Summary
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.
Abstract
Um ein detailliertes Verständnis der Rolle der verschiedenen ZNS-Zellen bei der Entwicklung oder die Einrichtung und das Fortschreiten der Erkrankungen des Gehirns zu gewinnen, ist es wichtig, diese Zellen zu isolieren, ohne ihre Genexpressionsprofil. Der Zebrafisch-Modell bietet eine große Anzahl von transgenen Fischen Linien, in denen bestimmte Zelltypen gekennzeichnet sind; zum Beispiel Neuronen in der NBT:DsRed Zeile bzw. Makrophagen/Mikroglia in der Mpeg1:eGFP-Linie. Darüber hinaus Antikörper wurden entwickelt, um bestimmte Zellen, wie z. B. Mikroglia mit 4 4 Fleck Antikörper.
Hier beschreiben wir die Isolation von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von Larven Zebrafisch Gehirne. Zentral für dieses Protokoll ist die Vermeidung von einer enzymatischen Gewebe Verdauung bei 37 ° C, die zelluläre Profile ändern könnte. Stattdessen wird ein mechanisches System der Gewebe Homogenisierung bei 4 ° C verwendet. Dieses Protokoll beinhaltet Homogenisierung der Gehirne in Zellsuspension, ihre Immuno-Färbung und die Isolation der Neuronen, Makrophagen und Mikroglia durch FACS. Danach wir RNA aus diesen Zellen extrahiert und bewertet deren Qualität/Quantität. Wir es geschafft, die RNA von hoher Qualität zu erhalten (RNA Integrität Anzahl (RIN) > 7) qPCR auf Makrophagen/Mikroglia und Neuronen und transkriptomischen Analyse der Mikroglia durchführen. Dieser Ansatz ermöglicht eine bessere Charakterisierung dieser Zellen sowie ein besseres Verständnis über ihre Rolle in der Entwicklung und Pathologien.
Introduction
Wissen über die Entwicklung des Gehirns und Erkrankungen des Gehirns hat in den letzten zehn Jahren seit der ersten Quantifizierung der Maus Gehirn Transkriptom1deutlich verbessert. In der Tat haben große Gen Ausdruck Genomanalyse wir Zugriff auf detaillierte genetische Informationen auf Gehirngewebe und Zellen, die sich ergänzen und Beobachtungen mit anderen Techniken und Werkzeuge verbessern können.
Der Zebrabärbling ist ein potenter biologisches Modell, leicht zu züchten und zu genetisch zu verändern; seine optische Transparenz bei Larvenstadien kann live imaging Beobachtungen2. Leider, im Vergleich zu Mensch und Maus, die Anzahl der verfügbaren Antikörper auszuführenden Immuno-Färbung ist eher gering. Um hier Abhilfe zu schaffen, sind transgene Zebrafisch Fisch Linien leicht gemacht durch genetisch ändern Fisch, fluoreszierende Proteine unter Zelle Art spezifische Promotoren auszudrücken. Transgene Zebrafisch-Linien wurden in der Vergangenheit zur Untersuchung der Rolle von Makrophagen und Mikroglia im zentralen Nervensystem (ZNS) Entwicklung und Krankheit3,4,5,6. Jedoch um ein detailliertes Verständnis dieser Prozesse zu gewinnen müssen wir Veränderungen in der Genexpression in der jeweiligen Zelltypen zu verstehen. