Summary
אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.
Abstract
כדי לקבל הבנה מפורטת של התפקיד של תאים שונים CNS במהלך פיתוח או הקמת והתקדמות של פתולוגיות במוח, חשוב לבודד תאים אלה מבלי לשנות פרופיל ביטוי גנטי. המודל דג זברה מספק מספר רב של קווים דגים מהונדס שבו לוחיות ההסבר סוגי תאים ספציפיים; לדוגמה הנוירונים NBT:DsRed קו או מקרופאגים/מיקרוגלייה בקו mpeg1:eGFP. יתר על כן, פותחו נוגדנים כתם תאים ספציפיים, כגון מיקרוגלייה עם 4C 4 נוגדן.
כאן, אנו מתארים את הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. מרכזי פרוטוקול זה הוא ההתרחקות עיכול אנזימטי רקמות ב 37 מעלות צלזיוס, אשר יכול לשנות פרופילים הסלולר. במקום זה משמש מערכת מכנית של רקמות המגון ב 4 ° C. פרוטוקול זה כרוך המגון המוח לתוך התא ההשעיה, מכתים חיסונית שלהם, הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מאת FACS. לאחר מכן, אנו מופק RNA תאים אלה, להעריך את האיכות/כמות. הצלחנו להשיג RNA באיכות גבוהה (RNA תקינות מספר (RIN) > 7) כדי לבצע qPCR על ניתוח מקרופאגים/מיקרוגלייה נוירונים, ואת transcriptomic על מיקרוגלייה. גישה זו מאפשרת אפיון טוב יותר של תאים אלה, כמו גם הבנה ברורה יותר על התפקיד שלהם בתחום הפיתוח פתולוגיות.
Introduction
ידע על התפתחות המוח, המוח מחלות השתפרה במידה ניכרת בעשור האחרון מאז כימות הראשון של העכבר-המוח-transcriptomes-1. אכן, ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום נותן לנו גישה למידע גנטי מפורט על רקמת המוח ותאי זה יכול להשלים ולשפר את תצפיותיו עם טכניקות וכלים אחרים.
דג זברה היא דוגמנית ביולוגי חזק, קל להתרבות וכדי לשנות גנטית; שקיפותו אופטי בשעה שדרגות מאפשרת חיים תצפיות הדמיה2. למרבה הצער, בהשוואה ל אנושי, עכבר, המספר של נוגדנים זמינים לביצוע מכתים חיסונית נמוכות למדי. כדי לתקן זאת, קווים דגים דג זברה מהונדס בקלות מתבצעים על-ידי שינוי גנטית דג אקספרס חלבונים פלורסנט תחת התא סוג ספציפי היזמים. דג זברה מהונדס קווים שימשו בעבר ללמוד את התפקיד של מקרופאגים מיקרוגלייה בזמן מחלה3,4,5,6ופיתוח של מערכת העצבים המרכזית (CNS). עם זאת, כדי להשיג הבנה מפורטת של תהליכים אלה אנחנו צריכים להבין שינויים בביטוי הגנים סוגי תאים המתאימים. לכוונה זו, פיתחנו שיטה ניסיונית במיוחד בידוד תאי כמו נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה 3 8 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחל דג זברה המוח. להקמתה של הפרוטוקול, עבדנו עם קווים דגים הטרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב מקרופאגים/מיקרוגלייה תחת הגן בא לידי-ביטוי מקרופאג יזם (mpeg1:eGFP) ו- DsRed בנוירונים תחת ß-טובולין עצבית יזם (NBT:DsRed)7,8,9. יתר על כן, ביצענו מכתים חיסונית של מיקרוגלייה באמצעות 4C 4, נוגדן חד שבטי העכבר זה במיוחד כתמי דג זברה מיקרוגלייה10,11. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית (RNA) מופק מן התאים האלה עוד יותר כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) או transcriptome ניתוחים. פרוטוקול זה תוכנן כדי homogenize ביעילות רקמת מוח של דג זברה הזחלים; לאסוף את הנוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה ללא שינוי של שלמות קרום פלזמה שלהם ולחלץ סוף סוף RNA של תאים אלה באיכות גבוהה (RIN > 7) וכמות לבצע אנליזה גנומית. בניגוד מחקרים שפורסמו בעבר להשתמש טריפסין טיפול ב 37 מעלות צלזיוס לעכל12,של רקמת המוח13, פרוטוקול זה מקדם את העבודה ב 4 ° C עד השלב החילוץ RNA כדי להפחית את השינויים של פרופיל ביטוי גנטי. שלב זה הוא קריטי כמו מיקרוגלייה ו מקרופאגים הם תאים רגישים אשר מגיבים לשינויים microenvironment שלהם מיד על ידי שינוי שלהם ג'ין ביטוי פרופיל של קיטוב14,15, 16.
