Summary
Biz nöronlar, makrofajlar ve microglia larva Zebra balığı beyin fizyolojik ve patolojik şartlar altında gelen izole etmek için bir protokol mevcut. Yalıtım, RNA gen ifade profillerini analiz etmek için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı için yüksek kaliteli RNA koleksiyonu aşağı akım analizi qPCR ve transcriptomics gibi gerçekleştirmek için izin verir.
Abstract
Geliştirme veya kuruluş sırasında farklı CNS hücrelerinin rolü ayrıntılı bir anlayış ve beyin patolojiler ilerlemesini elde etmek için onların gen ifade profil değiştirmeden bu hücreleri izole etmek önemlidir. Zebra balığı modeli içinde belirli hücre tipleri etiketli transgenik balık hatları çok sayıda sağlar; Örneğin nöronlar NBT:DsRed satır veya makrofajlar/microglia mpeg1:eGFP doğrultusunda. Ayrıca, antikorlar microglia 4 c 4 gibi belirli hücreleri leke için geliştirilmiş antikor.
Burada, yalıtım nöronlar, makrofajlar ve larva Zebra balığı beyin üzerinden microglia açıklayın. Kaçınma bir enzimatik doku sindirim hücresel profilleri değiştirebilir ve 37 ° c, bu protokol için merkezi bir noktada bulunuyor. Bunun yerine doku homojenizasyon 4 ° C'de mekanik bir sistem kullanılır. Bu iletişim kuralı hücre süspansiyon içine beyin Homojenizasyon, onların immün boyama ve nöronlar, makrofajlar ve microglia tarafından FACS yalıtım gerektirir. Daha sonra bu hücrelerden RNA çıkarılan ve ise kalite/miktarı değerlendirilir. RNA yüksek kalite elde başardı (RNA bütünlük numarası (RIN) > 7) qPCR microglia makrofajlar/microglia ve neurons ve transcriptomic analiz gerçekleştirmek için. Bu yaklaşım daha iyi karakterizasyonu bu hücreler, hem de onların rolü geliştirme ve patolojileri hakkında daha net anlaşılmasını sağlar.
Introduction
Beyin gelişimi ve beyin hastalıkları bilgi fare beyin transcriptomes1ilk miktar beri son on yılda önemli ölçüde iyileşmiştir. Nitekim, genom geniş gen ifade analizi bize beyin dokusu ve tamamlayan ve diğer teknikleri ve araçları ile yapılan gözlemleri geliştirmek hücreleri üzerinde ayrıntılı genetik bilgilere erişim sağlar.
Zebra balığı bir güçlü biyolojik, doğurmak ve genetik olarak değiştirmek için kolay modeldir; larva aşamaları, optik, şeffaflık canlı görüntüleme gözlemler2sağlar. Ne yazık ki, karşılaştırma için insan ve fare, immün boyama gerçekleştirmek için kullanılabilir antikorlar sayısı oldukça düşüktür. Bu sorunu gidermek için transgenik Zebra balığı balık hatları kolayca genetik olarak balık değiştirerek floresan proteinler hücre türü belirli rehberleri altında ifade etmek için yapılır. Transgenik Zebra balığı satırları geçmişte de merkezi sinir sistemi (MSS) geliştirme ve hastalık3,4,5,6sırasında makrofajlar ve microglia rolü eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, bu süreçlerin detaylı bir anlayış kazanmak için ilgili hücre tipleri ifadede gen değişiklikleri anlamak ihtiyacımız var. Bu amaç için özellikle nöronlar, makrofajlar ve 8 gün 3 microglia gibi hücreleri izole etmek için deneysel bir yöntem geliştirdik sonrası döllenme (dpf) larva Zebra balığı beyin. Protokol kurulması için biz makrofajlar/microglia nöronlar sinirsel β-tübülin altında içinde makrofaj ifade edilen gen Düzenleyici (mpeg1:eGFP) ve DsRed altında yeşil flüoresan protein (GFP) hızlı transgenik balık hatları ile çalıştı organizatörü (NBT:DsRed)7,8,9. Ayrıca, biz 4 c 4, özellikle Zebra balığı microglia10,11lekeleri bir fare Monoklonal antikor kullanarak microglia, immün boyama uygulandı. Daha sonra ribonükleik asit (RNA) daha fazla nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) veya transcriptome analizleri için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı verimli Zebra balığı larva beyin dokusundan homojenize için tasarlanmıştır; nöronlar, makrofajlar/microglia ve microglia onların plazma membran bütünlüğü İLETİMLERİNİZE olmadan toplamak ve sonunda bu hücreler yüksek kalitede RNA ayıklamak (RIN > 7) genom analizi yapmak için gerekli ve miktarı. Beyin dokusu12,13sindirmek için 37 ° C'de tripsin tedavi kullanın önceden yayınlanmış çalışmaları farklı olarak, bu iletişim kuralı gen ifade profil değişiklikler azaltmak için RNA ayıklama adım kadar 4 ° C'de iş teşvik etmektedir. Bu microglia çok önemli bir adımdır ve onların microenvironment değişikliklere hemen onların gen ifade profil ve polarizasyon14,15, değiştirerek yanıt son derece hassas hücreler makrofajlar 16.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, yalıtım nöronlar, makrofajlar ve microglia Zebra balığı larva beyin, ancak hemen hemen, o başka bir hücre için adapte edilebilir gösterir beyin - transgenik balık satırları kullanarak içinde mevcut veya ile Etiketlenmiş belirli antikor. Bu yöntem ile onların genom geniş gen ifade analizleri CNS hücreleri daha iyi bir karakterizasyonu sağlayacak ve geliştirme ve beyin hastalıkları sırasında kendi rolünü anlamak için yardımcı olacaktır.
Protocol
1. örnek ve medyası hazırlama
- Eriterek KCl 6.4 mM, 0.22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2o embriyo orta (E3) hazırlayın
- Zebra balığı embriyo hemen sonra gübreleme (0 dpf) toplamak.
- Zebra balığı embriyo 50-90 mm petri kabına ayrılmıştır. Embriyo 200 µM 1-fenil 2-Tioüre ile (PTU), tedavi embriyo orta (E3) 50 ml 28.5 ° C'de geliştirme (0 dpf) pigmentasyon etkisizleştirmek için deneme süresi için ilk günün sonundan kaldırın.
- Değişiklik E3 + PTU orta günlük deneme süresi için.
- Ekran mpeg1:eGFP ve NBT:DsRed larva 2 dpf floresan stereomicroscope olumlu transgene ifade, GFP+ makrofajlar/microglia ve DsRed+ nöronlar için kullanarak.
- Tüm medya bir gün önce bir doku kültürü hood kontaminasyon için deneme hazırlamak, sonra onları 4 ° C'de depolayın
- Medya A 15 mM Hepes ve 25 mM D-glikoz HBSS 1 çözülerek hazırlamak x.
- Yoğunluk gradient orta (% 100) 9 HBSS 10 1 hacmi yoğunluk gradient ortamda hacimleri karıştırarak hazırlayın x.
- Yoğunluk gradient orta (% 22) 88 mL DPBS 1 yoğunluk gradient orta (% 100) 22 mL sulandrarak hazırlamak x.
- Hazırlamak DPBS 1 x.
- E3 orta + Tricaine 450 mikron ile E3 orta karıştırılarak hazırlamak Tricaine.
2. homojenizasyon
Not: Tüm adımlardır: gerçekleştirilen 4 ° C.
- 1.5 mL Tricaine (15 mM) 90 mm Petri yemekler 200 µM PTU ölümcül onları anestezi ile tedavi E3 embriyo orta 50 ml 50 larva içeren ekleyin.
- 10 imzalat larvaları üzerinden 3 mL Pasteur plastik toplu pipet ile petri yemekler berbat.
- Anestezi transfer larva 10 10 55 mm petri kabına içine buz gibi E3 embriyo orta + Tricaine ile dolu.
- Bir stereomicroscope altında 10 larva petri kabına ortasına hizalayın. O zaman cerrahi mikro-makas (yüzmek kafa yüzen önlemek için mesane hariç) kullanarak sarısı-sac yukarıda larva kafaları transect.
- Petri yemekler 3 mL Pasteur plastik toplu pipet ile başları berbat. Tüm başkanları pipet ucu içinde toplamak ve sonra 1 mL buz gibi medya A içeren bir cam homogenizer aktarmak kadar bekleyin (medya azaltmak için en az bir bölüm bir seyreltme transferi E3 + Tricaine tarafından). Cam homogenizer buz üzerinde tutun. Deneysel koşul başına bir homogenizer kullanın.
