Summary
Мы представляем протокол изолировать нейронов, макрофаги и микроглии от личинок данио рерио мозги физиологических и патологических условиях. После изоляции РНК добывается из этих клеток, чтобы проанализировать их профиль выражения гена. Этот протокол позволяет для коллекции РНК высокого качества для выполнения течению анализа, как для ПЦР и transcriptomics.
Abstract
Для получения детального понимания роли различных клеток ЦНС во время разработки или создания и прогрессии патологий мозга, важно изолировать эти клетки без изменения их профиль выражения гена. Данио рерио модель обеспечивает большое количество линий трансгенной рыбы, в которых обозначены конкретные ячейки типы; к примеру нейронов в NBT:DsRed линии или макрофаги/микроглии в строке mpeg1:eGFP. Кроме того, антитела были разработаны пятно конкретных ячеек, например микроглии с 4 c 4 антитела.
Здесь мы описываем изоляция нейронов, макрофаги и микроглии от личинок данио рерио мозги. Центральное место в этот протокол избегания ферментативные ткани пищеварение при 37 ° C, которые могут изменить сотовые профили. Вместо этого используется механическая система гомогенизации ткани на 4 ° С. Этот протокол предусматривает гомогенизации мозги в суспензии клеток, их иммуно окрашивание и изоляция нейронов, макрофаги и микроглии, СУИМ. После этого мы извлечение РНК из этих клеток и оценку их качества/количества. Нам удалось получить РНК высокого качества (номер целостности РНК (Рин) > 7) выполнять ПЦР на макрофагов/Микроглия и нейронов и транскриптомики анализ на микроглии. Этот подход позволяет лучше характеристику этих клеток, а также более четкое представление об их роли в развитии и патологий.
Introduction
Знания о развитии мозга и заболеваний мозга значительно улучшилась в последнее десятилетие с момента первого количественная оценка мыши мозга transcriptomes1. Действительно анализ выражения генома широкий ген дает нам доступ к подробной генетической информации на ткани мозга и клетки, которые могут дополнять и совершенствовать замечания, сделанные с другими методами и средствами.
Данио рерио является мощным биологической модели, легко размножаются и изменить генетически; его оптической прозрачности на личиночных стадиях позволяет жить изображений замечания2. К сожалению, по сравнению с человека и мыши, количество доступных антител для выполнения иммуно окрашивание довольно низка. Чтобы исправить это, данио рерио трансгенных линий рыбы легко сделанное генетического изменения рыбы выразить флуоресцентных белков под ячейки типа конкретных промоутеров. Данио рерио трансгенных линий использовались в прошлом для изучения роли макрофагов и микроглии во время развития центральной нервной системы (ЦНС) и болезни3,4,5,6. Однако чтобы получить глубокое понимание этих процессов мы должны понимать изменения в экспрессии генов в типы соответствующих клеток. С этой целью мы разработали экспериментальный метод специально изолировать клетки как нейроны, макрофаги и микроглии от 3 до 8 дней после оплодотворения (dpf) личинок данио рерио мозги. Для создания протокола мы работали с линиями трансгенной рыбы, которые выражают Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) в макрофагов/микроглии под Макрофаг выразил гена промоутер (mpeg1:eGFP) и DsRed в нейронах под нейронных ß тубулина промоутер (NBT:DsRed)7,8,9. Кроме того мы провели, иммуно окрашивание микроглии, используя 4 c 4, мыши моноклональные антитела, которые специально пятна данио рерио микроглии10,11. Впоследствии рибонуклеиновой кислоты (РНК) добывается из этих клеток для дальнейших количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) или транскриптом анализы. Этот протокол был разработан для эффективно гомогенизировать ткани мозга от данио рерио личинок; собирать нейронов, макрофаги/Микроглия и микроглии без изменения их целостности плазматической мембраны и наконец извлечь РНК из этих клеток в высоком качестве (RIN > 7) и количество для выполнения геномного анализа. В отличие от ранее опубликованных исследований, использующих трипсина лечения при 37 ° C переваривать мозга ткани12,13этот протокол способствует работа при температуре 4 ° C до РНК добыча шаг для уменьшения изменения профиля выражения гена. Этот шаг имеет решающее значение как Микроглия и макрофаги являются весьма чувствительных клеток, которые реагируют на изменения в их микроокружения немедленно, не изменяя их ген выражение профиль и поляризации14,15, 16.
