Summary
We presenteren een protocol om te isoleren van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Op isolatie, wordt RNA gewonnen uit deze cellen te analyseren hun genexpressie profiel. Dit protocol voorziet voor de verzameling van kwalitatief hoogwaardige RNA downstream analyse zoals qPCR en transcriptomics uitvoeren.
Abstract
Om te krijgen een gedetailleerd inzicht in de rol van verschillende CNS cellen tijdens de ontwikkeling of de totstandbrenging en de progressie van aandoeningen van de hersenen, is het belangrijk om te isoleren van deze cellen zonder hun genexpressie profiel. De zebravis model biedt een groot aantal transgene vis lijnen waarin specifieke celtypes worden geëtiketteerd; bijvoorbeeld neuronen in de lijn van de NBT:DsRed of de macrofagen/microglia in de mpeg1:eGFP-lijn. Bovendien antilichamen zijn ontwikkeld om vlekken van specifieke cellen, zoals microglia met de 4C 4 antilichaam.
Hier beschrijven we de isolatie van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen. Centraal bij dit protocol is het vermijden van een enzymatische weefsel spijsvertering bij 37 ° C, die cellulaire profielen kunnen wijzigen. In plaats daarvan wordt een mechanisch systeem van weefsel homogenisering bij 4 ° C gebruikt. Dit protocol betekent homogenisering van de hersenen in celsuspensie, hun immuno-kleuring en het isolement van neuronen, macrofagen en microglia door FACS. Daarna, we RNA onttrokken die cellen en hun kwaliteit/kwantiteit geëvalueerd. We kunnen verkrijgen van RNA van hoge kwaliteit (RNA Integrity nummer (RIN) > 7) voor het uitvoeren van qPCR op de analyse van de macrofagen/microglia en neuronen and transcriptomic op microglia. Deze aanpak maakt het mogelijk een betere karakterisering van deze cellen, evenals een duidelijker begrip over hun rol in de ontwikkeling en pathologieën.
Introduction
Kennis over de ontwikkeling van de hersenen en hersenziekten is aanzienlijk verbeterd in de afgelopen tien jaar sinds de eerste kwantificering van transcriptomes1van de hersenen van de muis. Inderdaad, genoomanalyse breed gen expressie geeft ons toegang tot gedetailleerde genetische informatie over hersenweefsel en cellen die kunnen aanvullen en verbeteren van de opmerkingen die zijn gemaakt met andere technieken en hulpmiddelen.
De zebravis is een krachtige biologische model, gemakkelijk te kweken en te wijzigen genetisch; de optische transparantie larvale stadia kunt levende imaging opmerkingen2. Helaas, in vergelijking tot menselijke en muis, het aantal beschikbare antilichamen voor het uitvoeren van immuno-kleuring is vrij laag. Om dit te verhelpen, zijn transgene zebrafish vis lijnen gemakkelijk gemaakt door genetisch wijzigen vis uitspreken fluorescente proteïnen onder cel type specifieke initiatiefnemers. Transgene zebrafish lijnen zijn gebruikt in het verleden te bestuderen van de rol van macrofagen en microglia tijdens de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel (CNS) en ziekte3,,4,,5,6. We moeten echter om een gedetailleerde inzicht van deze processen te begrijpen wijzigingen in genexpressie in de respectieve celtypes. Voor dit doel, ontwikkelden we een experimentele methode om specifiek isoleren cellen zoals neuronen, macrofagen en microglia van 3 tot 8 dagen na bevruchting (dpf) larval zebrafish hersenen. Voor de vaststelling van het protocol werkten we met transgene vis lijnen die uitdrukking geven aan groen fluorescente proteïne (GFP) in macrofagen/microglia onder de macrofaag-uitgedrukt gene promotor (mpeg1:eGFP) en DsRed in de neuronen onder de neurale ß-tubuline promotor (NBT:DsRed)7,8,9. Bovendien hebben we uitgevoerd immuno-kleuring van microglia met behulp van 4C 4, een muis monoklonaal antilichaam dat specifiek zebrafish microglia10,11 vlekken. Daarna, RNA acid (RNA) wordt gewonnen uit deze cellen voor verdere kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) of transcriptome analyses. Dit protocol is ontworpen om efficiënt Meng hersenweefsel van zebravis larven; verzamelen van neuronen, macrofagen/microglia en microglia zonder wijziging van hun integriteit plasmamembraan en ten slotte RNA te extraheren uit deze cellen in hoge kwaliteit (RIN > 7) en de hoeveelheid aan de genomic analyses uit te voeren. In tegenstelling tot de eerder gepubliceerde studies die gebruik van tripsine behandeling bij 37 ° C te verteren hersenen weefsel12,13, bevordert dit protocol werk bij 4 ° C tot de RNA extractie stap om wijzigingen van de genexpressie profiel. Deze stap is cruciaal als microglia en macrofagen zijn uiterst gevoelige cellen die op veranderingen in hun communicatie onmiddellijk reageren door een wijziging van hun gen expressie profiel en polarisatie14,15, 16.