הפרוטוקול, המתוארים כאן בפירוט, מראה שהבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן מוח זחל דג זברה, אך למעשה, זה ניתן להתאים לכל תא אחר להציג בתוך המוח - גם באמצעות דגים הטרנסגניים שורות או בלוחיות הסבר נוגדנים ספציפיים. שיטה זו יאפשר אפיון טוב יותר של תאי מערכת העצבים המרכזית דרך את בדיקותיהם ביטוי הגן רחב של הגנום, תסייע לך להבין את תפקידם במהלך התפתחות המוח מחלות.
Protocol
1. מדגם והכנות מדיה
- להכין העובר בינוני (E3) על ידי המסת 6.4 מ מ אשלגן כלורי, 0.22 מ מ NaCl, מ"מ 0.33 CaCl2 2 H2O, 0.33 מ מ MgSO4 7 שעות2O H2O.
- לאסוף דג זברה העוברים מיד לאחר ההפריה (0 dpf).
- פצל דג זברה עוברי 50 90 מ מ צלחת פטרי. העלאת עוברי ב 28.5 ° C ב- 50 מ של העובר בינוני (E3) שטופלו מיקרומטר 200 1-phenyl 2-thiourea (פרופילתיואוראציל), בסוף היום הראשון של פיתוח (0 dpf) משך זמן הניסוי כדי לעכב פיגמנטציה.
- שינוי E3 + פרופילתיואוראציל בינוני מדי יום משך זמן הניסוי.
- מסך mpeg1:eGFP וזחלים NBT:DsRed-dpf 2 באמצעות stereomicroscope נמכרות עבור ביטוי חיובי transgene, המקרופאגים GFP+ /מיקרוגלייה DsRed+ נוירונים.
- להכין כל המדיה יום לפני הניסוי ברדס תרביות רקמה כדי למנוע זיהום, ולאחר מכן לאחסן אותם ב 4 º C.
- להכין מדיה A על ידי המסת 15 מ מ Hepes ו- 25 מ מ D-גלוקוז HBSS 1 x.
- הכן דחיסות צבע בינונית (100%) על ידי ערבוב 9 כרכים של המדיום הדרגתיות צפיפות 1 ףקיהב HBSS 10 x.
- הכן המדיום הדרגתיות צפיפות (22 אחוז) על ידי דילול 22 מ של דחיסות צבע בינונית (100%) ב- 88 מ של DPBS 1 x.
- להכין DPBS 1 x.
- הכן E3 בינוני + Tricaine על ידי ערבוב בינונית E3 עם 450 μM Tricaine.
2. המגון
הערה: כל השלבים הינם בביצוע 4 ° C.
- להוסיף 1.5 mL Tricaine (15 מ מ) ל- 90 מ מ פטרי המכילות הזחלים 50 ב 50 מ של E3 העובר בינוני שטופלו 200 מיקרומטר פרופילתיואוראציל כדי סופני עזים ומתנגד להם.
- להתחנף 10 הזחלים מרדימים צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה.