- Her küçük petri kabına buz içeren yerine soğuk E3 + Tricaine ile yeni bir tane her 30 dakikada o transeksiyon sağlamak için gerçekleştirilen soğuk E3 + Tricaine orta.
- Renk solmaya başladığında cam homogenizer buz gibi medya A değiştirin.
Not: Medya A seyreltme sıcaklık değişiklikleri nedeniyle kafa doku değiştirebilirsiniz. - Tüm başkanları topladıktan sonra (600 başkanları/koşul), medya a maksimum ses cam homogenizer kaldırın ve eski yerine koymak o ile 1 mL taze buz gibi medya a.
- Buz üzerinde sıkı cam homogenizer ile beyin dokusu bozabilir. 3-5 dpf larva ve 7 ve 8 dpf larva için 50 için 40 mermi ezme ve döner gerçekleştirin.
- Hücre süspansiyon için medya a 2 mL ekleyin (1 mL medya A / 200 başları), bu seyreltik hücreleri ve onların Aglomerasyon ile ayırma Santrifüjü yoğunluk gradient orta sırasında kolaylaştırmak için miyelin azaltmak.
- Hücre Aglomerasyon ortadan kaldırmak için hücre süspansiyon buzda muhafaza soğuk 50 mL Şahin tüp üzerine yerleştirilen bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla çalıştırın. Bu işlem 3 kez tekrarlayın.
- Hücre süspansiyon 1 mL soğuk 1.5 mL tüpler içine aktarmak ve onları 4 ° C'de 10 dakika için 300 g de spin
- 10 mL şırınga kullanarak süpernatant kaldırmak + 23G x 1'' iğne.
- Hücre Pelet yavaşça buz gibi DPBS 1 tarafından 0.5 mL overlaid buz gibi % 22 yoğunluğu degrade orta 1 mL ile yeniden askıya alma (yapmak değil onları her iki çözüm arasında bir interfaz görülebilir mix) x.
- Tüpler, 950 g 4 ° C'de 30 dk için yavaş hızlanma ve fren olmadan spin
Not: Bu adımı DPBS 1 interfaz iyon tarafından miyelin diğer hücrelerden ayırır x ve % 22 yoğunluk gradient orta, hücreleri tüp alt kısmında cips oysa. Hücre konsantrasyonu çok yüksek olduğunda miyelin kaldırma daha verimli olur. - Bir 10 mL şırınga + en çok DPBS, yoğunluk gradient orta ve miyelin tuzağa iğne 23G x 1'' atma onların Interphase kullanarak.
- Hücreleri medya a 0.5 mL + normal keçi serum (NGS) % 2'si ile yıkayın, sonra tüpler, 300 g 4 ° C'de 10 dakika için spin
- En fazla süpernatant atmak, sonra aynı deneysel koşullarda 1 mL birlikte medya A + %2 tüm hücre çökeltilerini havuz NGS.
- Tüpler, 950 g 4 ° C'de 30 dk için yavaş hızlanma ve fren olmadan spin
- Faiz hücreleri makrofajlar/microglia mpeg1:eGFP dan gibi floresan bir protein hızlı veya NBT:DsRed transgenik balık (transgenik balık bkz: 1.1.3 tarama), hücre süspansiyon 35 µm hücre süzgeç aracılığıyla çalıştırmak neurons kap ve içine aktarmak bir buz, üzerine soğuk 5 mL FACS boruları ışıktan korunan.
Not: Alternatif olarak, microglia, immün boyama gerçekleştirilebilir.
3. Microglia immün boyama
Not: Tüm adımlar 4 ° C'de gerçekleştirilir
- Hücre Pelet medya A + %2 0.3 mL ile yeniden askıya NGS. 3 x 1.5 mL tüplerde bölüp: bir ikincil antikor microglia ve üçüncü bir test olarak non-spesifik bağlama ölçmek ikincil antikor (1/200) için auto-floresan hücreleri ilgi, ikinci ölçmenin günahı hücreler için (4 c 4 fare monoklonal antikor (microglia özel) (1/20) + ikincil antikor (1/200)).
- Düşük endotoksin, azid ücretsiz (Fc etki alanı ile CD16/CD32 etkileşimleri immünglobulin engellemek için yaprak) %1 hücrelere (tüm tüpler) ekleyin. Hücreler ile nazik ajitasyon her 5 dk 10 min için kuluçkaya.