Het protocol beschreven hier in detail toont die het isolement van neuronen, macrofagen en microglia uit zebrafish larvale hersenen, maar praktisch, het kan worden aangepast naar een andere cel presenteren binnen de hersenen - hetzij door het gebruik van transgene vis lijnen of geëtiketteerd met specifieke antilichamen. Deze methode zal toelaten een betere karakterisering van CNS cellen via hun genoom-brede gen expressie-analyses en zal helpen om te begrijpen hun rol tijdens het ontwikkelen en hersenziekten.
Protocol
1. steekproef en voorbereiding van de Media
- Bereiden van embryo medium (E3) door het oplossen van 6,4 mM KCl 0,22 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2 2 H2O, 0.33 mM MgSO4 7 H2O in H2O.
- Verzamelen zebrafish embryo's onmiddellijk na de bevruchting (0 dpf).
- Zebravis embryo's gesplitst 50 per 90 mm petrischaal. Verhogen van embryo's bij 28,5 ° C in 50 mL embryo voedingsbodem (E3) behandeld met 200 µM 1-fenyl-2-thioureum (FTU), vanaf het einde van de eerste dag van ontwikkeling (0 dpf) voor de duur van het experiment voor de remming van de pigmentatie.
- Verandering de E3 + FTU medium dagelijks voor de duur van het experiment.
- Scherm mpeg1:eGFP en NBT:DsRed larven op 2 dpf met behulp van een TL stereomicroscoop voor positieve transgenic expressie, macrofagen/microglia GFP+ DsRed+ neuronen.
- Bereiden alle media de dag voordat het experiment onder de motorkap van een weefselkweek om verontreiniging te vermijden, dan bewaren bij 4 ° C.
- Bereiden van media A door het oplossen van 15 mM Hepes en 25 mM D-Glucose in HBSS 1 x.
- Bereid de kleurovergang medium dichtheid (100%) door het mengen van 9 volumes van het medium dichtheid kleurovergang in 1 deel HBSS 10 x.
- Voorbereiden van het dichtheid kleurovergang medium (22%) door verder verdunnen van 22 mL van de kleurovergang medium dichtheid (100%) in 88 mL DPBS 1 x.
- Bereiden van DPBS 1 x.
- Bereid E3 medium + tricaïne door het mengen van E3 medium met 450 μM tricaïne.
2. de homogenisering
Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd 4 ° C.
- 1,5 mL tricaïne (15 mM) aan 90 mm petrischalen met 50 larven in 50 mL E3 embryo voedingsbodem behandeld met 200 µM FTU aan terminaal anesthetize hen toevoegen.
- 10 narcose larven uit de petrischaaltjes met een 3 mL Pipet van Pasteur kunststof bulk opzuigen.
- Overdracht verdoofd larven 10 van de 10 in een petrischaal 55-mm gevuld met ijskoude E3 embryo medium + tricaïne.
- Uitlijnen onder een stereomicroscoop, 10 larven in het midden van de petrischaal. Vervolgens transect larvale hoofd boven de dooierzak met behulp van chirurgische micro-schaar (uitsluiten zwemblaas Voorkom hoofden zweven).