- העברת ומורדמת הזחלים 10 ב-10 לתוך צלחת פטרי 55-מ מ מלא קפואים E3 העובר בינוני + Tricaine.
- תחת stereomicroscope, ישר הזחלים 10 במרכז הפטרי. ואז transect ראשים זחל מעל שק החלמון באמצעות מיקרו-מספריים כירורגיים (לא לכלול שלפוחית אוויר כדי למנוע הצפה ראשי).
- לספוג את ראשיכם צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה. לחכות עד כל ראשי מתאספים בעוד קצהו פיפטה ולאחר מכן להעביר אותם לתוך מהמגן זכוכית המכיל A Media כקרח 1 מ"ל (העברה באמצעי אחסון מינימלי כדי להפחית את המדיה לדילול ידי E3 + Tricaine). שמור את מהמגן זכוכית על קרח. השתמש מהמגן אחד לכל תנאי הניסוי.
- להחליף כל פטרי קטן המכיל קרח קר E3 + Tricaine חדשה כל 30 דקות כדי להבטיח את חיתוך מתבצע ב- E3 קר + Tricaine בינונית.
- החלף A Media כקרח ב מהמגן זכוכית הפעלת הצבע דוהה.
הערה: דילול של המדיה יכול לשנות את הרקמה ראש עקב שינויי טמפרטורה. - לאחר שנאסף כל ראשי (600 ראשי/תנאי), להסיר את הנפח המרבי של מדיה A מהמגן זכוכית ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של טרי א מדיה קר כקרח
- לשבש את רקמת המוח עם מהמגן זכוכית צר על קרח. לבצע סיבובים 40 של ריסוק, והופך את הזחלים dpf 3-5, 50 עבור הזחלים dpf 7 ו- 8.
- להוסיף 2 מ"ל של מדיה A תא ההשעיה (1 מ"ל מדיה A / 200 ראשי), זה תאים למהול ולהפחית שלהם הצטברות המיאלין כדי להקל על הפירוד שלהם במהלך צנטריפוגה דחיסות צבע בינוני.
- כדי למנוע הצטברות תאים, לרוץ התליה תא דרך מסננת תא 40 µm להציב על גבי צינור בז קר 50 מ ל שמר על קרח. חזור על פעולה זו 3 פעמים.
- להעביר 1 מ"ל של השעיה תא קר mL 1.5 צינורות ולסובב אותם ב 300 גרם 10 דקות ב 4 º C.
- להסיר את תגובת שיקוע באמצעות מזרק 10-mL + מחט 23G x 1''.
- מחדש להשעות בגדר תא עם 1 מ"ל כקרח 22% צפיפות צבע בינוני בשכבות בעדינות על ידי 0.5 מ של קרח DPBS 1 x (do לא לערבב אותם, לאטמוספרה בין שני פתרונות יראו).
- ספין צינורות ב 950 g ללא בלימה והאצה איטי למשך 30 דקות ב 4 º C.
הערה: שלב זה מפריד את המיאלין של תאים אחרים על-ידי sequestering זה-לאטמוספרה של DPBS 1 x ו- 22% צפיפות בינונית הדרגתיות, ואילו תאים גלולה בתחתית הצינורית. המיאלין הסרת יעיל יותר כאשר התא ריכוז אינו גבוה מדי. - באמצעות על מזרק 10-mL + מחט 23G x 1'' להשליך המרבי של DPBS, צפיפות בינונית הדרגתיות המיאלין לכוד ב שלהם לאטמוספרה.
- לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מדיה A + 2% של סרום עז רגילה (הגדרות), ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.
- למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע ולאחר מכן מאגר כל כדורי תא לפי מצב ניסיוני באותו יחד 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.
- ספין צינורות ב 950 g ללא בלימה והאצה איטי למשך 30 דקות ב 4 º C.