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine experimentelle Methode, um gezielt isolieren Zellen wie Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von 3 bis 8 Tage nach Befruchtung (Dpf) Larven Zebrafisch Gehirne. Für die Einrichtung des Protokolls arbeiteten wir mit transgene Fische-Linien, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) Ausdrücken in Makrophagen/Mikroglia unter der Makrophagen ausgedrückt gen Projektträger (Mpeg1:eGFP) und DsRed in Neuronen unter der neuronalen ß-tubulin Projektträger (NBT:DsRed)7,8,9. Darüber hinaus führten wir durch Immuno-Färbung der Mikroglia mit 4 4, ein Maus monoklonaler Antikörper, die spezifisch Zebrafisch Mikroglia10,11Flecken. Danach wird diese Zellen für weitere quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) oder Transkriptom-Analysen Ribonukleinsäure (RNA) entzogen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um effizient zu homogenisieren Gehirngewebe von zebrafischlarven; Neuronen, Makrophagen/Mikroglia und Mikroglia ohne Änderung der Plasmamembran Integrität zu sammeln und schließlich extrahieren RNA aus diesen Zellen in hoher Qualität (RIN > 7) und Quantität genomische Analysen durchzuführen. Im Gegensatz zu bisher veröffentlichten Studien, die Trypsin-Behandlung bei 37 ° C zu verwenden, um zu verdauen Gehirn Gewebe12,13, fördert dieses Protokoll arbeiten bei 4 ° C bis der RNA Extraktionsschritt, Änderungen des genexpressionsprofils zu reduzieren. Dieser Schritt ist entscheidend als Mikroglia und Makrophagen sind hochsensible Zellen, die Veränderungen in ihrer Mikroumgebung sofort reagieren, durch die Veränderung ihrer Gen Ausdruck Profil und Polarisation14,15, 16.
Das Protokoll, hier im Detail beschrieben, zeigt, dass die Isolation der Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von Zebrafisch-Larven Gehirne, aber praktisch, es an jede andere Zelle angepasst werden kann innerhalb des Gehirns - entweder über transgene Fische Linien präsentieren oder etikettiert mit spezifische Antikörper. Diese Methode ermöglicht eine bessere Charakterisierung der ZNS-Zellen durch ihre Breite Genexpressionsanalysen Genom und wird dazu beitragen, um ihre Rolle bei der Entwicklung und Erkrankungen des Gehirns zu verstehen.
Protocol
1. Probe und Medien-Vorbereitung
- Bereiten Sie Embryo Medium (E3) durch Auflösen von 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O in H2O.
- Sammeln Sie Zebrafish Embryos sofort nach der Befruchtung (0 Dpf).
- 50 pro 90 mm Petrischale Zebrafisch-Embryonen aufgeteilt. Heben Sie Embryonen bei 28,5 ° C in 50 mL Embryo Medium (E3) behandelt mit 200 µM 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), vom Ende des ersten Tages der Entwicklung (0 Dpf) für die Dauer des Experiments Pigmentierung zu hemmen.
- Änderung der E3 + PTU Medium täglich für die Dauer des Experiments.
- -Mpeg1:eGFP und NBT:DsRed Larven bei 2 Dpf mit fluoreszierendem Stereomikroskop für positive Transgene Ausdruck, GFP+ Makrophagen/Mikroglia und DsRed+ Neuronen.
- Bereiten Sie alle Medien der Tag vor dem Experiment unter einer Gewebekultur Haube zur Vermeidung von Kontaminationen, dann bei 4 ° c Lagern
- Bereiten Sie Medien A durch Auflösen von 15 mM Hepes und 25 mM D-Glucose in HBSS 1 X.
- Bereiten Sie Dichte Gradienten Medium (100 %) durch Mischen 9 Bände der gradient mittlerer Dichte 1 Volumen von HBSS 10 X.
- Bereiten Sie das Dichte Gradienten Medium (22 %) durch Verdünnung 22 mL Dichte Gradienten Medium (100 %) in 88 mL des DPBS 1 X.
- Bereiten Sie DPBS 1 X.
- Bereiten Sie E3 Medium + Tricaine durch Mischen E3 Medium mit 450 μM Tricaine.
(2) Homogenisierung
Hinweis: Alle Schritte sind durchgeführten 4 ° C.
- 90 mm Petrischalen mit 50 Larven in 50 mL E3 Embryo Medium behandelt mit 200 µM PTU um unheilbar betäuben fügen Sie 1,5 mL Tricaine (15 mM hinzu).