- Hoofden van de petrischaaltjes met een 3 mL Pipet van Pasteur kunststof bulk opzuigen. Wacht tot alle hoofden binnen het uiteinde van de pipet verzamelen en breng ze in een glazen homogenizer met 1 mL ijskoud Media A (transfer in een minimale volume voor het verminderen van de Media een verdunning door E3 + tricaïne). Houd het glas-homogenizer op het ijs. Gebruik één homogenizer per experimentele voorwaarde.
- Vervang elke kleine petrischaal met ijs koud E3 + tricaïne met een nieuwe elke 30 minuten om te verzekeren dat transect wordt uitgevoerd in koude E3 + tricaïne medium.
- Vervang de ijskoude Media A in het glas-homogenizer zodra de kleur vervagen.
Opmerking: Media A verdunning kan veranderen het hoofd weefsel als gevolg van temperatuurveranderingen. - Zodra alle hoofden zijn verzameld (600 hoofden/voorwaarde), het maximale volume van Media A verwijderen met de glas homogenizer en te vervangen door 1 mL verse ijskoude Media A.
- Het verstoren van het hersenweefsel met een strakke glas homogenizer op ijs. 40 ronden van breken en bochten voor 3-5 dpf larven en 50 voor 7 en 8 dpf larven uitvoeren.
- Voeg 2 mL van Media A tot celsuspensie (1 mL Media A / 200 hoofden), die zal verdund cellen en hun agglomeratie met myeline ter vergemakkelijking van hun scheiding tijdens het centrifugeren in de kleurovergang medium dichtheid te verminderen.
- Om te elimineren cel agglomeratie, de celsuspensie worden uitgevoerd door een zeef van 40 µm cel geplaatst op de top van een koude 50 mL falcon buis gehandhaafd op het ijs. Herhaal deze bewerking 3 keer.
- Pipetteer 1 mL celsuspensie in koude 1,5 mL buizen en draaien ze bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een 10 mL spuit + naald 23G x 1''.
- Resuspendeer de pellet cel met 1 mL van ijskoude 22% dichtheid kleurovergang medium zachtjes bedekt door 0,5 mL ijskoud DPBS 1 x (do niet mix hen, een interfase tussen beide oplossingen zal worden gezien).
- Spin buizen op 950 g zonder rem en langzame versnelling gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
Opmerking: Deze stap scheidt myeline uit andere cellen door het vastleggen op de interfase van DPBS 1 x en 22% dichtheid kleurovergang medium, overwegende dat cellen aan de onderkant van de buis pellet zal. Verwijdering van de myeline is efficiënter als cel concentratie niet te hoog is. - Met behulp van een 10 mL spuit + naald 23G x 1'' negeren het maximum van DPBS, de kleurovergang medium dichtheid en myeline gevangen op hun interfase.
- Cellen met 0,5 mL van Media A + 2% van de normale geit serum (NGS) wassen, dan draaien buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Het maximum van de bovendrijvende vloeistof verwijderen, dan bundelen alle pellets van de cel van de dezelfde experimentele conditie samen in 1 mL van Media A + 2% NGS.
- Spin buizen op 950 g zonder rem en langzame versnelling gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Als de cellen van belang express een fluorescente proteïne zoals macrofagen/microglia van mpeg1:eGFP of neuronen van NBT:DsRed transgene vis (screening van transgene vis zie 1.1.3), de celsuspensie doorlopen een 35 µm cel zeef cap en overbrengen in een koude 5 mL FACS buizen op ijs, beschermd tegen licht.
Opmerking: Als alternatief, immuno-kleuring van microglia kan worden uitgevoerd.
3. Microglia Immuno-kleuring
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet cel met 0.3 mL Media A + 2% NGS. Opgesplitst in 3 x 1,5 mL buizen: één voor onbevlekt cellen op maat auto-fluorescentie uit cellen van belang, ten tweede voor het secundaire antilichaam (1/200) voor het meten van de niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam microglia en derde als een test (4C 4 muis monoclonal antilichaam (microglia specifieke) (1/20) + secundair antilichaam (1/200)).