- 4 c 4 ekleyin antikor (1/20) hücrelere (tüp 3) ve nazik ajitasyon ile 30 dk için her 10 min kuluçkaya.
- Tüpler, 300 g 4 ° C'de 10 dakika için spin sonra süpernatant atmak.
- Medya a + %2 0.5 mL ile NGS, sonra spin sonra tüpler 300 g 4 ° C'de 10 dakika için yıkama
- Yeniden askıya hücre Pelet medya A + %2 0.5 ml ile NGS ve nazik ajitasyon her 5 dk ile 10 min için % 1 yaprak hücreleri kuluçkaya.
- İkincil antikor (1/200) hücreleri (tüp 2 ve 3) ekleyin. Hücreler için nazik ajitasyon ile 30 dk her 10 min ve lamba koruma kuluçkaya.
- Tüpler, 300 g 4 ° C'de 10 dakika için spin sonra süpernatant atmak.
- Medya A + %2 NGS sonra yeniden askıya hücre Pelet 0.5 mL ile medya A + %2 1 mL ile iki kez yıkama NGS.
- Hücre süspansiyon bir 35 µm hücre süzgeç kap çalıştırmak ve ışıktan korunan buzda soğuk 5 mL FACS tüpler içine aktarabilirsiniz.
4. hücre (FACS) sıralama
Not: 4 ° C'de tüm adımları gerçekleştirin
- Nöronlar, makrofajlar/microglia ve microglia bir FACS kullanarak sıralayın.
Not: Bu adım genellikle FACS tesis personel tarafından gerçekleştirilir ve ayarları cihazları türüne göre değişir.- 1 µg/mL olan ölü hücreleri etiketlemek için her FACS tüpünde bir konsantrasyon, DAPI ekleyin.
- FACS ve sıralama nöronlar, makrofajlar/microglia veya microglia tüm beyin hücrelerinden ayarlamanız. Hücre boyutu ve parçalı yapı işlevindeki enkaz ayırmak, o zaman tek-hücreleri tarafından ileri dağılım ve yan dağılım kapısı. Ölü hücreleri canlı hücrelerden DAPI etiketleme tarafından hariç. Nöronlar, makrofajlar/microglia veya microglia onların anılan sıraya göre olumlu boyama tarafından tanımlamak.
- 1.5 mL tüpler buz gibi medya A + %2 1 mL içeren hücrelerde toplamak NGS buz üzerinde. Farklı tüpler her hücre türü için kullanın.
- Tüpler, 300 g 4 ° C'de 10 dakika için spin ve süpernatant atın.
- Medya 0.5 mL ile A sonra atmak sonra en fazla süpernatant yıkayın.
5. RNA çıkarma
- RNA FACS tarafından ayrılmış farklı hücre tipleri ayıklayın. RNA çıkarılması için belirli bir setini kullanın ve üreticinin yönergeleri izleyin. Temizlik çalışma alanı ve Pipetler RNase dekontaminasyon ürün ile bir RNase özgür ortamda çalışmak ve filtre ipuçları kullanmak için emin olun.
- Taze 1 mL 50 µM β-mercaptoethanol ile desteklenmiş lizis arabelleği hazırlayın.
Not: Burada, β-mercaptoethanol RNA bozulması azaltmak için eklenir. - RNase kullanarak % 70 ve % 80 etanol çözüm ücretsiz su hazırlamak.
- 75 µL 50 µM β-mercaptoethanol ile desteklenmiş lizis arabelleği içeren hücreleri parçalayıcı. Daha sonra bir kağıt öğütücü hücre bozulma geliştirmek için kullanın.
- RNA ayıklama üretici göre el ile devam edin.
- Protokol sonunda yeterli bir RNA konsantrasyon elde etmek için RNA 14 µL RNase free su ile elute.
- Taze 1 mL 50 µM β-mercaptoethanol ile desteklenmiş lizis arabelleği hazırlayın.
