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शब्द अपरा की भ्रूण झिल्ली से प्राथमिक मानव Decidual कोशिकाओं का अलगाव

Published: April 30, 2018 doi: 10.3791/57443
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto

Summary

इस प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव decidual शब्द अपरा जो अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की भ्रूण झिल्ली से एकत्र कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है (यानी immunocytochemistry, प्रवाह cytometry, आदि) का लक्ष्य गर्भावस्था जटिलताओं में अलग कोशिका आबादी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए ।

Abstract

decidua, यह भी गर्भवती अंतर्गर्भाशयकला के रूप में जाना जाता है, एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण प्रजनन ऊतक है । Decidual कोशिकाओं, decidualized stromal कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मुख्य रूप से शामिल, हार्मोनल और भड़काऊ कारकों जो सफल ब्लास्टोसिस्ट आरोपण, अपरा विकास और में एक भूमिका निभाने के लिए महत्वपूर्ण है के स्राव के लिए जिंमेदार हैं पद और अपरिपक्वता पर परिश्रम की दीक्षा । कई गर्भावस्था जटिलताओं decidua शामिल विभिंन कोशिका आबादी का एक अच्छा संतुलन के perturbations से पैदा कर सकते हैं । विशिष्ट decidual कोशिका प्रकार के अनुपात में परिवर्तन इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं को बाधित और गर्भावस्था की गंभीर जटिलताओं के विकास के जोखिम को बढ़ा सकता है, जैसे भ्रूण आरोपण विफलता, अंतर्गर्भाशयी विकास प्रतिबंध, preeclampsia और अपरिपक्व परिश्रम । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक लागत और प्राथमिक मानव decidual शब्द अपरा के भ्रूण झिल्ली से एकत्र कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रभावी विधि समय प्रदर्शित करता है । एंजाइमी पाचन और decidual ऊतक के कोमल यांत्रिक विघटन के संयोजन के द्वारा, decidual कोशिकाओं की एक उच्च उपज वस्तुतः कोई चोरियों संदूषण के साथ प्राप्त किया गया था । महत्वपूर्ण बात, अलग decidual कोशिकाओं (stromal कोशिकाओं (55-60%), ल्यूकोसाइट्स (३५%), उपकला (1%) या trophoblast (०.०१%) कोशिकाओं) की विशेषता थी और उच्च व्यवहार्यता (८०%) जो बहुरंगा इमेजिंग प्रवाह cytometry परख द्वारा पुष्टि की गई थी । इस प्रोटोकॉल decidua parietalis के लिए विशिष्ट है और पहली और दूसरी तिमाही अपरा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक बार अलग, decidual कोशिकाओं प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के एक भीड़ के लिए विभिंन decidual कोशिका उप की भूमिका को समझने के लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है गर्भावस्था जटिलताओं में आबादी ।

Introduction

अंतर्गर्भाशयकला, सबसे सक्रिय वयस्क महिला ऊतकों में से एक, डिम्बग्रंथि हार्मोन, एस्ट्रोजन (E2) और प्रोजेस्टेरोन (पी 4) द्वारा उत्तेजना के जवाब में एक मासिक धर्म चक्र नाटकीय ढंग से remodeling । decidua, भी गर्भवती अंतर्गर्भाशयकला के रूप में जाना जाता है, एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण प्रजनन ऊतक कि पी 4 के परिणाम के रूप में postovulatory चरण के अंत से बना है, E2-प्रमुख प्रफलन चरण के बाद भिंनता संचालित है । Decidual कोशिकाओं को सफल ब्लास्टोसिस्ट आरोपण के लिए हार्मोनल कारकों के स्राव के लिए और भ्रूण allograft के लिए मातृ सहिष्णुता बनाए रखने के लिए utero-अपरा इंटरफेस के विकास के लिए जिंमेदार हैं ।