- Toevoegen lage endotoxinen, Azide-Free (blad) bij 1% naar cellen (alle buizen) te blokkeren CD16/CD32 interacties met het Fc-domein van immunoglobulinen. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten met zachte agitatie elke 5 min.
- Toevoegen van de 4C 4 antilichaam (1/20) naar cellen (buis 3) en incubeer gedurende 30 min met zachte agitatie elke 10 min.
- Spin buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, en vervolgens de vloeistof wordt weggeworpen.
- Wassen zodra met 0,5 mL van Media A + 2% NGS, draai vervolgens buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer cel pellet met 0,5 ml van Media A + 2% NGS en Incubeer de cellen met blad op 1% voor 10 min met zachte agitatie elke 5 min.
- Secundair antilichaam (1/200) aan cellen (buis 2 en 3) toevoegen. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten met zachte agitatie elke 10 min en lichte bescherming.
- Spin buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, dan wordt weggeworpen.
- Wassen tweemaal met 0,5 mL Media A + 2% NGS en resuspendeer cel pellet met 1 mL Media A + 2% NGS.
- Celsuspensie doorlopen een 35 µm cel zeef cap en ze vervolgens overbrengen naar koude 5 mL FACS buizen op ijs, beschermd tegen licht.
4. cell Sorting (FACS)
Opmerking: Voer alle stappen uit bij 4 ° C.
- Sorteren van neuronen, macrofagen/microglia en microglia met behulp van een FACS.
Opmerking: Deze stap wordt doorgaans uitgevoerd door een personeelslid van de FACS faciliteit en instellingen is afhankelijk van de gebruikte soort apparatuur.- DAPI op een concentratie van 1 µg/mL in elke buis FACS label dode cellen toevoegen.
- FACS en sorteren neuronen, macrofagen/microglia of instellen microglia uit alle hersencellen. Afzonderlijke cellen uit puin in functie van hun grootte en granulariteit, dan poort single-cellen door voorwaartse scatter en kant scatter. Dode cellen van de DAPI etikettering van levende cellen uitsluiten. Neuronen, macrofagen/microglia of microglia identificeren door hun respectieve positieve kleuring.
- Verzamelen van cellen in 1,5 mL buisjes met 1 mL ijskoud Media A + 2% NGS op ijs. Gebruik verschillende buizen voor elk celtype.
- Spin buizen bij 300 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en vervolgens wordt de weggeworpen.
- Wassen zodra met 0,5 mL van Media een dan het maximum van de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
5. RNA extractie
- Het uittreksel van RNA van de verschillende soorten cellen gescheiden door FACS. Gebruik een specifieke kit voor RNA extractie en volg de richtlijnen van de fabrikant. Zorg ervoor om te werken in een omgeving RNase gratis door schoonmaak werkruimte en pipetten met een product van de decontaminatie RNase filter geboden tips te gebruiken.
- Vers bereiden 1 mL lysis-buffermengsel aangevuld met 50 µM β-mercaptoethanol.
Opmerking: Hier, wordt β-mercaptoethanol toegevoegd aan het verminderen van de aantasting van het RNA. - Bereiden van 70% en 80% ethanol oplossing met behulp van RNase gratis water.
- Lyse cellen met 75 µL van lysis buffer aangevuld met 50 µM β-mercaptoethanol. Gebruik vervolgens een shredder om verstoring van de cel.
- Blijven RNA extractie volgens fabrikant handleiding.
- Aan het eind van het protocol, elueer de RNA met 14 µL van RNase gratis water om te verkrijgen van een concentratie van RNA.
- Vers bereiden 1 mL lysis-buffermengsel aangevuld met 50 µM β-mercaptoethanol.