- 10 narkotisierten Larven von Petrischalen mit einer 3 mL Pasteurpipette Kunststoff Masse aufzusaugen.
- Transfer betäubt Larven 10 mal 10 in eine 55-mm-Petrischale gefüllt mit eiskalten E3 Embryo Medium + Tricaine.
- Richten Sie unter einem Stereomikroskop 10 Larven in der Mitte der Petrischale. Dann Transekt Larven Kopf über dem Dottersack mit chirurgischen Mikro-Schere (Schwimmblase zur Vermeidung von schwebenden Köpfe ausschließen).
- Köpfe von Petrischalen mit einer 3 mL Pasteurpipette Kunststoff Masse aufzusaugen. Warten Sie, bis alle Köpfe innerhalb der Pipettenspitze sammeln und dann in ein Glas-Homogenisator mit 1 mL eiskaltes Media A übertragen (transfer in einem minimalen Volumen, Medien zu reduzieren eine Verdünnung mit E3 + Tricaine). Halten Sie das Glas-Homogenisator auf Eis. Verwenden Sie ein Homogenisator pro versuchsbedingung.
- Ersetzen Sie jede kleine Petrischale mit Eis kalt E3 + Tricaine mit einer neuen erfolgt alle 30 min. zu versichern, dass Durchtrennung im kalten E3 + Tricaine Medium.
- Ersetzen Sie das eiskalte Media A in der Glas-Homogenisator, wenn die Farbe verblassen beginnt.
Hinweis: Medien A Verdünnung kann der Kopf Gewebe aufgrund von Temperaturänderungen verändern. - Sobald alle Köpfe gesammelt wurden (600 Köpfe/Zustand), die maximale Lautstärke von Medien A aus der Glas-Homogenisator entfernen und ersetzen es mit 1 mL frische eiskalte Medien A.
- Stören Sie das Hirngewebe mit einem engen Glas-Homogenisator auf Eis. Führen Sie 40 runden Zerkleinern und Wendungen für 3-5 Dpf Larven und 50 für 7 und 8 Dpf Larven.
- Hinzufügen von Medien A 2 mL Zellsuspension (1 mL Media A / 200 Köpfe), das Verdünnen Zellen und verringern ihre Agglomeration mit Myelin um ihre Trennung während der Zentrifugation in Dichte-Gradienten-Medium zu erleichtern.
- Zelle Agglomeration zu beseitigen, führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 µm Zelle Sieb oben auf einer kalten 50 mL Falcon-Röhrchen gepflegt auf Eis gelegt. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-Mal.
- 1 mL Zellsuspension in kalten 1,5 mL Röhrchen zu übertragen und mit 300 g für 10 min bei 4 ° c drehen
- Überstand mit einer 10 mL Spritze entfernen + Nadel 23 x 1''.
- Wieder aussetzen der Zelle Pellet mit 1 mL eiskaltes 22 % Dichte Gradienten Medium sanft überlagert von 0,5 mL eiskaltes DPBS 1 x (Do nicht mischen sie eine Interphase zwischen beiden Lösungen zu sehen sein).
- Spin-Rohre bei 950 g ohne Bremse und langsame Beschleunigung für 30 min bei 4 ° C.
Hinweis: Dieser Schritt trennt Myelin aus anderen Zellen durch Sequestrierung es in der Interphase des DPBS 1 X und 22 % Dichte Gradienten Medium, während Zellen an der Unterseite des Rohres pellet werden. Myelin-Entfernung ist effizienter, wenn Zellkonzentration nicht zu hoch ist. - Verwenden einen 10-mL-Spritze + Nadel 23 x 1'' verwerfen das Maximum des DPBS, Dichte-Gradienten-Medium und Myelin gefangen in der Interphase.
- Waschen Sie Zellen mit 0,5 mL der Medien A + 2 % vom normalem ziegenserum (NGS), dann Spinnen Sie Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.