Representative Results
Açıklanan protokol nöronlar, makrofajlar ve microglia Zebra balığı larva beyin gelen izole etmek için basit bir yaklaşımdır. Bu hücreler, önemli miktarda yüksek kaliteli izole (RIN > 7) RNA çıkarılan. Bu iletişim kuralının amacı farklı türlerinden MSS, analiz etmek ve hücre özellikleri ve işlevleri karakterize gen ifade profilinin en az değişiklik ile hücre izole etmektir. Bu nedenle, tüm protokol ile mekanik beyin doku homojenizasyon 4 ° C'de gerçekleştirilir. Bu yöntem, laboratuvarda yapılan iki Etütler başarıyla kullanılmıştır. İlk çalışmada, sinir hücreleri ve makrofajlar/microglia 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larva (şekil 1) izole edildi. Enkaz ayrılması hücre boyutlarını işlevinde izin FACS (FSC-A) ve parçalı yapı (SSC-A) (Resim 1A). Tek hücre sonra birini veya hücre aglomeralar (şekil 1B) ayrı kaldık. Tek hücre popülasyondan bir kapı ölü hücreleri (DAPI+) ortadan kaldırmak için çizilmiştir. Karşılık gelen nokta arsa bu deneysel protokol hücre plazma membran bütünlüğü korur ortaya ölü hücreleri sadece %26,7 (şekil 1C) oranıdır. Son olarak, nöronlar (DsRed+) ve makrofajlar/microglia (GFP+) kolayca canlı hücre nüfus gates ayrılmış. Nöron nüfus (% 23,1) (Resim 1D) beyin içinde makrofajlar/microglia nüfusu (%1.56) daha belirgin olduğu ortaya çıktı. Bu iletişim kuralı sinir hücreleri ve makrofajlar/microglia arasında belirli gen ifadesi karşılaştırmak için sonraki qPCR çözümlemesi yapma RNA bu hücrelerden izole etmek için izin verdi. Şekil 2 gösterir nöronal ve makrofajlar/microglia gen ifade düzeyleri Proliferasyona hücre nükleer antijen (pcna) β-aktin ev tutma gen örnek olarak karşı.
İkinci çalışma için bu yöntem 3, 5 ve 7 dpf larva beyin microglia izolasyon üzerinde duruldu. Yukarıda açıklanan deney aksine, immün boyama tarafından hücreleri izole 4 c 4, özellikle microglia (şekil 3 A-D) etiketleri bir antikor kullanarak. Daha önce açıklandığı gibi microglia (4 c 4+) canlı hücrelerden seçildi ve (şekil 3D) toplanan. Zebra balığı larva beyin içinde Microglia sayılardır değişken (Tablo 1) ve 3 dpf (balık ∼ 25), çok düşük. Kalite ve bu hücrelerden ayıklanan RNA miktarı tabanlı mikro-kılcal Elektroforez sistemi kullanılarak ölçüldü. Ayıklanan RNA microglia 5 dpf larva Zebra balığı beyin üzerinden elde edilen sonuçlar RNA analizi (Tablo 1 (5 dpf; deney 4)) bir örnek göstermek için sağlanmıştır. Şekil 4 Elektroforez izleme ve ribozomal RNA (28s ve 18s) açık bir görselleştirme ile bu örnek için elde edilen, grafik gösterimi gösterir. Bu veri örnek RIN hesaplamak ve RNA konsantrasyonu belirlemek için gereklidir. Tablo 1 balık, RNA microglia başına miktar ve 3, 5 ve 7 dpf farklı her denemeyi için elde edilen RIN puan başına izole microglia sayısını özetler. Miktarı ve kalitesi izole microglia bu yöntemi kullanarak üzerinden ayıklanan RNA'ın RNA bir seti kullanarak cDNA yükseltmek izin verdi. Edinburgh genomik tarafından sağlanan kalite ve miktar testleri güçlendirilmiş cDNA Kütüphanesi hazırlık ve sonraki sıralama için yeterli kalitede olduğunu doğrulayın. Şekil 5 boyut dağılımı cDNA parçaları ve elektroforetik bir sistem kullanarak ölçülen onların tutarı gösterir. Bu örnekte, 36100 bir konsantrasyon 299bp ortalama boyutunu cDNA vardı pmol/l. Tablo 2 gösterir sırasıyla güçlendirilmiş cDNA (Tablo 1 (5 dpf; deney 4)) RNA örneklerinden yapılan kalite ve miktar testleri. Güçlendirilmiş cDNA başarıyla sıralama için kullanılır.