Протокол, подробно здесь, показывает, что изоляция нейронов, макрофаги и микроглии от личинок мозги данио рерио, но практически, это может быть адаптирована к любой другой клетки в течение мозга - либо с помощью линий трансгенной рыбы или помечены специфические антитела. Этот метод позволит лучше характеристик клеток ЦНС через их анализ выражения генома широкий гена и поможет понять их роль во время разработки и заболеваний мозга.
Protocol
1. образец и подготовка СМИ
- Подготовка среды эмбриона (E3) путем растворения 6,4 мм KCl, 0,22 мм NaCl, 0,33 мм CaCl2 2 H2O, 0,33 мм MgSO4 7 H2O H2O.
- Соберите данио рерио эмбрионов сразу же после оплодотворения (0 dpf).
- Разбить zebrafish эмбриона на 50 процентов Петри 90 мм. Поднимите эмбрионов на 28,5 ° C 50 мл эмбриона среды (E3) относились с 200 мкм 1-фенил 2-тиомочевины (ПТУ), в конце первого дня развития (0 dpf) в течение эксперимента, чтобы препятствовать пигментации.
- Изменение E3 + средних ПТУ ежедневно в течение всего эксперимента.
- Экран mpeg1:eGFP и NBT:DsRed личинок на 2 dpf с использованием флуоресцентных стереомикроскопом для выражения позитивные трансген, макрофаги/микроглии GFP+ и DsRed+ нейронов.
- Подготовить все СМИ за день до эксперимента под капотом культуры ткани для предотвращения загрязнения, а затем хранить их при 4 ° C.
- Подготовить СМИ A путем растворения 15 Hepes и 25 мм D-глюкозы в HBSS 1 x.
- Подготовить градиент средней плотности (100%), смешивая 9 томов градиента средней плотности в 1 томе HBSS 10 x.
- Подготовьте градиент средней плотности (22%), разбавляя 22 мл градиент средней плотности (100%) в 88 мл DPBS 1 x.
- Подготовка DPBS 1 x.
- Подготовка среднего E3 + Tricaine путем смешивания E3 среды с 450 мкм Tricaine.
2. гомогенизации
Примечание: Все шаги, выполненные 4 ° C.
- Петри 90 мм, содержащие 50 личинок в 50 мл среды эмбриона E3, относились с 200 мкм ПТУ неизлечимо анестезировать их добавьте 1,5 мл Tricaine (15 мм).
- Сосать до 10 наркотизированных личинок из чашек Петри с 3 мл пипетка Пастера пластиковые оптом.
- Личинки передачи под наркозом 10 на 10 в чашке Петри 55-мм заполнены с ледяной среднего эмбриона E3 + Tricaine.
- Под стереомикроскопом выровняйте 10 личинок в центре Петри. Затем разрез личиночной головы выше желточного мешка, с помощью хирургического микро ножницы (исключить пузырь во избежание плавающей головкой).
- Сосать до головы из чашек Петри с 3 мл пипетка Пастера пластиковые оптом. Подождите, пока все руководители собрались в пределах кончика пипетки и затем перевести их на стекло гомогенизатор, содержащие 1 мл ледяной СМИ A (передачи в минимальный объем для уменьшения СМИ разрежения E3 + Tricaine). Держите стакан гомогенизатор на льду. Используйте один гомогенизатор на экспериментальной условие.
- Заменить каждый маленький Петри, содержащих лед холодной E3 + Tricaine с новой каждые 30 минут, чтобы заверить, что перерезка выполняется в холодной E3 + Tricaine среды.
- Замените ледяной A СМИ в гомогенизатор стекла, когда цвет начинает увядать.
Примечание: Разбавление A СМИ может изменить головы ткани из-за изменения температуры. - После того, как были собраны все головы (600 руководителей/состояние), удалите максимальный объем A СМИ из стекла гомогенизатор и заменить его 1 мл свежего ледяной СМИ а.
- Нарушить ткани мозга с жесткой стекла гомогенизатор на льду. Выполните 40 патронов дробления и поворотов для личинки dpf 3-5 и 50 для 7 и 8 dpf личинки.
- Добавить 2 мл СМИ A суспензию клеток (1 мл раствора A СМИ / 200 головки), что будет разбавить клетки и уменьшить их агломерации с миелина для облегчения их разделение во время центрифугирования в градиент средней плотности.