- Das Maximum des Überstands zu verwerfen, dann bündeln alle Zelle Pellets aus der gleichen versuchsbedingung zusammen in 1 mL des Medien-A + 2 % NGS.
- Spin-Rohre bei 950 g ohne Bremse und langsame Beschleunigung für 30 min bei 4 ° C.
- Wenn die Zellen von Interesse zum Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins wie Makrophagen/Mikroglia aus Mpeg1:eGFP bringen oder Neuronen aus NBT:DsRed transgene Fische (Screening von transgenen Fischen siehe 1.1.3), laufen die Zellsuspension durch ein Sieb 35 µm Zelle Kappe und übertragen Sie sie in eine kalt 5 mL FACS Röhren auf dem Eis, vor Licht geschützt werden.
Hinweis: Alternativ kann die Immuno-Färbung der Mikroglia durchgeführt.
(3) Microglia Immuno-Färbung
Hinweis: Alle Schritte sind bei 4 ° c durchgeführt.
- Wieder aussetzen der Zelle Pellet mit 0,3 mL Media A + 2 % NGS. In 3 x 1,5 mL Röhrchen aufgeteilt: eine für ungefärbten Zellen, Auto-Fluoreszenz aus Zellen von Interesse, zum anderen für den sekundären Antikörper (1/200), die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers Mikroglia und drittens als Test Messen Messen (4 4 Maus monoklonalen Antikörper (Mikroglia spezifische) (1/20) + Sekundärantikörper (1/200)).
- Fügen Sie Low Endotoxin, azid-Free (Blatt) bei 1 % auf Zellen (alle Röhren), CD16/CD32 Interaktionen mit der Fc-Domäne von Immunglobulinen zu blockieren. Inkubieren Sie Zellen für 10 min mit sanften Agitation alle 5 min.
- Fügen Sie 4 4 Antikörper (1/20), Zellen (Röhre 3) und inkubieren Sie für 30 min unter schonenden rühren alle 10 Minuten.
- Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen, dann den überstand verwerfen.
- Waschen Sie einmal mit 0,5 mL der Medien A + 2 % NGS, drehen dann Rohre bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.
- Wieder auszusetzen Zelle Pellet mit 0,5 ml Media A + 2 % NGS und Zellen mit Blatt bei 1 % für 10 min mit sanften Agitation alle 5 min inkubieren.
- Zellen (Rohr 2 und 3) sekundäre Antikörper (1/200) hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen für 30 min mit sanften Agitation, alle 10 min und Lichtschutz.
- Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen, dann überstand verwerfen.
- Waschen zweimal mit 0,5 mL Media A + 2 % NGS, dann wieder auszusetzen Zelle Pellet mit 1 mL Media A + 2 % NGS.
- Ein 35 µm Sieb Zellenabdeckung durchziehen Sie Zellsuspension und übertragen Sie diese in kalten 5 mL FACS Röhren auf Eis, vor Licht geschützt.
(4) Zelle Sortieren (FACS)
Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei 4 ° C.
- Sortieren Sie Neuronen, Makrophagen/Mikroglia und Mikroglia mit einem FACS.
Hinweis: Dieser Schritt erfolgt in der Regel von einem Mitarbeiter der FACS Facility und Einstellungen hängen von der Art der Ausrüstung verwendet.- Fügen Sie DAPI in einer Konzentration von 1 µg/mL in jedem FACS-Röhrchen, abgestorbene Zellen zu kennzeichnen.
- FACS und Art Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia aus alle Gehirnzellen einrichten. Getrennte Zellen von Schutt in Abhängigkeit von ihrer Größe und Granularität, dann Tor Einzel-Zellen durch forward Scatter und Side Scatter. Schließen Sie aus, indem Sie DAPI Kennzeichnung von lebenden Zellen abgestorbene Zellen. Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia durch ihre jeweiligen positive Färbung zu identifizieren.
