Vi presenterar ett protokoll för att isolera nervceller, makrofager och mikroglia från larval zebrafiskar hjärnor under fysiologiska och patologiska förhållanden. Vid isolering utvinns RNA från dessa celler att analysera deras gen uttryck profil. Detta protokoll möjliggör insamling av hög kvalitet RNA för att utföra efterföljande analys som qPCR och transkriptomik.
För att få en detaljerad förståelse av olika CNS celler under utveckling eller de skapande roll och progression av hjärnan patologier, är det viktigt att isolera dessa celler utan att ändra deras gen uttryck profil. Zebrafisk modellen ger ett stort antal transgen fisk linjer där specifika celltyper är märkta; till exempel nervceller i NBT:DsRed linjen eller makrofager/mikroglia i raden mpeg1:eGFP. Dessutom antikroppar har utvecklats för att färga specifika celler, såsom mikroglia med 4 c 4 antikropp.
Här beskriver vi isolering av nervceller, makrofager och mikroglia från larval zebrafiskar hjärnor. Centralt för detta protokoll är undvikandet av en enzymatisk vävnad matsmältningen vid 37 ° C, som kunde ändra cellulära profiler. I stället används ett mekaniskt system av vävnad homogenisering vid 4 ° C. Detta protokoll innebär homogenisering av hjärnor till cellsuspension, deras immuno-färgning och isoleringen av nervceller, makrofager och mikroglia av FACS. Efteråt kan vi extraherade RNA från dessa celler och utvärderade deras kvalitet/kvantitet. Vi lyckades få RNA av hög kvalitet (RNA integritet nummer (RIN) > 7) att utföra qPCR på makrofager/mikroglia och nervceller, och transcriptomic analys av mikroglia. Detta tillvägagångssätt möjliggör en bättre karakterisering av dessa celler, samt en tydligare förståelse om deras roll i utveckling och sjukdomar.
Kunskapen om hjärnans utveckling och sjukdomar i hjärnan har förbättrats avsevärt under det senaste decenniet sedan första kvantifiering av mus hjärnan transcriptomes1. Faktiskt, genomanalys brett gen uttryck ger oss tillgång till genetisk information om hjärnans vävnader och celler som kan komplettera och förbättra iakttagelser med andra tekniker och verktyg.
Zebrafiskar är en potent biologiska modell, lätt att odla och ändra genetiskt; dess optisk transparens larval skeden tillåter levande avbildning observationer2. Tyvärr, jämfört till mänskliga och mus, antalet tillgängliga antikroppar att utföra immuno-färgning är ganska låg. För att åtgärda detta, görs transgena zebrafiskar fisk linjerna enkelt genom att genetiskt modifiera fisk att uttrycka fluorescerande proteiner under cell typ specifika initiativtagare. Transgena zebrafiskar linjer har använts i förflutnan för att studera makrofager och mikroglia roll under centrala nervsystemet (CNS) utveckling och sjukdom3,4,5,6. Men för att få detaljerad förståelse av dessa processer måste vi förstå förändringar i genuttryck i de respektiva celltyper. I detta syfte utvecklade vi en experimentell metod för att specifikt isolera cellerna som nervceller, makrofager och mikroglia från 3 till 8 dagar efter befruktning (dpf) larval zebrafiskar hjärnor. För etableringen av protokollet arbetade vi med transgen fisk rader som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i makrofager/mikroglia under makrofag-uttryckta gen arrangören (mpeg1:eGFP) och DsRed i nervceller under det neurala ß-tubulinet arrangören (NBT:DsRed)7,8,9. Dessutom har vi utfört immuno-färgning av mikroglia använder 4 c 4, en mus monoklonal antikropp som specifikt fläckar zebrafiskar mikroglia10,11. Efteråt, ribonukleinsyra (RNA) utvinns ur dessa celler för ytterligare kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR) eller transkriptom analyser. Detta protokoll har utformats för att effektivt homogenisera hjärnvävnad från zebrafisk larver; samla nervceller, makrofager/mikroglia och mikroglia utan ändring av deras plasmamembranet integritet och slutligen extrahera RNA från dessa celler i hög kvalitet (RIN > 7) och kvantitet att utföra genomisk analys. Till skillnad från tidigare publicerade studier som använder trypsin behandling vid 37 ° C för att smälta hjärnans vävnad12,13, främjar detta protokoll arbete vid 4 ° C tills det RNA extraktion steget att minska modifieringar av gen uttryck profilen. Detta steg är avgörande som mikroglia och makrofager är mycket känsliga celler som reagera på förändringar i sin mikromiljö omedelbart genom att ändra deras gen uttryck profil och polarisering14,15, 16.