- Чтобы исключить скопление клеток, запустите суспензию клеток через стрейнер клеток 40 мкм, укладывают поверх холодной 50 мл трубки сокола на льду. Повторите эту операцию 3 раза.
- Передача 1 мл суспензии клеток в холодной 1.5 мл пробирок и спина их на 300 г за 10 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант, используя шприц 10 мл + игла стерильную x 1''.
- Вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл ледяной 22% плотность градиента среднего аккуратно покрыт 0,5 мл ледяной DPBS 1 x (ДУ нельзя смешивать их, межфазные между обоих решений будет видно).
- Спин трубы на 950 g без тормозов и медленное ускорение за 30 мин при 4 ° C.
Примечание: Этот шаг отделяет миелина от других клеток за счет поглощения на межфазных DPBS 1 x и 22% плотности среднего градиента, тогда как клетки будут пеллет в нижней части трубки. Миелиновые удаления является более эффективным, когда концентрация клеток не слишком высока. - С помощью шприц 10 мл + игла стерильную x 1'' отменить максимум DPBS, средний градиент плотности и миелина в ловушке в их интерфазе.
- Вымыть клетки с 0,5 мл СМИ A + 2% нормальной козьего сыворотки (НГС), а затем спин трубы на 300 г за 10 мин при 4 ° C.
- Отбросить максимум супернатанта, затем объединить все ячейки гранулы из же экспериментальные условия, вместе в 1 мл СМИ A + 2% NGS.
- Спин трубы на 950 g без тормозов и медленное ускорение за 30 мин при 4 ° C.
- Если клетки интереса Экспресс флуоресцентный белок как макрофаги/микроглии от mpeg1:eGFP или нейроны от NBT:DsRed трансгенной рыбы (отбор трансгенной рыбы см. 1.1.3), запустите суспензию клеток через стрейнер ячейки 35 мкм кепи и передачи их в 5 мл холодного СУИМ трубы на льду, защищенном от света.
Примечание: Кроме того иммуно окрашивание микроглии может быть выполнена.
3. микроглии иммуно-окрашивание
Примечание: Все действия выполняются при 4 ° C.
- Вновь приостановить клетки лепешка с 0,3 мл СМИ A + 2% NGS. Разделить их в 3 x 1,5 мл пробирок: один для неокрашенных клетки для измерения auto флуоресценции от клетки интереса, второй для вторичного антитела (1/200) для измерения неспецифической привязки вторичные антитела Микроглия и третий как тест (4 c 4 мыши моноклональные антитела (микроглии конкретных) (1/20) + Вторичное антитело (1/200)).
- Добавьте низкий эндотоксинов, азид-бесплатно (лист) на 1% до клеток (все трубы) блокировать CD16/CD32 взаимодействия с доменом ФК иммуноглобулинов. Инкубируйте клетки для 10 мин с мягким перемешиванием каждые 5 мин.
- Добавьте 4 c 4 антитела (1/20) клетки (труба 3) и Инкубируйте 30 мин с мягким перемешиванием каждые 10 мин.
- Спин трубы на 300 г за 10 мин при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант.
- Мыть после с 0,5 мл СМИ A + 2% NGS, затем спин трубы на 300 г за 10 мин при 4 ° C.
- Вновь приостановить Пелле клеток с 0,5 мл СМИ A + 2% NGS и инкубации клеток с листьев на 1% за 10 мин с мягким перемешиванием каждые 5 мин.
- Добавьте вторичные антитела (1/200) клетки (метро 2 и 3). Инкубируйте клетки для 30 мин с мягким перемешиванием каждые 10 мин и легкие защиты.
- Спин трубы на 300 г за 10 мин при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант.
- Мыть дважды с 0,5 мл с 1 мл раствора A СМИ + 2% СМИ A + 2% NGS, а затем вновь приостановить клеток Пелле NGS.
- Запустите суспензию клеток через 35 мкм клеток ситечко шапку и перенести их в холодной 5 мл СУИМ трубы на льду, защищенном от света.
4. клетки, сортируя (FACS)
Примечание: Выполните все шаги при 4 ° C.
- Сортировать нейронов, макрофаги/Микроглия и микроглии Использование СУИМ.
Примечание: Этот шаг обычно выполняется сотрудником Фонда СУИМ и параметры зависят от типа используемого оборудования.- Добавление DAPI в концентрации 1 мкг/мл в пробирки СУИМ маркировать мертвые клетки.