- אם התאים של ריבית מבטאים חלבון פלואורסצנטי כמו מקרופאגים/מיקרוגלייה מ mpeg1:eGFP או נוירונים NBT:DsRed הטרנסגניים דגים (הקרנת לראות דגים הטרנסגניים 1.1.3), לרוץ התליה תא דרך מסננת תא מיקרומטר 35 קאפ ולהעביר אותם לתוך צינורות קר 5 מ"ל FACS בקרח, מוגן מפני אור.
הערה: לחלופין, מכתים חיסונית של מיקרוגלייה יכולה להתבצע.
3. מיקרוגלייה חיסונית מכתים
הערה: כל הצעדים מבוצעים ב 4 º C.
- מחדש להשעות בגדר תא עם mL 0.3 של מדיה A + 2% המיתרים. לפצל אותם צינורות 3 x 1.5 mL: אחד עבור תאים וללא רבב למדוד אוטומטי-זריחה מתאי מעניינים, שנית הנוגדן המשני (1/200) למדוד את הכריכה לא ספציפית של הנוגדן משני כדי מיקרוגלייה ושלישית כמבחן (4C 4 העכבר monoclonal נוגדנים (מיקרוגלייה ספציפי) (1/20) + נוגדנים משניים (1/200)).
- הוסף אנדוטוקסין נמוכה, ללא אזיד (עלה)-1% תאים (כל צינורות) כדי לחסום את CD16/CD32 אינטראקציות עם התחום Fc של immunoglobulins. דגירה תאים עבור 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.
- הוסף את 4 4C נוגדן (1/20) על תאים (צינור 3) דגירה למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות.
- ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.
- לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים, ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.
- צניפה תא מחדש להשעות 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים דגירה תאים עם עלה ב-1% למשך 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.
- להוסיף נוגדנים משניים (1/200) לתאים (הצינור 2 ו- 3). דגירה תאים למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות והגנה אור.
- ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.
- תשטוף פעמיים עם 0.5 מ של מדיה + 2% המיתרים, בזמנו, מחדש להשעות תא גלולה עם 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.
- תריץ תא ההשעיה כובע מסננת 35 מיקרומטר תא ולהעביר אותם אל תוך קר 5 מ"ל FACS צינורות בקרח, מוגן מפני אור.
4. תא מיון (FACS)
הערה: בצע את כל השלבים ב 4 º C.
- למיין נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה באמצעות FACS.
הערה: שלב זה מתבצע בדרך כלל על ידי איש צוות של המתקן FACS, הגדרות תלויות בסוג ציוד.- להוסיף דאפי ריכוז של µg/mL 1 ב כל שפופרת FACS לסמן תאים מתים.
- להגדיר את הנוירונים FACS ומיון, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מכל התאים במוח. בתאים נפרדים מפני פסולת תפקודה של צפיפות רשת ובגודל שלהם, ואז שער חד-תאים על ידי פיזור קדימה ופיזור בצד. הכללת תאים מתים מאת דאפי labelling מתוך תאים חיים. לזהות נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מאת שלהם מכתים חיוביות בהתאמה.
- איסוף תאים צינורות 1.5 mL המכיל 1 מ"ל של מדיה A + 2% קר כקרח המיתרים על קרח. השתמש צינורות שונים עבור כל סוג התא.
- ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
- לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה אז למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע.
5. RNA החילוץ
- לחלץ RNA סוגי התאים מופרדים על-ידי FACS. לחילוץ RNA להשתמש ערכת ספציפיים, פעל לפי ההנחיות של היצרן. ודא עובד בסביבה RNase חינם על-ידי ניקוי סביבת פיפטות עם מוצר טיהור RNase ולהשתמש מסנן טיפים.
- להכין טרי 1 מ"ל של פירוק מאגר בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol.
הערה: כאן, β-mercaptoethanol נוספת כדי להפחית את ה-RNA השפלה. - להכין פתרון אתנול 70% ו- 80% באמצעות RNase מים חינם.