Decidualization आरोपण के लिए आवश्यक है और decidual सर्पिल धमनियों के बाद remodeling । एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं decidualization से गुजरना, पी 4 और शिविर के नियंत्रण के तहत, मासिक धर्म चक्र1के देर से लुटियल चरण के दौरान । इस प्रक्रिया को रक्त वाहिकाओं के आसपास शुरू किया और स्ट्रोमा भर में फैलता है, vasculature remodeling और ल्युकोसैट तस्करी विनियमन में अपनी भूमिका का सुझाव है । इस सेलुलर परिवर्तन एक परिपत्र आकृति विज्ञान, वृद्धि की परमाणु आकार, और किसी न किसी endoplasmic जालिका और Golgi तंत्र2के विस्तार की विशेषता है । Decidualized stromal कोशिकाओं ब्लास्टोसिस्ट आरोपण का समर्थन paracrine कारकों का उत्पादन करने में सक्षम हैं और कई हार्मोन (यानी प्रोलैक्टिन) के स्राव की विशेषता, angiogenic वृद्धि कारकों, इंसुलिन वृद्धि कारक बंधन प्रोटीन-1 (IGFBP-1), प्रोस्टाग्लैंडीन (स्नातकोत्तर) ई (intracellular शिविर के उत्तेजित), साइटोकिंस, extracellular मैट्रिक्स अवयव और पोषक तत्वों अपरा आरोपण और विकास के लिए आवश्यक3,4,5,6 .

decidual कोशिका जनसंख्या केवल decidualized stromal कोशिकाओं के शामिल नहीं है, लेकिन यह भी बड़े, गर्भावस्था विशिष्ट decidual ल्युकोसैट आबादी होती है । Decidualization क्षणिक स्थानीयकृत शोफ और प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं, और मैक्रोफेज की आमद शामिल है । सबसे बड़ी ल्युकोसैट उपजनसंख्या गर्भाशय NK कोशिकाओं है, सभी मातृ ल्यूकोसाइट्स decidua जो साइटोकिंस और angiogenic कारकों में सहायता कर सकते है की एक स्रोत है घुसपैठ के लगभग 50-70% शामिल है और में वृद्धि गर्भावस्था के दौरान संख्या7। मैक्रोफेज, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की दूसरी सबसे बड़ी उपआबादी होने के नाते, आरोपण साइट के आसपास पाए जाते हैं और गर्भावस्था के दौरान वृद्धि8. वे साइटोकिंस और विकास कारकों जैसे कॉलोनी उत्तेजक कारक (सीएसएफ-1)9, ट्यूमर परिगलन कारक α (TNFα)10 और प्रोस्टाग्लैंडीन (स्नातकोत्तर) ई11के एक स्रोत हैं ।

गर्भावस्था के दौरान, और अवधि के परिश्रम से पहले, decidua साइटोकिंस और chemokines के एक प्रमुख स्रोत मातृ परिधीय ल्युकोसैट सक्रियण और गर्भाशय के ऊतकों में बाद में प्रवास के लिए श्रम शुरू करने के लिए जिंमेदार है । पशु अध्ययन से पता चला है कि कई समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस है अप-श्रम के दौरान माउस decidua में विनियमित, जैसे TNF-a, il-6, il-12, और आईएल-1b12। मानव decidua में, समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस il-1b, il-6 और il-8 (मेजर न्युट्रोफिल chemoattractant) परिश्रम के दौरान उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शन के लिए परिश्रम में नहीं13की तुलना में । ये एक सक्रियकरण और decidual ऊतकों में ल्यूकोसाइट्स की आमद में स्रावित साइटोकिंस परिणाम14; दोनों मानव और चूहे में decidual मैक्रोफेज और न्युट्रोफिल घुसपैठ में वृद्धि की अवधि के परिश्रम के दौरान देखा जाता है, decidual myometrial पूर्ववर्ती घुसपैठ के साथ 4 गुना अधिक, इस दो आसंन गर्भाशय के ऊतकों के बीच सक्रियण का एक झरना का संकेत है 15. ये घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स PGs myometrium16, मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs) के तुल्यकालिक संकुचन को सक्रिय करने के लिए झिल्ली टूटना17,18शुरू करने में सक्षम उत्पादन, साथ ही प्रो भड़काऊ साइटोकिंस गर्भाशय सक्रियकरण प्रक्रिया (' cytokine स्टॉर्म ') बढ़ाना ।

