du recrutement des protéines aux lésions de l’ADN en temps réel. (B) les cellules ont été transfectées avec un plasmide pDEST47-RPA32-GFP et lysent 24h plus tard. Expression de la protéine a été confirmée par immunoblotting. (C) cellules transfectées avec pDEST-SFB EGFP ou pDEST47 RPA32-GFP plasmides pré sensibilisées avec BrdU ont été irradiés micro et imagés à 12 bits à 1 X zoom, une fois par minute après l’irradiation. Timing est en après irradiation minutes. L’image de point de temps de 00:00 a été prise avant l’irradiation-micro. Fichiers de film ont été créés en utilisant le script de Movie Maker Fidji et les images clés sont affichés. Barreaux de l’échelle = 10 µm. (D) recrutement de RPA32-GFP d’irradiation micro rayures surveillait quantitativement en utilisant le script de dommages Analyzer Fidji. Données de sortie ont été tracées à l’aide de Microsoft Excel. La ligne noire est la moyenne enrichissement-bergerie de RPA32-GFP sur les sites de micro-irradié par rapport au signal avant l’irradiation et les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne des 15 cellules irradiées micro indépendamment. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Movie 1
Movie 1 : Micro-irradiation accélérée des cellules exprimant SFB-GFP. Les cellules transfectées de manière transitoire avec un plasmide GFP pDEST-SFB étaient présensibilisée 24h avec BrdU, micro-irradié et imagé une fois par minute pour 29 min. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

Movie 2
Movie 2 : Micro-irradiation accélérée des cellules exprimant RPA32-GFP. Les cellules transfectées de manière transitoire avec un plasmide RPA32-GFP de pDEST47 étaient présensibilisée 24h avec BrdU, micro-irradié et imagé une fois par minute pour 29 min. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce film.

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Discussion

Utilisant les méthodes décrites ci-dessus, 405 nm laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec BBET ou BrdU permet la génération localisée des lésions de l’ADN dont la CDB dans le noyau des cellules humaines adhérentes. Cinétique de DDR à ces DSBs sont similaires à ceux générés avec d’autres méthodes dans les cellules eucaryotes9,18,19. Résection de DSB sur les sites de micro-irradié mène à ssDNA-génération qui peut être suivi à l’aide d’un anticorps RPA32 de ciblage ou une fusion RPA32-GFP. Les facteurs associés à la chromatine, en revanche, peuvent être trouvées à l’aide de γ-H2A.X comme référence. Certains facteurs associés à la chromatine répande pas loin de l’ORD initiale autant que γ-H2A.X et apparaissent comme des foyers ponctuées qui peuvent être distinctes de foci protéines liant l’ADN simple brin.

Une fois que la CDB est générés, recrutement de protéines et de dégagement des sites de dommages peuvent être surveillés par IF sur cellules fixes. Ces expériences requiert uniquement un anticorps IF approprié contre le POI. Si les anticorps IF compatibles ne sont pas disponibles, les plasmides peuvent être conçues porteurs de gènes d’intérêt dans le cadre des épitopes spécifiques (par exemple: drapeau, His-tag) ou protéines fluorescentes. Transfection transitoire ou stable/la transduction de ces plasmides dans les cellules adhérentes permet ensuite de déterminer si un facteur spécifique est activement recruté à l’ADN endommagé. Surexpression de protéines peut conduire à une mauvaise localisation et peut augmenter artificiellement leur recrutement à irradié par des micro rayures. Pour obtenir des résultats plus représentatifs des protéines endogènes, CRISPR-Cas9 technologie peut maintenant être utilisée couramment pour marquer n’importe quel gène d’intérêt avec des épitopes adapté20,21.