- Lyse תאים עם 75 µL מאגר פירוק בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. לאחר מכן להשתמש מגרסה והשמד לשיפור לשבירת תאים.
- המשך במדריך של החילוץ-RNA לפי יצרן.
- בסוף הפרוטוקול, elute את ה-RNA עם 14 µL של מים בחינם RNase בריכוז ה-RNA מספיקות.
- להכין טרי 1 מ"ל של פירוק מאגר בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר היא גישה ישירה לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה. אלה מבודדים תאים, כמויות משמעותיות של איכות גבוהה (RIN > 7) RNA חולצו. המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד סוגים שונים של תאים של מערכת העצבים, בשינוי מינימלי של שלהם פרופיל ביטוי גנטי לאבחן ולאפיין את מאפייני תא ופונקציות. לכן, פרוטוקול כולו מתבצע ב 4 ° C עם המגון רקמות המוח מכני. שיטה זו שימש בהצלחה במשך שני מחקרים שבוצעו במעבדה. במחקר הראשון, נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה הם בודדו אותנו מהמתרחש 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ הזחלים (איור 1). FACS מורשה למחקר מפני פסולת תפקודה של גודלם (FSC-A), צפיפות (האס-A) (איור 1א'). תאים בודדים הופרדו אז doublets או תא agglomerates (איור 1B). מן האוכלוסייה תא בודד, שער צוירה לסלק תאים מתים (דאפי+). העלילה נקודה המתאימה חשף כי פרוטוקול נסיוני זה שומר על תאי פלזמה הקרומיות, כמו הקצב של תאים מתים רק 26.7% (איור 1C). לבסוף, נוירונים (DsRed+) ו מקרופאגים/מיקרוגלייה (GFP+) היו בקלות הפרדה בין השערים אוכלוסיית תאים חיים. האוכלוסייה נוירון (23.1%) נראה בולט יותר מאשר באוכלוסיה מקרופאגים/מיקרוגלייה (1.56%) בתוך המוח (איור 1D). פרוטוקול זה אפשרה לבודד RNA של תאים אלה כדי לבצע ניתוח qPCR עוקבות. להשוות את הביטוי של גנים ספציפיים בין הנוירונים מקרופאגים/מיקרוגלייה. איור 2 מופעים עצביים, מקרופאגים/מיקרוגלייה ג'ין רמות הביטוי של מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (pcna)נגד הגן משק בית β-אקטין כדוגמה.
לצורך המחקר השני בשיטה זו התמקדו מיקרוגלייה בידוד מן המוח זחל dpf 3, 5, 7. בניגוד הניסוי המתואר לעיל, התאים היו מבודדים על ידי מכתים חיסונית באמצעות 4C 4, נוגדנים אשר במיוחד תוויות מיקרוגלייה (איור 3 A-D). כאמור תיאר, מיקרוגלייה (4C 4+) נבחרו מתוך תאים חיים ואסף (איור 3ד'). מיקרוגלייה בתוך המוח זחל דג זברה המספרים משתנה (טבלה 1), נמוך מאוד-dpf 3 (∼ 25 לכל דג). האיכות והכמות של RNA שחולצו מן תאים אלה נמדדו באמצעות מערכת אלקטרופורזה מיקרו-נים מבוסס. התוצאות המתקבלות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה 5 מוח של דג זברה זחל dpf סופקו להדגמת של RNA ניתוח (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). איור 4 מציג את האיתור אלקטרופורזה וייצוג גרפי שלו השיג עבור דוגמה זו עם פריט חזותי ברור של ribosomal RNA (28s ו- 18s). נתונים אלה יש צורך לחשב לדוגמה רין וכדי לקבוע ריכוז ה-RNA. טבלה 1 מסכמת מספר מיקרוגלייה מבודד לכל הכמות של RNA לכל מיקרוגלייה ודגים, התוצאה רין השיג עבור ניסוי שונות-dpf 3, 5, 7. הכמות והאיכות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה מבודדים באמצעות שיטה זו אפשר לנו להגביר את הרנ א לתוך cDNA באמצעות ערכת. בדיקות איכות וכמות שסופקו על-ידי אדינבורו גנומיקה לאשר cDNA מוגבר באיכות מספקת עבור ספריית הכנה ורצף עוקבות. איור 5 מציג את התפלגות גודל של קטעי cDNA והכמות שלהם נמדד באמצעות מערכת electrophoretic. במדגם זה, cDNA היה בגודל אכזרי של 299bp-ריכוז 36100 pmol/ל' בטבלה 2 מדגים בהתאמה בדיקות איכות וכמות ב cDNA מוגבר מדגימות RNA (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). CDNA מוגבר שימש בהצלחה עבור רצף.