Protokollet beskrivs här i detalj, visar isolering av nervceller, makrofager och mikroglia från zebrafisk larval hjärnor, men nästan, det kan anpassas till alla andra celler presentera inom hjärnan – antingen med hjälp av transgen fisk rader eller märkta med specifika antikroppar. Denna metod kommer att möjliggöra en bättre karakterisering av CNS celler via deras genome bred gen uttryck analyser och hjälper till att förstå sin roll under utveckling och sjukdomar i hjärnan.
Det experimentella protokollet som beskrivs här representerar en robust och effektiv metod att isolera hjärnceller från zebrafisk larver från 3 till 8 dpf. Allt är detta det första protokollet som tillåter specifika isolering av mikroglia från larval zebrafiskar hjärnor. Protokollet syftar till att bevara cellmembranet integritet och att minimera potentiella ändringar av genuttryck som inträffar under behandlingen. Denna sista punkt är avgörande för betydelsen av resultat baserat på en analys av dessa isolerade cellulära genetiska profiler. Mikroglia och makrofag polarisering är faktiskt starkt influerad av sin mikromiljö. Vid 37 ° C, skulle dessa celler ha ändrat sin gen uttryck profil i svar på experimentella förhållanden (skada (transection) svar). Därför var det avgörande att utföra detta experiment vid 4 ° C före RNA-extraktion, att bromsa cellulära processer och metaboliska aktiviteter. Dessutom valdes mekaniska hjärnans vävnad homogenisering vid 4 ° C istället för enzymatisk vävnad matsmältningen vid 37 ° C för att undvika inverkan på gen uttryck profiler.
Det är viktigt att betona att denna metod är mycket snabb; inom en dag kan flera hjärnan cellpopulationer isoleras från minst två olika experimentella förhållanden och deras RNA extraherade. Den totala längden av protokollet beror på antalet larver används för varje villkor som transection av larval huvuden är det begränsande steget (∼ 350 huvuden/h). I allmänhet, för att arbeta med mikroglia från 3, 5 och 7 dpf rekommenderas att transekt ∼ 600 huvuden per test för att få tillräckligt RNA att extrahera (tabell 1). Som mikroglia representerar celltypen med den lägsta avkastning (ca 112 celler per capita på 7 dpf), antalet huvuden kan minskas för andra celltyper inklusive makrofager (ca 170 celler per capita på 7 dpf).
En annan fördel med detta protokoll är att när inställningarna på FACS Sorteraren har fastställts, samma inställningar kan användas för olika experiment. Det har observerats att cellpopulationer passar perfekt från ett experiment till en annan med grindar som tidigare designat, visar reproducerbarheten för experiment med denna metod.
En liten nackdel med denna metod är den relativt låga mängden RNA som skördas. Denna begränsning är dock mer en biologisk fråga än ett tekniskt problem, eftersom antalet mikroglia är mycket låg i tidiga skeden av hjärnans utveckling (tabell 1). På grund av detta låg mängd RNA samlas in, behöver förstärkning steg övervägas att utföra genomanalys brett gen uttryck. Lyckligtvis producerar stegen förstärkning tillräckliga mängder av hög kvalitet cDNA. Således, globala förändringar i genen uttryck profilerna isolerade celler kan studeras.
Avslutningsvis ger detta protokoll en robust metod för att isolera och studera olika CNS celltyper från larval zebrafiskar hjärnor. Detta kan användas för att få en djupare förståelse av dessa celler under utveckling samt att studera deras roll i sjukdomen.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Claire Davis och Dr Veronique Miron (drottningens Medical Research Institute, Edinburgh, United Kingdome) för första hjälp och diskussioner om den experimentella metoden och QMRI Flow flödescytometri och cellen sortera Facility. Detta arbete stöds av en Cancer Research UK karriär etablering Award till Dr. Dirk Sieger.
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Hepes | Gibco | 15630-056 | |
D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
10 mL syringe | BD | 302188 | |
Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
FACS tubes | BD | 352063 | |
Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
RNaseZap | Ambion | AM9780 |