- Настройка СУИМ и сортировки нейронов, макрофаги/микроглии или микроглии от всех клеток головного мозга. Отдельные клетки от мусора в зависимости от их размера и детализации, а затем ворота сингл клетки вперед разброс и разброс стороне. Исключить мертвые клетки, DAPI маркировки из живых клеток. Идентифицировать нейронов, макрофаги/микроглии или микроглии их соответствующих положительный пятнать.
- Собрать клетки в 1,5 мл пробирки, содержащие 1 мл ледяной СМИ A + 2% NGS на льду. Используйте различные трубы для каждого типа клеток.
- Спин трубы на 300 г за 10 мин при температуре 4 ° C и затем удалить супернатант.
- Мыть после с 0,5 мл СМИ затем отменить максимум супернатант.
5. РНК добыча
- Извлечь РНК из различных типов клеток разделенных СУИМ. Для извлечения РНК использовать конкретный набор и следуйте рекомендациям изготовителя. Обеспечить, чтобы работать в среде свободного РНКазы очистки рабочей области и пипетки с продуктом РНКазы обеззараживания и использовать фильтр советы.
- Свеже готовим 1 мл буфера lysis дополнена 50 мкм β-меркаптоэтанол.
Примечание: Здесь β-меркаптоэтанол добавляется для уменьшения деградации РНК. - Подготовьте 70% и 80% этанола раствор с помощью РНКазы свободной воды.
- Лизируйте клетки с 75 мкл буфера lysis дополнена 50 мкм β-меркаптоэтанол. Затем используйте измельчитель для улучшения разрушения клеток.
- Продолжайте извлечение RNA согласно данным производителя руководство пользователя.
- В конце протокола элюировать РНК с 14 мкл РНКазы свободной воды для получения достаточной концентрации РНК.
- Свеже готовим 1 мл буфера lysis дополнена 50 мкм β-меркаптоэтанол.
Representative Results
Описывается протокол является простой подход к изоляции нейронов, макрофаги и микроглии от данио рерио личиночной мозги. От этих изолированных клеток, значительное количество высокого качества (RIN > 7) РНК были извлечены. Целью настоящего Протокола является изолировать различные типы клеток от ЦНС, с минимальными изменениями их профиля выражение гена для анализа и характеризуют свойства ячейки и функций. Таким образом весь протокол выполняется на 4 ° C с гомогенизацией тканей механические мозга. Этот метод успешно используется для двух исследований, выполненных в лаборатории. В первом исследовании нейроны и макрофагов/микроглии были изолированы от 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ личинок (рис. 1). СУИМ позволило разделения клеток от мусора в зависимости от их размера (FSC-A) и детализации (SSC-A) (рис. 1А). Затем отдельные клетки были отделены от Дуплеты или агломератов клеток (рис. 1Б). От одноклеточного населения ворот было обращено устранить мертвые клетки (DAPI+). Соответствующий участок точка показали, что этот экспериментальный протокол сохраняет целостность плазматической мембраны клеток, как мертвые клетки составляет лишь 26,7% (рис. 1C). Наконец нейронов (DsRed+) и макрофагов/микроглии (GFP+) были легко отделены от ворот населения живой клетки. Нейрон населения (23,1%), как представляется, будет более заметным, чем макрофагов/микроглии населения (1,56%) в головном мозге (рис. 1D). Этот протокол позволяет изолировать РНК из этих клеток для выполнения последующих ПЦР анализа для сравнения выражение специфических генов между нейронами и макрофагов/микроглии. Рисунок 2 показывает нейронов и макрофагов/микроглии уровни выражения гена пролиферирующих клеток ядерного антигена (pcna)против дом поддержанию гена β-актина как пример.