מספר מחקרים שבוצעו במעבדה אישרו כי האיכות והכמות של RNA שחולצו מן הנוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה יכול לשמש qPCR הבאים וניתוחים ביטוי הגן רחב הגנום. לכן, פרוטוקול נסיוני זה ניתן לבודד אמינה סוגים שונים של תאי מערכת העצבים המרכזית ללא שינוי שלהם הקרומיות והגבלת שינוי של הפרופיל שלהם ביטוי גנים.
איור 1 : FACS מיון נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה מן mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) Gating רצופים מציגה מבחר רציף של תאים כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה אותרו בהתאמה על ידי DsRed ו- GFP מכתים חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : הביטוי מפענוח pcna ו β-אקטין נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה. יכול להיות עיבד RNA נוירונים בודדים, מקרופאגים/מיקרוגלייה לתוך cDNA לשימוש בניתוח ה-PCR כמותי. mRNA רמות הביטוי של pcna נגד β-אקטין ג'ין משק בית מבודד נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה נקבעים על-ידי qPCR (N = 3). קיפול שינוי נמדדה באמצעות השיטה השוואתי (ΔΔCT). שגיאה בר לייצג זאת אומרת ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : FACS מיון עבור מיקרוגלייה מ 3 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) תאים רצופים המגביל הצג רציפים מבחר כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) מיקרוגלייה זוהו על ידי 4C 4 מכתים חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : מיקרו-נים תוצאות אלקטרופורזה של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה דג זברה dpf 5. שתי הפסגות גבוה הן ribosomal RNA 18S, 28S. RNA תקינות מספר (RIN) היה מחושבים באופן אוטומטי על ידי תוכנת bioanalyzer באמצעות היחס שנוצר את 18S, 28S ribosomal subunits וניתוח של האיתור electrophoretic כולו. מיקרוגלייה RNA יש של 8.6 רין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : בדיקות האיכות והכמות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה. התמונה מציגה cDNA פרגמנט גודל להתפלגות המדגם שנותחה בגודל אכזרי של 299 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| תנאי | ניסוי | מספר דגים | מספר הטלפון הנייד | מספר הטלפון הנייד לכל דג | ריכוז ה-RNA (pg/ul) | סה כ RNA (עמוד) | כמות ה-RNA בכל תא (עמוד) | רין ניקוד |
| 3dpf | 1 | 700 | 11922 | 17.03 | 126 | 1512 | 0.13 | 8 |
| 3dpf | 2 | 600 | 22527 | 37.55 | 253 | 3036 | 0.13 | 7.9 |
| 3dpf | 3 | 600 | 18688 | 31.15 | 255 | 3060 | 0.16 | 7.7 |
| 3dpf | 4 | 600 | 11121 | 18.54 | 189 | 2268 | 0.20 | 7.8 |