Representative Results
Het beschreven protocol is een eenvoudige aanpak om neuronen, macrofagen en microglia van zebravis larvale hersenen te isoleren. Uit deze geïsoleerde cellen, aanzienlijke bedragen van hoge kwaliteit (RIN > 7) RNA werden gehaald. Het doel van dit protocol is te isoleren van de verschillende types van cellen van de CNS, met minimale wijziging van hun genexpressie profiel te analyseren en te karakteriseren Celeigenschappen en functies. Het gehele protocol wordt daarom uitgevoerd bij 4 ° C met een mechanische hersenen weefsel homogenisering. Deze methode is met succes gebruikt voor twee studies uitgevoerd in het laboratorium. In de eerste studie waren neuronen en macrofagen/microglia geïsoleerd uit 8 dpf mpeg1:eGFP+-/NBT:DsRed+ larven (Figuur 1). FACS toegestaan cel scheiding van puin in functie van hun grootte (FSC-A) en granulariteit(WS-A) (Figuur 1). Afzonderlijke cellen werden vervolgens gescheiden van paren of cel agglomeraat (Figuur 1B). Van de bevolking van eencellige, was een hek getrokken om te elimineren dode cellen (DAPI+). De overeenkomstige dot plot bleek dat dit experimentele protocol cel plasma membraan integriteit behoudt, zoals het aantal dode cellen slechts 26,7% (Figuur 1C is). Ten slotte waren neuronen (DsRed+) en macrofagen/microglia (GFP+) gemakkelijk gescheiden van de levende cel bevolking gates. De neuron-bevolking (23,1%) bleek opvallender dan de bevolking van de macrofagen/microglia (1,56%) in de hersenen (Figuur 1D). Dit protocol heeft toegestaan om te isoleren van RNA van die cellen voor het uitvoeren van latere qPCR analyses om te vergelijken van de expressie van specifieke genen tussen neuronen en macrofagen/microglia. Figuur 2 toont neuronale en macrofagen/microglia gen expressie niveaus van delende cel nucleair antigeen (pcna)tegen het gen van de house-keeping β-actine als voorbeeld.
Voor de tweede studie is deze methode gericht op microglia isolatie van 3, 5 en 7 dpf larvale hersenen. In tegenstelling tot het hierboven beschreven experiment cellen werden geïsoleerd door immuno-kleuring met behulp van 4C 4, een antilichaam dat specifiek microglia (Figuur 3 A-D etiketten). Zoals eerder beschreven, microglia (4C 4+) werden uit levende cellen geselecteerd en verzameld (Figuur 3D). Microglia nummers binnen zebrafish larvale hersenen zijn variabele (tabel 1), en zeer laag op 3 dpf (∼ 25 per vis). Kwaliteit en kwantiteit van uitgepakte RNA van die cellen werden gemeten met behulp van een micro-capillaire elektroforese gebaseerd systeem. Resultaten van uitgepakte RNA van microglia van 5 dpf larvale zebrafish hersenen antigeenpreparaten werden ter illustratie een voorbeeld van RNA analyse (tabel 1 (5 dpf; experiment 4)). Figuur 4 toont de Elektroforese van het spoor en de grafische weergave voor dit voorbeeld met een duidelijke visualisatie van ribosomaal RNA (28s en 18s) verkregen. Deze gegevens zijn nodig voor de berekening van de steekproef RIN en om te bepalen van de concentratie van RNA. Tabel 1 geeft een overzicht van het aantal geïsoleerde microglia per vis, het bedrag van RNA per microglia en de score van de RIN verkregen voor elke verschillende experiment op 3, 5 en 7 dpf. Het bedrag en de kwaliteit van de uitgepakte RNA van geïsoleerde microglia met behulp van deze methode konden we versterken de RNA in cDNA met behulp van een kit. Kwaliteit en kwantiteit van de bedoelde door Edinburgh Genomics tests bevestigen dat de versterkte cDNA van voldoende kwaliteit voor de voorbereiding van de bibliotheek en de daaropvolgende sequencing is. Figuur 5 toont de grootteverdeling van cDNA fragmenten en hun bedrag gemeten met behulp van een elektroforetisch systeem. In dit voorbeeld wordt de cDNA had een gemiddelde omvang van 299bp bij een concentratie van 36100 pmol/l. tabel 2 ziet u respectievelijk kwaliteit en kwantiteit werden uitgevoerd op versterkte cDNA van RNA monsters (tabel 1 (5 dpf; experiment 4)). De versterkte cDNA is met succes gebruikt voor het rangschikken.