decidual कोशिकाओं के कई महत्वपूर्ण कार्यों के कारण, इस तरह के आरोपण की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, जल्दी हमल में मातृ-भ्रूण सहिष्णुता को बनाए रखने और पद पर श्रम के सक्रियकरण में भाग लेने के रूप में, विभिन्न विकृतियों के दौरान पैदा कर सकते हैं गर्भावस्था. उदाहरण के लिए, (1) आवर्तक आरोपण विफलता और आवर्तक गर्भावस्था हानि के कारण बांझपन decidual परिपक्वता की विफलता से परिणाम कर सकते हैं; (2) अंतर्गर्भाशयी वृद्धि प्रतिबंध (IUGR) और preeclampsia-decidual जंक्शन पर decidua/अपरा या समझौता संवहनी परिवर्तन के अनुचित विकास और शिथिलता के कारण; साथ ही (3) अपरिपक्व जन्म जो समयपूर्व decidual सक्रियण से परिणाम कर सकते हैं ।

इन प्रमुख विकारों के प्रकाश में vivo अध्ययनों में मानव की नैतिक और व्यावहारिक सीमाओं के साथ युग्मित, प्राथमिक मानव decidual सेल लाइनों की स्थापना के लिए इन विट्रो विश्लेषण के लिए आवश्यक है बेहतर समझने के प्रयोजन के साथ और गर्भावस्था जटिलताओं के नैदानिक प्रबंधन में सुधार. इसलिए, हमारे अनुसंधान का उद्देश्य एक प्रोटोकॉल है जो उच्च कोशिका उपज और अवधि के भ्रूण झिल्ली से एकत्र व्यवहार्यता के साथ मानव प्राथमिक decidual कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुमति देता है विकसित किया गया था । इस वर्तमान प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से एक समय का वर्णन है और लागत प्रभावी विधि decidual कोशिकाओं है जो की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा के विशिष्ट उपप्रकार के अलग करने के लिए इन विट्रो विश्लेषण में । बहुतायत और decidual उप के phenotype के लक्षण वर्णन-अवधि और पहली या दूसरी तिमाही की तुलना में आबादी को मानव हमल भर में अपनी भूमिकाओं को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Protocol

अपरा स्वस्थ अवधि से एकत्र कर रहे हैं, नहीं श्रम महिलाओं में वैकल्पिक सीजेरियन वर्गों के दौर से गुजर । मानव नमूनों के संकलन, प्रसंस्करण, और प्रयोज्यता का पालन माउंट सिनाई अस्पताल एथिक्स बोर्ड के दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाता है । प्रत्येक रोगी से लिखित सहमति प्राप्त की जाती है । इस अध्ययन को माउंट सिनाई अस्पताल में रिसर्च एथिक्स बोर्ड ने मंजूरी दी है.

1. तैयारी

नोट: सभी कदम एक धुएं हुड के तहत आयोजित किया जाना चाहिए और सभी शल्य चिकित्सा उपकरण आटोक्लेव के माध्यम से निष्फल होना चाहिए पहले धुएं डाकू में स्थान के लिए । अंय सभी सामग्रियों (बोतलें, ५० मिलीलीटर ट्यूब, आदि) ७०% इथेनॉल समाधान के साथ निष्फल किया जाना चाहिए । हमेशा सभी समय पर व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनते हैं, जब (लैब कोट, दस्ताने, लंबे बाल बंधे वापस, आदि) के साथ काम कर रहे हैं ।