Birçok araştırma laboratuarında gerçekleştirilen sonraki qPCR ve genom geniş gen ifade analizleri için kalite ve nöronlar, makrofajlar ve microglia ayıklanan RNA miktarı kullanılabilir doğruladı. Bu nedenle, bu deneysel protokol CNS hücrelerinin farklı türleri kendi membran bütünlüğü değiştirme ve değişiklik gen ifade profilinin sınırlama olmadan güvenilir bir şekilde izole etmek için kullanılabilir.
Resim 1 : 8 dpf Zebra balığı larva sinir hücreleri ve makrofajlar/microglia mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ üzerinden sıralama FACS. (A-C) Tek hücreleri ileri dağılım ve yan tarafından (B) dağılım, art arda gelen geçişi sıralı yelpazesi tüm beyin hücreleri (A) gösterir. (C) ölü hücreleri DAPI etiketleme tarafından dışlandı. (D) sinir hücreleri ve makrofajlar/microglia sırasıyla DsRed ve GFP olumlu boyama tarafından tespit edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Gen ifade analizi pcna ve β-aktin sinir hücreleri ve makrofajlar/microglia. RNA izole sinir hücreleri ve makrofajlar/microglia cDNA kullanılmak üzere kantitatif PCR analiz içine transkripsiyonu. pcna β-aktin ev tutma gen izole sinir hücreleri ve makrofajlar/microglia qPCR tarafından belirlenen karşı mRNA ifade düzeyleri (N = 3). Kat değiştirme karşılaştırmalı (ΔΔCT) yöntemi kullanılarak ölçüldü. Hata temsil ortalama ± SEM bar Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Microglia 3 dpf Zebra balığı larvaları üzerinden için FACS sıralama. (A-C) Art arda gelen gating Haritayı sıralı yelpazesi tüm beyin (A) hücreleri, tek hücreleri ileri dağılım ve yan tarafından (B) dağılım. (C) ölü hücreleri DAPI etiketleme tarafından dışlandı. (D) Microglia 4 c 4 tarafından tespit edildi pozitif boyama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Mikro-kılcal Elektroforez sonuçları 5 dpf Zebra balığı microglia üzerinden ayıklanan RNA'ın. İki uzun boylu doruklarına 18S ve 28S ribozomal RNA vardır. RNA bütünlük numarası (RIN) oluşturulan oranı 18S ve 28S ribozomal alt birimleri ve tüm elektroforetik izleme analizi kullanarak bioanalyzer yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanır. Microglia RNA RIN 8,6 vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Kalite ve miktar testleri 5 dpf Zebra balığı microglia, RNA örnekten güçlendirilmiş cDNA. Görüntü cDNA parça boyutu dağılımını analiz örnek ile 299 ortalama boyutunu gösterir bp. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Koşul | Deney | Balık numarası | Cep numarası | Cep numarası balık başına | RNA konsantrasyonu (pg/ul) | Toplam RNA (pg) | RNA hücre (pg) başına bir miktar | RIN puanı |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17,03 | 126 | 1512 | 0,13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0,13 | 7.9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31,15 | 255 | 3060 | 0,16 | 7,7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18.54 | 189 | 2268 | 0,20 | 7,8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0,10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0,26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97.72 | 362 | 4344 | 0,07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0,13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0,09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0,07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74,95 | 134 | 1608 | 0,04 | 7,6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0,04 | 7.9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0,04 | 7,6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0,04 | 7,8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0,06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0,07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99.87 | 245 | 2940 | 0,08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0,06 | 7,8 |
Tablo 1: Microglia yalıtım ve 3, 5 ve 7 dpf Zebra balığı larva RNA ayıklama verileri özetini.
| İç örnek kimliği | Dış örnek kimliği | Qubit'e (ng/ul) | Qubit(NG/ul) | Ortalama konsantrasyon (ng/ul) | Birim (ul) | alınan ug | Pass/en düşük konsantrasyon için başarısız | Pass/minimim miktar için başarısız | Pass/önerilen miktar için başarısız |
| 10907SD0010 | 5 dpf (deney 4) | 58.8 | 58.4 | 58.6 | 30 | 1.76 | Pass | Pass | Pass |
| Kütüphane hazırlık için örnek gereksinimleri: | |||||||||
| Kütüphane hazırlık | En az siparis miktar(cokkatli) (ng) | Önerilen miktar (ng) | En düşük konsantrasyon ng/uL | ||||||
| TruSeq Nano ücretsiz 350 bp Ekle kitaplığından cDNA jel | 600 | 1100 | 10 | ||||||
Tablo 2: Miktar 5 dpf Zebra balığı microglia, RNA örnekten güçlendirilmiş cDNA testin.