Les scripts Python fournies dans le Plugin de Fidji analyse micro-irradiation facilitent la visualisation, présentation, composition et analyse de la cinétique de protéines DDR. Ce progiciel d’analyse est open-source et fonctions quelle que soit la plateforme microscope permettent d’effectuer des expériences de micro-irradiation et acquisition d’images. Tout ce qui est requis est que les images prises sur la plate-forme de microscopie enregistrées comme Bio-Formats compatibles avec les fichiers22. Depuis le fond, à la dérive et blanchiment des corrections sont effectuées automatiquement, l’analyse des niveaux de protéine au sites de dommages d’ADN avec les scripts fournis est simple et très rapide par rapport à la quantification du signal manuel typique réalisée avec logiciel d’acquisition des images du microscope.

Comme décrit dans le protocole, les utilisateurs doivent configurer soigneusement leur respectif balayage laser systèmes de microscope confocal afin d’atteindre le montant approprié des dommages et induire la CDB qui suit cinétique normale de DDR. En effet, la quantité et le type de lésions de l’ADN générés par micro-irradiation dépendra sur la longueur d’onde laser et la dose ainsi que sur les méthodes de sensibilisation préalable. Les utilisateurs doivent garder à l’esprit que même si CDB est générés par les conditions décrites ici, 405 nm laser micro-irradiation des cellules photosensibilisés génère également un mélange d’autres lésions de l’ADN, y compris cyclopyrimidine dimères (CPDs), BSN et oxydés bases, qui varieront entre systèmes de microscope et paramètres23,24,25. Ainsi, un suivi attentif des lésions aux sites de micro-irradié doit être effectuée afin d’obtenir une image complète des dégâts générés et la réponse. Ce qui est important, afin d’étudier la réponse à la CDB, chaque système de microscope doit être optimisée en surveillant la cinétique de canoniques protéines de dommages d’ADN et des modifications post-traductionnelles sur les sites de micro-irradié. Par exemple, γ-H2A.X et des sous-unités de complexes de l’armée patriotique rwandaise (RPA70, RPA32 ou RPA14) peuvent être utilisées rapidement et commodément qu’ils sont assez faciles à détecter s’accumulent à la CDB. En règle générale, γ-H2A.X signal doit être visualisé comme rayures au début (5 min) et tardif (jusqu'à 3-4 h) points de dégâts après alors que l’armée patriotique rwandaise devrait commencer à s’accumuler comme foyers ponctuées environ 10-15 min post-ultra-micro-irradiation. Si on observe un signal de γ-H2A.X pan-nucléaire, la quantité d’énergie reçue par les cellules est non physiologiques et entraînera la mort cellulaire rapide.

Il existe certaines limitations qui doivent être considérés lors de l’utilisation d’un laser à 405 nm pour l’étude des voies de réparation de l’ADN spécifiques. Par exemple, bien que la combinaison de nm de BBET-405 donne facilement une combinaison de BSN et CDB, il ne génère pas les photoproduits 6-4 (6-4 PPs) et par conséquent, la cinétique du recrutement des protéines de réparation de l’excision nucléotide sont différentes de celles observé à l’aide du micro-irradiation UV-C. La cinétique et la mesure de recrutement de diverses protéines impliquées dans la réponse à la CDB peuvent aussi varier selon l’ADN endommageant la méthode qui est actuellement utilisé23. En raison de ces variations, nous recommandons que les utilisateurs adaptent leurs systèmes afin de maximiser le type des lésions potentiellement reconnus par leur POI. Bien que ces systèmes sont moins largement disponibles, utilisant d’autres types de lasers y compris les UV-A (337 – 355 nm) ou femtoseconde proche infrarouge (800 nm) ainsi que des réactifs de sensibilisation différents (p. ex.: psoralène tri-méthyl) peut permettre aux utilisateurs de générer plus des lésions de l’ADN spécifiques selon l’ADN réparent voies sous étude24,26.