  1. एंजाइमी पाचन समाधान (अंतिम समाधान: २०० mL)
    1. पिपेट १८० मिलीलीटर की HBSS-/एक ५०० मिलीलीटर चोंच में, बाँझ सरगर्मी चुंबक और कमरे के तापमान पर सरगर्मी प्लेट पर जगह जोड़ें ।
    2. बाहर तौलना और HBSS-/-समाधान धीरे और क्रमिक रूप से जोड़ने के लिए निंनलिखित: FBS के 20 मिलीलीटर, ४०० मिलीग्राम Collagenase 2 ([अंतिम] = 2 मिलीग्राम/एमएल), 20 मिलीग्राम सोया बीन trypsin अवरोध करनेवाला ([अंतिम] = 0.1 मिलीग्राम/एमएल), 30 मिलीग्राम DNase 1 ([अंतिम] = ०.१५ मिलीग्राम/एमएल), और २०० मिलीग्राम BSA ([अंतिम] = 1 मिलीग्राम/
    3. मध्यम गति के लिए सरगर्मी सेट, और मिश्रण 10-20 मिनट के लिए हलचल करने की अनुमति (टिन पंनी या तेल फिल्म के साथ कवर करते हुए सरगर्मी) ।
    4. एक प्लास्टिक कीप और धुएं हुड में जगह का उपयोग कर एक २५० मिलीलीटर कांच की बोतल में मिश्रित समाधान डालो ।
    5. एक प्लास्टिक शीर्ष निस्पंदन यूनिट के माध्यम से समाधान पास (०.२२ माइक्रोन झिल्ली फिल्टर, ५०० मिलीलीटर), aliquot में 20 मिलीलीटर ५० मिलीलीटर ट्यूबों (10 ट्यूबों कुल) और में स्टोर-20 ° c उपयोग तक ।
  2. RPMI १६४० मीडिया (2% धुलाई समाधान और 10% पूर्ण विकास मध्यम)
    1. गठबंधन RPMI १६४० और धुएं डाकू में एक गिलास की बोतल में FBS ।
    2. 2% FBS समाधान के लिए, RPMI १६४० और 10 मिलीलीटर FBS के ४९० मिलीलीटर गठबंधन ।
    3. 10% FBS समाधान के लिए, गठबंधन ४५० मिलीलीटर RPMI १६४० और ५० मिलीलीटर FBS ।
    4. पिपेट ५०० RPMI मीडिया और FBS युक्त पिछले कदम से ५०० मिलीलीटर कांच की बोतल में normocin की μL (५० मिलीग्राम/एमएल स्टॉक, ०.०५ मिलीग्राम/
    5. एक ०.२२ माइक्रोन झिल्ली फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ५०० मिलीलीटर कांच की बोतल में स्टोर के माध्यम से उपयोग तक मीडिया पास ।
  3. 30 मिनट प्रयोग शुरू करने से पहले, एक ३७ डिग्री सेल्सियस मनका स्नान में जमे हुए एंजाइमी पाचन समाधान के एक 20 मिलीलीटर aliquot जगह, 2% FBS और 10% FBS RPMI १६४० मीडिया एक ३७ ° c मनका स्नान में जगह है, कमाल का पानी स्नान पर बारी और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए सेट , 2 जी, और एक तापमान नियंत्रित करने के लिए सेट 4 ° c ।