Discussion
Burada açıklanan deneysel protokol Zebra balığı larvalar 3 8 dpf için beyin hücreleri izole etmek için sağlam ve verimli bir yöntemi temsil eder. Önemlisi, bu microglia larva Zebra balığı beyin üzerinden belirli yalıtım sağlayan ilk protokoldür. Protokol hücre zarının bütünlüğü korumak için ve potansiyel değişiklikleri işleme sırasında meydana gelen gen ifadesinin en aza indirmek için tasarlanmıştır. Bu son nokta bu izole hücresel genomik profiller analize dayalı sonuçlar alaka için önemlidir. Gerçekten de, microglia ve makrofaj kutuplaşma kuvvetle etkilemiş onların microenvironment tarafından. 37 ° C'de bu hücreler gen ifade profillerini deneysel koşullar (yaralanma (transeksiyon) yanıt) yanıt olarak değişti ki. Bu nedenle, bu deney hücresel süreçler ve metabolik faaliyetleri yavaşlatmak için RNA ayıklama önce 4 ° C'de gerçekleştirmek için çok önemli. Ayrıca, mekanik beyin doku homojenizasyon 4 ° C'de enzimatik doku sindirim 37 ° C'de yerine gen ifade profilleri üzerinde herhangi bir etkisi önlemek için seçildi.
Bu yöntem çok hızlı olduğunu vurgulamak önemlidir; bir gün içinde birkaç beyin hücre popülasyonlarının en az iki farklı deneysel koşullar ve kendi RNA çıkarılan ayrılmış olabilir. Protokol toplam uzunluğu larva başkanları transeksiyon sınırlayıcı adım (∼ 350 başkanları/h) olduğu gibi her koşul için kullanılabilir larva sayısına bağlıdır. Genel olarak, 3 microglia çalışmak için 5 ve 7 dpf bu ∼ 600 başkanları (Tablo 1) ayıklamak için yeterli RNA almak için test başına transect için tavsiye edilir. Microglia temsil gibi hücre tipi (yaklaşık 7 dpf başında başına 112 hücre) ile en düşük verim, makrofajlar (yaklaşık 7 dpf başında başına 170 hücreleri) dahil olmak üzere diğer hücre tipleri için kafa sayısı azaltılabilir.
Bu iletişim kuralı bir diğer avantajı ayarları FACS sıralayıcıda kurduktan sonra aynı ayarları farklı deneyler için kullanılabilir olduğunu. Hücre popülasyonlarının mükemmel bir deneyden diğerine önceden tasarlanmış, gates ile bu yöntemi kullanarak deneyler tekrarlanabilirlik gösterilen uygun görülmüştür.
Bu yöntemin hafif bir dezavantaj hasat edilir RNA nispeten düşük miktarıdır. Beyin gelişimi (Tablo 1) erken aşamalarında microglia sayısı çok düşük olarak ancak, bu sınırlama daha fazla biyolojik bir teknik sorun daha meselesi. RNA toplanan bu düşük miktar nedeniyle, amplifikasyon adımları genom geniş gen ifade analizi gerçekleştirmek için dikkate alınması gerekir. Neyse ki, amplifikasyon adımları kaliteli cDNA yeterli miktarda üretmek. Böylece, izole hücrelerin gen ifade profillerindeki genel değişiklikleri okudu olabilir.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralını yalıtmak ve çeşitli CNS hücre türlerinden larva Zebra balığı beyin çalışma için sağlam bir yöntem sağlar. Bu hastalık çalışma olarak de geliştirme sırasında bu hücreler daha derin bir anlayış kazanmak için uygulanabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Dr Claire Davis ve Dr Veronique Miron (Kraliçe nin Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Edinburgh, Birleşik Kingdome) ilk yardım ve deneysel ve QMRI Akış Sitometresi ve hücre tesisi sıralama tartışmalar için teşekkür ederim. Bu eser bir kanser araştırma İngiltere'de kariyer kuruluş Ödülü Dr. Dirk Sieger için tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