- Sammeln Sie Zellen in 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL eiskaltes Media A + 2 % NGS auf Eis. Verwenden Sie verschiedene Schläuche für jeden Zelltyp.
- Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen und dann verwerfen des Überstands.
- Waschen Sie einmal mit 0,5 mL der Medien eine dann verwerfen die maximale überstand.
(5) RNA-Extraktion
- Die verschiedenen Zelltypen getrennt durch FACS extrahieren Sie RNA. Verwenden Sie für die RNA-Extraktion eine besondere-Installationssatz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Sicherstellen Sie, dass in einer RNase frei Umgebung durch Reinigung Arbeitsbereich und Pipetten mit einem RNase Dekontamination Produkt arbeiten und Filtertips verwenden.
- Frisch bereiten Sie 1 mL Lyse-Puffer mit 50 µM β-Mercaptoethanol ergänzt zu.
Hinweis: Hier wird β-Mercaptoethanol hinzugefügt, um RNA-Abbau zu reduzieren. - Bereiten Sie 70 % und 80 % Ethanol-Lösung mit RNase freies Wasser.
- Lösen Sie Zellen mit 75 µL Lyse Puffer mit 50 µM β-Mercaptoethanol ergänzt. Verwenden Sie dann einen Schredder Zellaufschluss zu verbessern.
- RNA-Extraktion laut Hersteller der Bedienungsanleitung weiter.
- Am Ende des Protokolls eluieren der RNS mit 14 µL RNase freies Wasser um eine ausreichende RNA-Konzentration zu erhalten.
- Frisch bereiten Sie 1 mL Lyse-Puffer mit 50 µM β-Mercaptoethanol ergänzt zu.
Representative Results
Das beschriebene Protokoll ist ein einfaches Verfahren, Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von Zebrafisch-Larven Gehirne zu isolieren. Aus diesen isolierten Zellen, erhebliche Mengen von hoher Qualität (RIN > 7) RNA wurden extrahiert. Das Ziel dieses Protokolls ist, verschiedene Arten von Zellen aus CNS, mit minimalen Änderungen ihrer Genexpressionsprofil zu analysieren und zu charakterisieren, Zelleneigenschaften und Funktionen zu isolieren. Daher wird das gesamte Protokoll bei 4 ° C mit einer mechanischen Gehirns Gewebe Homogenisierung durchgeführt. Diese Methode hat für zwei Studien im Labor erfolgreich eingesetzt. In der ersten Studie wurden Neuronen und Makrophagen/Mikroglia isoliert aus 8 Dpf Mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ Larven (Abbildung 1). FACS Zellseparation aus Trümmern in Abhängigkeit von ihrer Größe erlaubt (FSC-A) und Granularität (SSC-A) (Abb. 1A). Einzelne Zellen wurden dann von Dubletten oder Zelle Agglomerate (Abbildung 1B) getrennt. Von der einzelnen Zellenbevölkerung wurde ein Tor gezogen, um abgestorbene Zellen (DAPI+) zu beseitigen. Die entsprechenden Dot-Plot ergab, dass dieses experimentelle Protokoll Zelle Plasmamembran Integrität bewahrt, wie abgestorbene Zellen nur 26,7 % (Abbildung 1C) beträgt. Zu guter Letzt wurden Neuronen (DsRed+) und Makrophagen/Mikroglia (GFP+) leicht von den live Zelle Bevölkerung Toren getrennt. Die Neuron-Bevölkerung (23,1 %) scheinen mehr im Vordergrund als die Makrophagen/Mikroglia Bevölkerung (1,56 %) innerhalb des Gehirns (Abbildung 1D). Dieses Protokoll erlaubt um RNA aus diesen Zellen um nachfolgende qPCR Analysen um die Expression bestimmter Gene zwischen Neuronen und Makrophagen/Mikroglia vergleichen zu isolieren. Abbildung 2 zeigt neuronale und Makrophagen/Mikroglia Gen Ausdruck Niveaus des wuchernden Cell nuclear Antigen (Pcna)gegen β-Aktin Housekeeping Gene als Vorbild.