2. टर्म अपरा झिल्ली से Decidual ऊतक का संग्रह

  1. HBSS के साथ प्लेस बोतलों +/+, HBSS-/-और ५ ५० मिलीलीटर ट्यूबों धुएं डाकू के तहत एक रैक में । एक ट्यूब में पिपेट 25 मिलीलीटर HBSS +/
  2. दस्ताने हाथों का प्रयोग, यह ऑपरेटिंग कमरे थिएटर से परिवहन के लिए इस्तेमाल किया कंटेनर से बाहर शब्द अपरा ले । नाल को डायपर पैड पर रखें (मातृ पक्ष को ऊपर) और कैंची और संदंश का उपयोग कर बाहर भ्रूण झिल्ली फैल ।
    1. धुएं हुड पर अतिव्यापी डायपर पैड रखना ।
    2. अपरा फ्लिप करने के लिए एक अलग डायपर का प्रयोग करें ताकि मातृ पक्ष आमने-सामने हो ।
    3. झिल्ली टूटना के बिंदु का पता लगाएं और झिल्ली प्रकट करना और fumehood सतह पर फ्लैट रखना करने की अनुमति के लिए चीरा बनाने ।
      नोट: एक बार झिल्ली वापस अपरा से खींच लिया है, decidua घर का काम परत पर आराम कर, पीठ पर amnion परत के साथ सामना किया जाएगा ।
  3. एक प्लास्टिक सेल खुरचनी का उपयोग करना, ध्यान से चोरियों और ५० एमएल ट्यूब 25 मिलीलीटर HBSS युक्त में जगह से decidual ऊतक परिमार्जन +/
  4. मध्यम दबाव के साथ झिल्ली परिमार्जन । बहुत अधिक दबाव लागू नहीं है क्योंकि यह चोरियों दूषण में परिणाम हो सकता है । छोटे रक्त के थक्के भी इकट्ठा करें, क्योंकि इनमें कुछ decidual कोशिकाएं शामिल हैं ।
    चेतावनी: decidual संग्रह के बाद, अपरा एक खतरा प्लास्टिक बिन में पैक किया जाना चाहिए और एक-20 ° c फ्रीजर में जमे हुए उचित निपटान से पहले (अपने संस्थागत नियमों के अनुसार) । खूनी डायपर पैड एक सील तंग प्लास्टिक बैग में लिपटे होना चाहिए और एक गैर-खतरों सुरक्षा बॉक्स में से निपटा ।

3. Decidual ऊतक के धोने और एंजाइमी पाचन

  1. धीरे हाथ से ५० मिलीलीटर ट्यूब मिलाते हुए और यह एक २५० माइक्रोन धातु छलनी (२५० माइक्रोन, आकार ६० मेष) एक बाँझ नमूना (मूत्र) कंटेनर पर आराम के माध्यम से गुजर द्वारा एकत्र ऊतकों को धो लें ।
  2. एक धोने के लिए ताजा ट्यूबों में HBSS-/-के साथ दो बार HBSS +/ (HBSS के साथ अंतिम बहाकर HBSS +/+ में मौजूद कैल्शियम और मैग्नीशियम को हटाने के लिए अनुमति देता है, जो अंयथा निंनलिखित एंजाइमी पाचन प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप करेगा) ।