Во втором исследовании этот метод уделялось микроглии изоляции от 3, 5 и 7 dpf личиночной мозги. В отличие от описанных выше эксперимент, клетки были изолированы иммуно окрашивание с помощью 4 c 4, антитело которое специально этикетки микроглии (рис. 3 А-D). Как описано ранее, микроглии (4 c 4+) были отобраны из живых клеток и собранных (рис. 3D). Микроглии чисел в пределах данио рерио личиночной мозги являются переменными (Таблица 1) и очень низкой на 3 dpf (∼ 25 за рыбы). Качество и количество извлеченных РНК из этих клеток были измерены с помощью микро капиллярного электрофореза на базе системы. Результаты, полученные извлеченные РНК от микроглии 5 dpf личиночной данио рерио мозги были предоставлены для иллюстрации примера анализа РНК (Таблица 1 (5 dpf; эксперимент 4)). Рисунок 4 показывает электрофорез трассировки и его графическое изображение, полученные для этого образца с четкой визуализации рибосомная РНК (28s и 18s). Эти данные необходимо вычислить образца Рин и определения концентрации РНК. В таблице 1 приводятся число изолированных микроглии рыбы, сумма микроглии РНК и Рин баллах, полученных для каждой другой эксперимент на 3, 5 и 7 dpf. Объем и качество извлеченные РНК от изолированных микроглии, с помощью этого метода позволило нам усилить РНК в cDNA, с использованием комплекта. Качество и количество тестов, предоставляемый Эдинбург геномики подтверждают, что усиленный cDNA является достаточным качеством для библиотеки подготовки и последующего последовательности. Рисунок 5 показывает распределение размера фрагментов кДНК и их количество, измеряется с помощью электрофореза системы. В этом образце cDNA имели средний размер 299bp в концентрации 36100 пмоль/л. Таблица 2 показывает, соответственно, качество и количество испытаний, проведенных на усиленные cDNA от образцов РНК (Таблица 1 (5 dpf; эксперимент 4)). Усиленные cDNA успешно использовался для виртуализации.
Несколько исследований, выполненных в лаборатории подтвердили, что качество и количество извлеченных РНК из нейронов, макрофаги и микроглии может использоваться для последующих ПЦР и анализа выражения генома широкий гена. Таким образом этот экспериментальный протокол может использоваться надежно изолировать различные типы клеток ЦНС без изменения их целостности мембраны и ограничения изменения их профиля выражения гена.
Рисунок 1 : СУИМ, сортировка для нейронов и макрофагов/микроглии от /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ 8 личинок данио рерио dpf. (A-C) Последовательных стробирования показывает последовательный выбор клеток из всех мозга (A), отдельные клетки вперед разброс и стороне точечная (B). (C) мертвые клетки были исключены, DAPI маркировки. (D) нейронов и макрофагов/микроглии были определены соответственно DsRed и GFP положительный пятнать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Анализ выражения гена pcna и β-актина нейронов и макрофагов/микроглии. РНК из отдельных нейронов и макрофагов/микроглии может быть транскрибированы в cDNA для использования в количественной ПЦР анализа. уровни mRNA выражение pcna против гена β-актина домоустройства в изолированных нейронов и макрофагов/микроглии определяется ПЦР (N = 3). Раз изменений была измерена с помощью метода сравнительной (ΔΔCT). Ошибка бар представляют собой среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : СУИМ сортировки для микроглии от 3 Личинки данио рерио dpf. (A-C) Последовательных стробирования Показать все мозга последовательный выбор клеток (A), отдельные клетки вперед разброс и стороне точечная (B). (C) мертвые клетки были исключены, DAPI маркировки. (D) микроглии были определены 4 c 4 положительный пятнать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Микро капиллярного электрофореза результаты извлеченные РНК от 5 dpf данио рерио микроглии. Две высокие вершины являются 18S и 28S рибосомной РНК. РНК целостности номер (Рин) был автоматически вычисляется bioanalyzer программного обеспечения, используя сгенерированный соотношение 18S и 28S рибосомальной подразделения и анализ всей электрофоретической трассировки. Микроглии РНК имеет 8.6 Рин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Количество и качество испытания усиливается cDNA от РНК образец 5 dpf данио рерио микроглии. Изображение показывает распределение размер фрагмента кДНК анализируемого образца с средним размером 299 bp. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Состояние | Эксперимент | Количество рыбы | Мобильный номер | Число ячеек на рыб | Концентрация РНК (pg/ul) | Общая РНК (pg) | Сумма РНК в клетки (pg) | Оценка по Рин |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0,13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0,13 | 7.9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31.15 | 255 | 3060 | 0.16 | 7.7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18.54 | 189 | 2268 | 0,20 | 7.8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0.10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0.26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97.72 | 362 | 4344 | 0,07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0,13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0,09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0,07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74,95 | 134 | 1608 | 0,04 | 7.6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0,04 | 7.9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0,06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0,07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99,87 | 245 | 2940 | 0,08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0,06 | 7.8 |
Таблица 1: Резюме микроглии изоляции и РНК добыча данных от 3, 5 и 7 dpf данио рерио личинки.