Für die zweite Studie konzentrierte sich diese Methode auf Mikroglia Isolation von 3, 5 und 7 Dpf Larven Gehirne. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Experiment wurden durch Immuno-Beflecken Zellen isoliert mit 4 4, ein Antikörper, der spezifisch Mikroglia (Abbildung 3 A-D Etiketten). Wie zuvor beschrieben, Mikroglia (4 4+) wurden von lebenden Zellen ausgewählt und gesammelt (Abbildung 3D). Mikroglia Zahlen im Zebrafisch-Larven Gehirne sind variabel (Tabelle 1), und mit 3 Dpf (∼ 25 pro Fisch) sehr gering. Qualität und Quantität der extrahierten RNA aus diesen Zellen wurden gemessen mit einem Mikro-Kapillar-Elektrophorese basierte System. Ergebnisse der extrahierten RNA von Mikroglia 5 Dpf Larven Zebrafisch Gehirne wurden bereitgestellt, um ein Beispiel für eine RNA Analyse (Tabelle 1 (5 Dpf; Experiment 4)) zu illustrieren. Abbildung 4 zeigt die Elektrophorese-Spur und die grafische Darstellung erhalten für dieses Beispiel mit eine klare Visualisierung der ribosomalen RNA (28 s und 18 s). Diese Daten sind erforderlich, um Probe RIN zu berechnen und zu RNA-Konzentration zu bestimmen. Tabelle 1 fasst die Zahl der isolierten Mikroglia pro Fisch, die Menge an RNA pro Mikroglia und den RIN erreichte Punktzahl für jedes anderes Experiment auf 3, 5 und 7 Dpf. Die Menge und die Qualität der extrahierten RNA aus isolierten Mikroglia, die mit dieser Methode konnten wir die RNA in cDNA mit einem Kit zu verstärken. Qualität und Quantität von Edinburgh Genomics genannten Tests bestätigen, dass die verstärkte cDNA von ausreichender Qualität für die Bibliothek Vorbereitung und anschließende Sequenzierung. Abbildung 5 zeigt die Größenverteilung der cDNA-Fragmente und ihre Höhe mit einem elektrophoretischen System gemessen. In diesem Beispiel die cDNA hatte eine mittlere Größe von 299bp in einer Konzentration von 36100 Pmol/l Tabelle 2 zeigt bzw. qualitative und quantitative Untersuchungen auf verstärkte cDNA von RNA-Proben (Tabelle 1 (5 Dpf; Experiment 4)). Die verstärkte cDNA wurde erfolgreich für die Sequenzierung eingesetzt.
Mehrere Studien im Labor bestätigte, dass die Qualität und Quantität der extrahierten RNA aus Neuronen, Makrophagen und Mikroglia für nachfolgende qPCR und Genom Breite Genexpressionsanalysen verwendet werden können. Daher kann dieses experimentelle Protokoll verwendet werden, zuverlässig verschiedene Arten von ZNS-Zellen zu isolieren, ohne Veränderung ihrer Membran Integrität und Änderung ihrer Genexpressionsprofil zu begrenzen.