Chaque fois que les nouvelles conditions sont testées, il est commode d’utiliser des protéines de réparation d’ADN bien établies fluorescent marquées pour tester les doses, longueurs d’onde et sensibilisant les combinaisons et pour s’assurer que la lésion d’intérêts est générée efficacement. Par exemple, PARP1 et XRCC1 peuvent fonctionner comme marqueurs pour SSB et base excision réparation, XPA est un bon indicateur de réparation par excision de nucléotides, et 53BP1 seront recrutés à la CDB et de la fonction à fin-joindre non homologue (référence23,25 ,27,,28). Les anticorps qui reconnaissent les modifications associées à certains types de dommages à l’ADN peuvent également servir à quantifier les niveaux de l’ADN des adduits ou se brise. Il est ainsi possible de surveiller les bases oxydées, cyclopyrimidine dimères, 6 – 4 PPs, BSN (à l’aide d’anticorps de poly-ADP ribose) et CDB (γ-H2A.X et 53BP1) par IF et de déterminer les paramètres qui permettront d’atteindre le plus haut niveau des lésions désiré23, 27 , 29. avec un suivi attentif, les utilisateurs doivent être en mesure d’étudier leur voie de réparation d’intérêt à l’aide de micro-irradiation.

Au total, l’utilisationdes répandue balayage laser confocal microscopes équipés de 405 nm laser lignes pour générer DSBs localisées, combiné avec des marqueurs de dégâts ADN spécifique à la plateforme de classer sous facteurs de maintenance du génome et des données simplifiées traitement à l’aide du plugin Fidji analyse micro-irradiation, devrait rendre l’étude de la dynamique des facteurs DDR plus accessible que jamais à la fois éprouvé et chercheurs débutants du champ maintenance du génome.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches [subvention à la découverte 5026 à a.M] et par une nouvelle génération de bourses d’études scientifiques de la société de recherche du Cancer [21531 à a.M]. Nous remercions m. Jean-François Lucier fournissant l’excellent contrôle de la qualité des scripts Python de Fidji et conseils sur l’analyse statistique. Nous remercions le Dr. Stephanie A. Yazinski pour la recette de solution de fixation IF. Nous remercions Paul-Ludovic Karsenti de l’aide avec les mesures de puissance laser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope Olympus
FluoView FV3000 software (version 2.1) Olympus
405 nm laser Coherent Radiation source
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 Okolab OKO-UNO-1
60X /1.4 Objective Olympus Oil immersion objective
8-well culture slides on coverglass (X-well) Sarstedt 94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell line ATCC HTB-96 Stable cell lines 
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ThermoFisher D1306 Caution toxic
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)  Sigma-Aldrich 59-14-3
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Caution toxic
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) ThermoFisher 62249
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher BP1600-100
Trypsin EDTA 0.1%  ThermoFisher 15400-054
Triton X-100  BioShop TRX777.100
Tween-20  ThermoFisher BP337-500
Sucrose  BioShop SUC507
JetPRIME transfection reagent  Polyplus 114-07
ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI  ThermoFisher P36962
DMEM 1X, + phenol red Wisent  319-005-CL
DMEM 1X, - phenol red Wisent 319-051-CL
Fetal bovine serum (FBS) Wisent  080-150
Mouse anti-RPA32 antibody Abcam ab2175 1:500 for IF
Rabbit anti-γ-H2A.X antibody Cell Signaling  9718S 1:500 for IF
Rabbit Anti-53BP1 antibody Cell Signaling  4937S 1:500 for IF
Rabbit Anti-PRP19 antibody Abcam ab27692 1:500 for IF
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 Cell Signaling  4414S 1:250 for IF
Goat anti-mouse  IgG Alexa Fluor 488  Cell Signaling  4408S 1:250 for IF
Fiji image analysis open-source software  https://fiji.sc
1918-K Power meter  with a 918D-SL-0D3 sensor Newport

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References

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Gaudreau-Lapierre, A., Garneau, D., Djerir, B., Coulombe, F., Morin, T., Marechal, A. Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation. J. Vis. Exp. (133), e57410, doi:10.3791/57410 (2018).

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