| 3dpf | 5 | 600 | 15581 | 25.97 | 131 | 1572 | 0.10 | 8.4 |
| 3dpf | 6 | 600 | 11965 | 19.94 | 256 | 3072 | 0.26 | 8.2 |
| 5dpf | 1 | 600 | 58629 | 97.72 | 362 | 4344 | 0.07 | 7.4 |
| 5dpf | 2 | 600 | 32510 | 54.18 | 348 | 4176 | 0.13 | 8.1 |
| 5dpf | 3 | 600 | 77884 | 129.81 | 594 | 7128 | 0.09 | 8.3 |
| 5dpf | 4 | 600 | 50755 | 84.59 | 305 | 3660 | 0.07 | 8.6 |
| 5dpf | 5 | 600 | 44967 | 74.95 | 134 | 1608 | 0.04 | 7.6 |
| 5dpf | 6 | 600 | 51031 | 85.05 | 163 | 1956 | 0.04 | 7.9 |
| 7dpf | 1 | 600 | 60496 | 100.83 | 183 | 2196 | 0.04 | 7.6 |
| 7dpf | 2 | 450 | 55517 | 123.37 | 183 | 2196 | 0.04 | 7.8 |
| 7dpf | 3 | 600 | 88897 | 148.16 | 465 | 5580 | 0.06 | 8.1 |
| 7dpf | 4 | 600 | 63008 | 105.01 | 356 | 4272 | 0.07 | 8.4 |
| 7dpf | 5 | 350 | 34956 | 99.87 | 245 | 2940 | 0.08 | 8.1 |
| 7dpf | 6 | 600 | 63887 | 106.48 | 341 | 4092, שעות | 0.06 | 7.8 |
טבלה 1: סיכום של בידוד מיקרוגלייה ו RNA חילוץ נתונים הזחלים דג זברה dpf 3, 5, 7.
| מזהה דגימה פנימי | זיהוי הדגימה חיצוני | קיוביט (ng/ul) | Qubit(ng/ul) | ריכוז ממוצע (ng/ul) | נפח (ul) | ug התקבל | עובר או נכשל עבור ריכוז מינימלי | עובר או נכשל עבור כמות minimim | עובר או נכשל עבור הכמות המומלצת |
| 10907SD0010 | 5 dpf (ניסוי 4) | 58.8 | 58.4 | 58.6 | 30 | 1.76 | לעבור | לעבור | לעבור |
| דרישות לדוגמה עבור הספרייה במכינה: | |||||||||
| הספרייה במכינה | כמות מינימלית (ng) | הכמות המומלצת (ng) | Ng ריכוז מינימלי/uL... | ||||||
| ננו TruSeq ג'ל חינם 350 bp הוסף ספריית cDNA | 600 | 1100 | 10 | ||||||
טבלה 2: כמות בדיקות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה.
Discussion
פרוטוקול נסיוני המתוארים כאן מייצג שיטה חזקה ויעילה כדי לבודד תאי מוח של דג זברה הזחלים 3 כדי 8 dpf. חשוב, זה הפרוטוקול הראשון המאפשר הבידוד ספציפי של מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. הפרוטוקול נועד כדי לשמר את שלמות קרום התא כדי למזער את השינויים פוטנציאלי של ביטוי גנים שאירעו במהלך העיבוד. הנקודה האחרונה חיונית הרלוונטיות של תוצאות בהתבסס על הניתוח של פרופילים מבודדים אלה גנומית הסלולר. אכן, קיטוב מיקרוגלייה ו מקרופאג חריפה מושפעים microenvironment שלהם. ב 37 מעלות צלזיוס, תאים אלה הייתי משנה שלהם פרופיל ביטוי גנטי בתגובה לתנאי הניסוי (פציעה (חיתוך) תגובה). לכן, זה היה חיוני לבצע את הניסוי הזה ב 4 ° C לפני החילוץ RNA, להאט תהליכים תאיים ופעילויות מטבולית. יתר על כן, המגון רקמת המוח מכני ב 4 ° C נבחר במקום עיכול אנזימטי רקמות ב 37 ° C כדי למנוע כל השפעה על ביטוי גנים פרופילים.