    नोट. धोने के कदम के दौरान, चोरियों ऊतक संदूषण स्पष्ट हो जाएगा के रूप में decidual ऊतक रंग में हल्के गुलाबी और अमली है, जबकि चोरियों सफेद, घने, और रेशेदार है । इसलिए संदंश के साथ चोरियों का संदूषण आसानी से निकाला जा सकता है ।
  3. वैकल्पिक रूप से, यदि decidual ऊतक मोटी है, यह एक बाँझ 10 सेमी व्यास पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण और पकवान में दो नश्तर का विरोध के साथ ऊतक के कीमा के लिए आगे बढ़ना ।
  4. में धोया ऊतक प्लेस बाँझ ५० एमएल ट्यूब युक्त एंजाइमी पाचन समाधान की ऊतक/एमएल के १०० मिलीग्राम (तैयारी देखें) ।
    1. एक संदर्भ बिंदु के रूप में, सुनिश्चित करें कि decidual ऊतक के स्तर ५० एमएल ट्यूब पर 5-10 मिलीलीटर के निशान तक पहुंचता है ।
    2. कुल decidua एक पूरे शब्द भ्रूण झिल्ली से एकत्र पचाने के लिए एंजाइमी पाचन समाधान के लगभग 20 मिलीलीटर (चरण १.१ में तैयार) का उपयोग करें ।
  5. आयल फिल्म के साथ ट्यूब की टोपी सील (कस ट्यूब सील और टोपी और ट्यूब के ऊपर के आसपास तेल फिल्म लपेटो) संस्कृति हूड और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मिलाते हुए पानी स्नान में 20 मिनट के लिए decidual ऊतक मशीन के नीचे (१४५ rpm , 2 छ) ।
  6. मशीन के बाद, आयल फिल्म को हटाने और ७०% इथेनॉल के साथ पचा ऊतक युक्त ट्यूब की सतह को निष्फल और धुएं हुड के नीचे लाने के लिए । हाथ से ट्यूब संक्षेप में हिला ।
  7. एक नया बाँझ नमूना कंटेनर में धातु छलनी (२५० माइक्रोन, आकार ६० मेष) के माध्यम से सेल निलंबन ले लीजिए । एंजाइमी रिएक्शन रोकने के लिए ०.१% normocin युक्त RPMI + 10% FBS के बराबर वॉल्यूम (20 mL) के साथ पतला करें । सीधे आगे बढ़ना कदम ४.१ ।
  8. यदि आवश्यक हो, ताजा एंजाइमी पाचन समाधान और दोहराने पाचन के 20 मिलीलीटर के साथ एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में वापस शेष अपच ऊतक जगह (20 मिनट, ३७ डिग्री सेल्सियस, पानी स्नान मिलाते हुए) ।
  9. यदि एक दूसरे पाचन आवश्यक है, बर्फ पर सेल निलंबन के साथ पहली ट्यूब जगह (तेल फिल्म के साथ कवर बाँझ रखने के लिए) । चरण 3.5-3.6 दोहराएं और दो कक्षों के निलंबन को संयोजित करें ।