Abbildung 1 : FACS Sortierung für Neuronen und Makrophagen/Mikroglia aus Mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 Dpf zebrafischlarven. (A-C) Aufeinanderfolgenden Anspritzung sequenzielle Auswahl an alle Gehirn Zellen (A) zeigt, einzelne Zellen von forward Scatter und Side scatter (B). (C) toten Zellen wurden durch DAPI Kennzeichnung ausgeschlossen. (D) Neuronen und Makrophagen/Mikroglia wurden jeweils mit DsRed und GFP positive Färbung gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Gen Expressionsanalyse für Pcna und β-Aktin in Neuronen und Makrophagen/Mikroglia. RNA aus isolierten Neuronen und Makrophagen/Mikroglia kann in cDNA für den Einsatz in quantitative PCR Analyse transkribiert werden. mRNA-Ausdruck Niveaus Pcna gegen β-Aktin Housekeeping Gen in isolierten Neuronen und Makrophagen/Mikroglia durch qPCR ermittelt (N = 3). Fache Änderung wurde mittels der Vergleichsmethode (ΔΔCT) gemessen. Fehler bar repräsentieren Mittelwert ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : FACS Sortierung für Mikroglia aus 3 Dpf zebrafischlarven. (A-C) Aufeinanderfolgenden gating Show sequenzielle Auswahl an alle Gehirn Zellen (A), einzelne Zellen von forward Scatter und Side scatter (B). (C) toten Zellen wurden durch DAPI Kennzeichnung ausgeschlossen. (D) Mikroglia wurden durch 4 4 positive Färbung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Micro-Kapillar-Elektrophorese Ergebnisse der extrahierten RNA aus 5 Dpf Zebrafisch Mikroglia. Die beiden hohen Gipfel sind die 18 s und 28 s ribosomalen RNA. RNA Integrität Anzahl (RIN) wurde durch die Bioanalyzer Software unter Verwendung der generierten Verhältnis von der 18 s und 28 s ribosomalen Untereinheiten und die Analyse des gesamten elektrophoretischen Trace automatisch berechnet. Mikroglia RNA hat ein RIN 8.6. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Qualität und Quantität Tests der verstärkten cDNA von RNS-Probe von 5 Dpf Zebrafisch Mikroglia. Das Bild zeigt die cDNA Fragment Größenverteilung der analysierten Probe mit einer durchschnittlichen Größe von 299 BP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Zustand | Experiment | Anzahl der Fische | Anzahl von Zellen | Zellzahl pro Fisch | RNA-Konzentration (Pg/Ul) | Gesamt-RNS (Pg) | RNA-Menge pro Zelle (Pg) | RIN-Partitur |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0.13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37,55 | 253 | 3036 | 0.13 | 7.9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31,15 | 255 | 3060 | 0,16 | 7.7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18,54 | 189 | 2268 | 0,20 | 7.8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0.10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0.26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97.72 | 362 | 4344 | 0,07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54,18 | 348 | 4176 | 0.13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0,09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0,07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74.95 | 134 | 1608 | 0,04 | 7.6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0,04 | 7.9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0,04 | 7.8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0,06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0,07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99,87 | 245 | 2940 | 0,08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092 | 0,06 | 7.8 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Mikroglia Isolation und RNA-Extraktion aus 3, 5 und 7 Dpf Zebrafisch-Larven.
| Interne Proben-ID | Externen Proben-ID | Qubit (ng/Ul) | Qubit(ng/UL) | Durchschnittliche Konzentration (ng/Ul) | Volume (Ul) | UG erhalten | Pass/Fail-für minimale Konzentration | Pass/Fail-für minimalen Menge | Pass/Fail-für empfohlene Menge |
| 10907SD0010 | 5 Dpf (Versuch 4) | 58,8 | 58.4 | 58,6 | 30 | 1,76 | Pass | Pass | Pass |
| Probe-Anforderungen für Bibliothek-Vorbereitung: | |||||||||
| Bibliothek-Prep | Mindestmenge (ng) | Empfohlene Menge (ng) | Minimale Konzentration ng/uL | ||||||
| TruSeq Nano gel freie 350 bp-einfügen-Bibliothek von cDNA | 600 | 1100 | 10 | ||||||
Tabelle 2: Menge Tests der verstärkten cDNA von RNS-Probe von 5 Dpf Zebrafisch Mikroglia.