| Внутренний идентификатор образца | Внешний идентификатор образца | Кубит (нг/ul) | Qubit(NG/UL) | Средняя концентрация (нг/ul) | Объем (ul) | UG получил | Успешность для минимальной концентрации | Успешность minimim количества | Успешность рекомендуемое количество |
| 10907SD0010 | 5 dpf (эксперимент 4) | 58,8 | 58,4 | 58,6 | 30 | 1.76 | Перевал | Перевал | Перевал |
| Требования к образцам для библиотеки Prep: | |||||||||
| Библиотека Prep | Минимальное количество (НГ) | Рекомендуемое количество (НГ) | Минимальная концентрация нг/uL | ||||||
| TruSeq Nano гель бесплатно 350 bp Вставка библиотеки от cDNA | 600 | 1100 | 10 | ||||||
Таблица 2: Количество испытаний усиливается cDNA от РНК образец 5 dpf данио рерио микроглии.
Discussion
Экспериментальный протокол, описанные здесь представляет собой надежный и эффективный метод, чтобы изолировать клетки мозга от данио рерио личинок от 3 до 8 dpf. Важно отметить, что это первый протокол, который позволяет конкретных изоляции микроглии от личинок данио рерио мозги. Протокол предназначен для сохранения целостности клеточной мембраны и свести к минимуму потенциальные изменения экспрессии генов, происходящих во время обработки. Этот последний пункт имеет решающее значение для актуальности результатов, основанных на анализе тех изолированных клеточных геномной профилей. Действительно Микроглия и макрофагов поляризации сильно зависит от их микроокружения. При 37 ° C эти клетки изменили бы их профиль выражение гена в ответ на экспериментальных условий (травмы (перерезка) ответ). Таким образом важно выполнять этот эксперимент на 4 ° C до РНК добыча, чтобы замедлить клеточные процессы и метаболических деятельности. Кроме того чтобы избежать любого воздействия на профили выражение гена вместо ферментативные ткани пищеварение при 37 ° C был выбран гомогенизации ткани мозга механические на 4 ° C.
Важно подчеркнуть, что этот метод является очень быстро; в течение дня несколько популяции клеток мозга могут быть изолированы от по крайней мере два различных экспериментальных условий и их РНК извлечены. Общая длина протокола зависит количество личинок, используемых для каждого условия как перерезка личиночной главы является ограничивающим шаг (∼ 350 руководителей/ч). В общем чтобы работать с микроглии от 3, 5 и 7 dpf рекомендуется трансектных ∼ 600 голов в тест, чтобы получить достаточно РНК для извлечения (Таблица 1). Микроглии представляют тип ячейки с самой низкой урожайности (около 112 клетки на душу на 7 dpf), количество головок может быть уменьшена для других типов клеток, включая макрофагов (около 170 клетки на душу на 7 dpf).
Еще одним преимуществом этого протокола является, что после того, как были установлены параметры в сортировщике СУИМ, же параметры могут использоваться для различных экспериментов. Было отмечено, что клеточных популяций идеально подходят от одного эксперимента на другой с воротами ранее разработанный, показаны воспроизводимость экспериментов с использованием этого метода.
Небольшой недостаток этого метода является относительно низкий объем РНК, которые собирают. Однако это ограничение является больше вопросом биологического чем технический вопрос, как количество микроглии является очень низким на ранних стадиях развития мозга (Таблица 1). Из-за этой низкой количество собранных РНК усиление шаги должны рассматриваться для выполнения анализа выражения генома широкий гена. К счастью эти шаги усиления производить достаточное количество cDNA высокого качества. Таким образом глобальные изменения в профилях выражение гена изолированных клеток могут быть изучены.
В заключение этот протокол обеспечивает надежный метод, чтобы изолировать и изучить различные типы клеток ЦНС от личинок данио рерио мозги. Это может быть применен к получить более глубокое понимание этих клеток во время разработки, а также изучить их роль в болезни.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Дэвис Клэр и доктор Вероник Мирон (королевы медицинский научно-исследовательский институт, Эдинбург, Соединенное Kingdome) для первоначального справки и обсуждения на экспериментальный подход и QMRI поток цитометрии ячейку Сортировка объекта. Эта работа была поддержана рак исследований Великобритании карьеры учреждение премии для д-р Дирк Sieger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