Verschillende studies uitgevoerd in het laboratorium bevestigd dat de kwaliteit en de kwantiteit van uitgepakte RNA van neuronen, macrofagen en microglia kunnen worden gebruikt voor verdere qPCR en genoom breed gen expressie analyses. Daarom kan dit experimentele protocol betrouwbaar verschillende soorten CNS cellen isoleren zonder wijziging van hun membraan integriteit en beperking van de wijziging van hun genexpressie profiel worden gebruikt.
Figuur 1 : FACS sorteren voor neuronen en macrofagen/microglia uit mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf zebrafish larven. (A-C) Opeenvolgende gating toont opeenvolgende selectie van alle hersenen cellen (A), afzonderlijke cellen door voorwaartse spreidings- en kant verstrooien (B). (C) dode cellen werden uitgesloten door de DAPI etikettering. (D) neuronen en macrofagen/microglia werden geïdentificeerd respectievelijk door DsRed en GFP positieve kleuring. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Gen expressie analyse voor pcna en β-actine in neuronen en macrofagen/microglia. RNA van geïsoleerde neuronen en macrofagen/microglia kan worden omgezet in cDNA voor gebruik in kwantitatieve PCR analyse. mRNA niveaus van de expressie van pcna tegen β-actine house-keeping gen in geïsoleerde neuronen en macrofagen/microglia bepaald door qPCR (N = 3). Vouw verandering werd gemeten met behulp van de methode vergelijkende (ΔΔCT). Fout bar vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : FACS sorteren voor microglia uit 3 dpf zebrafish larven. (A-C) Opeenvolgende gating Toon opeenvolgende selectie van alle hersenen cellen (A), afzonderlijke cellen door voorwaartse spreidings- en kant verstrooien (B). (C) dode cellen werden uitgesloten door de DAPI etikettering. (D) Microglia werden geïdentificeerd door 4C 4 positieve kleuring. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Micro-capillaire elektroforese resultaten van uitgepakte RNA van 5 dpf zebrafish microglia. De twee hoge toppen zijn de 18S en 28 ribosomal RNA. RNA integrity nummer (RIN) werd automatisch berekend door de software van de bioanalyzer met behulp van de gegenereerde verhouding van het 18S en 28 ribosomal subeenheden en de analyse van het hele elektroforetische spoor. Microglia RNA heeft een 8.6 RIN. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Proeven van de kwaliteit en kwantiteit van versterkte cDNA van RNA steekproef van 5 dpf zebrafish microglia. De afbeelding toont de fragment-grootteverdeling van cDNA van het geanalyseerde monster met een gemiddelde omvang van 299 bp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Voorwaarde | Experiment | Vis-nummer | Mobiele nummer | Aantal cellen per vis | RNA concentratie (pg/ul) | Totaal RNA (pg) | RNA bedrag per cel (pg) | RIN score |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0.13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0.13 | 7,9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31.15 | 255 | 3060 | 0.16 | 7.7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18.54 | 189 | 2268 | 0.20 | 7,8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0.10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0.26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97,72 | 362 | 4344 | 0,07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0.13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0.09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0,07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74.95 | 134 | 1608 | 0.04 | 7.6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0.04 | 7,9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0.04 | 7.6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0.04 | 7,8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0,06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0,07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99.87 | 245 | 2940 | 0.08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0,06 | 7,8 |
Tabel 1: Samenvatting van microglia isolatie en RNA extractie gegevens van 3, 5 en 7 dpf zebrafish larven.
| Interne monster ID | Externe monster ID | Qubit (ng/ul) | Qubit(ng/UL) | Gemiddelde concentratie (ng/ul) | Volume (ul) | UG ontvangen | Pass/fail voor minimumconcentratie | Pass/fail voor minimim hoeveelheid | Pass/fail voor aanbevolen hoeveelheid |
| 10907SD0010 | 5 dpf (experiment 4) | 58,8 | 58,4 | 58,6 | 30 | 1.76 | Pass | Pass | Pass |
| Monster vereisten voor bibliotheek Prep: | |||||||||
| Bibliotheek Prep | Minimumhoeveelheid (ng) | Aanbevolen hoeveelheid (ng) | Minimale concentratie ng/uL | ||||||
| TruSeq Nano gel gratis 350 bp invoegen bibliotheek van cDNA | 600 | 1100 | 10 | ||||||
Tabel 2: Aantal tests van versterkte cDNA van RNA steekproef van 5 dpf zebrafish microglia.