חשוב להדגיש כי שיטה זו היא מהירה מאוד; תוך יום מספר אוכלוסיות של תאי המוח יכול להיות מבודד לפחות שני תנאים ניסויים שונים ו- RNA שלהם שחולצו. האורך הכולל של הפרוטוקול תלוי המספר של הזחלים משמש עבור כל תנאי חיתוך של ראשי הזחל הוא הצעד המגביל (∼ 350 ראשי/h). באופן כללי, כדי לעבוד עם מיקרוגלייה 3, 5 ו-7 dpf מומלץ transect ∼ ראשי 600 לכל מבחן כדי לקבל מספיק RNA לחלץ (טבלה 1). מיקרוגלייה מייצגים את סוג התא עם הנמוך ביותר תשואה (כ – 112 תאים לכל ראש-7 dpf), ניתן לצמצם את מספר ראשי עבור סוגי תאים אחרים כולל מקרופאגים (כ – 170 תאים לכל ראש-7 dpf).
יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי ברגע הגדרות ב סדרן FACS הוקמו, באותן ההגדרות יכול לשמש לניסויים שונים. נצפתה כי אוכלוסיות תאים מתאימים באופן מושלם מהניסוי אחד אחר עם שערים תוכנן בעבר, מציג את הפארמצבטית הניסויים בשיטה זו.
חיסרון קל של שיטה זו הוא כמות נמוכה יחסית של RNA האיסוף. אולם, מגבלה זו היא יותר עניין ביולוגי מאשר בעיה טכנית, כמו מספר מיקרוגלייה נמוכה מאוד בשלבים המוקדמים של התפתחות המוח (טבלה 1). בגלל זה כמות נמוכה של RNA שנאספו, הגברה צעדים שצריך לקחת בחשבון כדי לבצע ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום. למרבה המזל, השלבים הגברה לייצר כמויות מספיקות של cDNA באיכות גבוהה. לפיכך, שינויים כלליים של ביטוי גנים פרופילים של תאים מבודדים ניתן יהיה ללמוד.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה חזקה לבודד וללמוד סוגים שונים של תאים CNS מן המוח דג זברה זחל. זה ניתן להחיל כדי לרכוש הבנה מעמיקה יותר של תאים אלה במהלך הפיתוח גם כדי ללמוד את התפקיד שלהם למחלה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר קלייר דיוויס, ד ר ורוניק מירון (של המלכה Medical Research Institute, אדינבורו, נמצאת בליבה יונייטד) על דיונים הגישה ניסיוני ואת QMRI Flow Cytometry התא מיון מתקן ועזרה ראשונית. עבודה זו נתמכה על ידי סרטן מחקר בבריטניה הקריירה הממסד פרס כדי ד ר דרק Sieger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Hepes | Gibco | 15630-056 | |
| D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
| HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
| Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
| Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
| Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
| Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| 10 mL syringe | BD | 302188 | |
| Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
| 35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
| FACS tubes | BD | 352063 | |
| Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
| Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
| Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
| FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
| RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
| LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
| Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| RNaseZap | Ambion | AM9780 |
References
- Chrast, R., Scott, H. S., et al. The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals. Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).
- Beis, D., Stainier, D. Y. R. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).
- Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish. PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).
- Mazaheri, F., Breus, O., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nature Communications. 5, 1-11 (2014).
- Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish. Glia. 65 (1), 138-149 (2016).
- Hamilton, L., et al. A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo. Zebrafish. , (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Peri, F., Nüsslein-Volhard, C. Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Becker, T., Becker, C. G. Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).
- Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1464-1474 (2016).
- Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment. BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).
- Khuansuwan, S., Gamse, J. T. Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing. Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).
- Schmid, C. D., Melchior, B., et al. Differential gene expression in LPS/IFNγ activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Khan, A., Ju, F., et al. Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice. Neuroscience. 348, 212-227 (2017).