Discussion
Das hier beschriebene experimentelle Protokoll stellt eine robuste und effiziente Methode, Gehirnzellen von zebrafischlarven von 3 bis 8 Dpf zu isolieren. Wichtig ist, ist dies das erste Protokoll, das die spezielle Isolierung der Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn ermöglicht. Das Protokoll dient dazu, Zellmembran Integrität zu bewahren und um mögliche Änderungen der Genexpression, die während der Verarbeitungsprozess zu minimieren. Dieser letzte Punkt ist entscheidend für die Relevanz der Ergebnisse anhand der Analyse dieser isolierten zelluläre Genom Profile. In der Tat, Mikroglia und Makrophagen Polarisation sind stark von ihrer Mikroumgebung. Bei 37 ° C würde diese Zellen ihre Genexpressionsprofil in Reaktion auf experimentellen Bedingungen (Verletzungen (Durchtrennung) Antwort) geändert. Daher war es entscheidend, dieses Experiment bei 4 ° C vor RNA-Extraktion, zu verlangsamen, zelluläre Prozesse und metabolischen Tätigkeiten durchführen. Darüber hinaus wurde die mechanischen Gehirns Gewebe Homogenisierung bei 4 ° C anstelle von enzymatischen Gewebe Verdauung bei 37 ° C gewählt, um Auswirkungen auf Gen expressionsprofile zu vermeiden.
Es ist wichtig, hervorzuheben, dass diese Methode sehr schnell; innerhalb eines Tages können mehrere Gehirn-Zell-Populationen isoliert aus mindestens zwei verschiedenen experimentellen Bedingungen und ihre RNA extrahiert werden. Die Gesamtlänge des Protokolls hängt von der Anzahl der Larven für jede Bedingung verwendet, da die Durchtrennung der Larven Köpfe der limitierende Schritt (∼ 350 Köpfe/h) ist. Im Allgemeinen ist die Arbeit mit Mikroglia von 3 5 und 7 Dpf empfohlen Transekt ∼ 600 Köpfe pro Test zu genügend RNA extrahieren (Tabelle 1). Wie Mikroglia repräsentieren die Zelltyp mit dem geringsten Ertrag (ca. 112 Zellen pro Kopf bei 7 Dpf), die Anzahl der Köpfe für andere Zelltypen, einschließlich Makrophagen (ca. 170 Zellen pro Kopf bei 7 Dpf) reduziert werden kann.
Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist, dass sobald Einstellungen auf dem FACS-Sorter festgelegt wurden, die gleichen Einstellungen für verschiedene Experimente verwendet werden können. Es wurde beobachtet, dass Zell-Populationen von einem Experiment zum anderen mit Toren bereits entworfen, perfekt zeigt die Reproduzierbarkeit der Experimente mit dieser Methode.
Ein kleinen Nachteil dieser Methode ist die relativ geringe Menge an RNA, die geerntet wird. Diese Einschränkung ist jedoch mehr ein biologisches Problem als ein technisches Problem, da die Anzahl der Mikroglia im Frühstadium der Entwicklung des Gehirns (Tabelle 1) sehr gering ist. Durch diese geringe Menge an RNA gesammelt Verstärkung Schritte Genom Breite Gen Expressionsanalyse durchführen berücksichtigt werden müssen. Glücklicherweise, produzieren diese Verstärkung Schritte ausreichende Mengen an hochwertigen cDNA. So können die globale Veränderungen in der Gen-expressionsprofile von isolierten Zellen untersucht werden.
Dieses Protokoll bietet abschließend eine robuste Methode zu isolieren und verschiedenen CNS Zelltypen aus Larven Zebrafisch Gehirn zu studieren. Dies kann angewendet werden, um ein tieferes Verständnis dieser Zellen während der Entwicklung als auch hinsichtlich ihrer Rolle bei der Krankheit studieren zu gewinnen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Claire Davis und Dr. Veronique Miron (The Queen es Medical Research Institute, Edinburgh, Vereinigtes Königreich) für erste Hilfe und Diskussionen über die experimentellen Ansatz und die QMRI Flow Cytometry Zelle Sortieren Anlage. Diese Arbeit wurde durch einen Krebs UK Karriere Einrichtung Forschungspreis für Dr. Dirk Sieger unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
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