Discussion
Het experimentele protocol beschreven hier vertegenwoordigt een robuuste en efficiënte methode om te isoleren van de hersencellen van zebravis larven van 3 tot 8 dpf. Nog belangrijker is, is dit het eerste protocol waarmee de specifieke Isolatievan microglia van larvale zebrafish hersenen. Het protocol is ontworpen voor het behoud van de integriteit van de celmembraan en om te minimaliseren van potentiële wijzigingen van genexpressie die zich voordoen tijdens de verwerking. Dit laatste punt is cruciaal voor de relevantie van de resultaten op basis van de analyse van hun geïsoleerde cellulaire genomic profielen. Inderdaad, microglia en macrofaag polarisatie zijn sterk beïnvloed door hun communicatie. Bij 37 ° C, zou deze cellen hebben veranderd hun genexpressie profiel in reactie op de experimentele omstandigheden (letsel (transect) reactie). Het was dus cruciaal voor het uitvoeren van dit experiment bij 4 ° C vóór RNA extractie, te vertragen cellulaire processen en metabolische activiteiten. Bovendien, de mechanische hersenen weefsel homogenisering bij 4 ° C was gekozen in plaats van enzymatische weefsel spijsvertering bij 37 ° C om te voorkomen dat eventuele effecten op gen expressieprofielen.
Het is belangrijk om te benadrukken dat deze methode zeer snel is; binnen een dag kunnen verschillende hersenen cel populaties geïsoleerd uit ten minste twee verschillende experimentele omstandigheden en hun RNA gehaald. De totale lengte van het protocol, is afhankelijk van het aantal larven gebruikt voor elke voorwaarde zoals het transect van larvale hoofden de beperkende stap (∼ 350 hoofden/h is). In het algemeen, om te werken met microglia van 3, 5 en 7 dpf is verstandig om het transect ∼ 600 hoofden per test te krijgen genoeg RNA uitpakken (tabel 1). Microglia vormen het celtype met het laagste rendement (ca. 112 cellen per hoofd op 7 dpf), het aantal koppen voor andere celtypes, met inbegrip van macrofagen (ca. 170 cellen per hoofd op 7 dpf) kan worden verminderd.
Een ander voordeel van dit protocol is dat zodra instellingen op de sorter FACS zijn vastgesteld, dezelfde instellingen kunnen worden gebruikt voor verschillende experimenten. Men heeft opgemerkt dat cel populaties uit een experiment naar de andere met poorten eerder ontworpen perfect, tonen de reproduceerbaarheid van experimenten met behulp van deze methode.
Een lichte nadeel van deze methode is het relatief lage bedrag van RNA die wordt geoogst. Deze beperking is echter meer een biologische probleem dan een technische kwestie, zoals het aantal microglia zeer laag in vroege stadia van de ontwikkeling van de hersenen (tabel 1 is). Vanwege deze lage hoeveelheid van RNA verzameld, moeten versterking stappen worden beschouwd als genoom breed gen expressie analyses uit te voeren. Gelukkig produceren volgt amplificatie voldoende hoeveelheden van hoogwaardige cDNA. Dus, de mondiale veranderingen in de gene expressieprofielen van geïsoleerde cellen kunnen worden bestudeerd.
Ter afronding: dit protocol voorziet een robuuste methode om te isoleren en bestuderen van verschillende celtypes van de CNS uit larvale zebrafish hersenen. Dit kan worden toegepast om te krijgen een dieper begrip van deze cellen tijdens ontwikkeling alsmede over de studie van hun rol in de ziekte.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Claire Davis en Dr. Veronique Miron (The Queen's Medical Research Institute, Edinburgh, Verenigd Kingdome) voor eerste hulp en discussies op de experimentele aanpak en de QMRI Stroom Cytometry cel Sorteren faciliteit. Dit werk werd gesteund door een Cancer Research UK carrière vestiging Award naar Dr Dirk Sieger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