4. एक सिंगल सेल सस्पेंशन जनरेट कर रहा है

  1. सेल सस्पेंशन (४२० g, 4 ° c, 11 min) के केंद्रापसारक ।
  2. supernatant निकालें और RPMI + 2% FBS ०.१% normocin ("धो बफर") युक्त के ४० मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    नोट: सेल गोली ढीला और लाल रक्त कोशिका संदूषण के कारण चिपचिपा हो जाएगा, सावधानी के साथ महाप्राण supernatant । एक मैनुअल पिपेट के साथ ऊपरी चरण को हटाने की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. ४२० g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक 11 मिनट के लिए दोहराएं ।
  4. ध्यान से निकालें supernatant (के रूप में नोट चरण ४.२ में उल्लेख किया है) और धो बफर के 5 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड और एक ही ट्यूब में एरिथ्रोसाइट lysis बफर के ३५ मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: यदि गोली बड़ी या बहुत खूनी है, यह एरिथ्रोसाइट lysis कदम के लिए दो ट्यूबों में धो बफर के 10 मिलीलीटर जोड़कर विभाजित किया जा सकता है और समान रूप से दो ट्यूबों में विभाजित और फिर एक ट्यूब के लिए एरिथ्रोसाइट lysis बफर के ३५ मिलीलीटर जोड़ने ।
  5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन संक्षेप भंवर ट्यूब (ओं) शुरुआत में और लाल रक्त कोशिकाओं को लाइसे के लिए मशीन के अंत ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 11 मिनट के लिए ४२० ग्राम में केंद्रापसारक ।
  7. ध्यान से, supernatant निकालें और धो बफर के ४० मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  8. सेल के झुरमुट को हटाने के लिए एक ७० माइक्रोन नायलॉन फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं को पारित ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 11 मिनट के लिए ४२० ग्राम में केंद्रापसारक ।
  10. supernatant निकालें और पूरा मध्यम (RPMI 10% + FBS ०.१% normocin युक्त) के 10 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड ।
  11. नीचे वर्णित के रूप में trypan ब्लू डाई-अपवर्जन hemocytometer प्रक्रिया का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना:
    1. संस्कृति हुड के तहत धीरे पिपेट सेल निलंबन ऊपर और क्रम में अच्छी तरह से trypan नीले रंग के साथ संयोजन से पहले मिश्रण करने के लिए 3x नीचे । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सेल सस्पेंशन तैयार, 1:2 पतला (trypan ब्लू समाधान के 20 μL और decidual सेल निलंबन के 20 μL गठबंधन) । ध्यान से मिश्रण trypan ब्लू सेल समाधान ऊपर और नीचे pipetting द्वारा बार की एक जोड़ी (इस समाधान बाँझ नहीं है).
    2. शीर्ष पर ग् coverslip के साथ माइक्रोस्कोप के स् टेज पर hemocytometer लगाएं ।
      नोट: Hemocytometer इस पर ग्रिड के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड को नौ बड़े वर्गों ट्रिपल लाइनों से विभाजित दे रहा है । प्रत्येक बड़े वर्ग के एक क्षेत्र है 1 मिमी2, और कक्ष में द्रव की गहराई ०.१ mm है । इसलिए, तरल पदार्थ है कि प्रत्येक बड़े वर्ग को भरने कर सकते हैं की मात्रा 1 मिमी * 1 मिमी * 0.1 मिमी = ०.१ मिमी3= 10-4 मिलीलीटर है ।
    3. धीरे hemocytometer की नाली में trypan ब्लू-सेल मिश्रण के 10 μL जोड़ने के लिए, केशिका कार्रवाई पूरी स्लाइड पर सेल मिश्रण फैलाने के लिए अनुमति (मिश्रण अच्छी तरह से भरता है पहले बंद) ।
    4. एक खुर्दबीन के नीचे (10x इज़ाफ़ा) और सभी सफेद/हरी कोशिकाओं है कि trypan ब्लू बाहर की गिनती (इन व्यवहार्य कोशिकाओं रहे हैं) hemocytometer के चार बड़े बाहरी वर्गों में कोशिकाओं को देखें । जब गिनती कोशिकाओं है कि लाइन को छूने, केवल उन है कि सही और ऊपरी लाइनों को छूने पर उन नहीं छोड़ दिया और नीचे लाइनों छू गिनती । डार्क ब्लू कोशिकाओं गिनती मत करो; ब्लू रंग इंगित करता है कि कोशिका trypan ब्लू डाई के रूप में मर गया है आसानी से कोशिका द्रव्य में प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से घुसना कर सकते हैं ।
    5. सेल निलंबन (एक्स) के 1 मिलीलीटर में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए:
      Equation
      2 = कमजोर पड़ने फैक्टर
      १०,००० = रूपांतरण कारक (1 मिलीलीटर = 1 सेमी3 = 10000 * 0.1 mm3)
  12. RPMI में एक वांछनीय अंतिम एकाग्रता के लिए decidual कोशिकाओं को पतला + 10% FBS (विकास माध्यम) ।
    नोट: ऊतक संस्कृति चढ़ाना के लिए, पिपेट 2 * 106 कोशिकाओं में एक प्लास्टिक 6 अच्छी तरह से थाली, 10 * 106 कोशिकाओं में एक 10 सेमी प्लास्टिक की थाली या एक गिलास coverslip करने के लिए ७५,००० कोशिकाओं में ।

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Representative Results

अलग कोशिकाओं की दक्षता और व्यवहार्यता को मांय करने के लिए, वे दो तरीकों की विशेषता थी: फ्लो cytometry और immunocytochemistry (आईसीसी) । 4 सेल की आबादी को निशाना बनाया गया; एंटी-vimentin एंटीबॉडी द्वारा decidualized stromal कोशिकाओं का पता लगाया गया, पैन-ल्युकोसैट मार्कर CD45 decidual प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, cytokeratin उपकला/endothelial कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और अंत में, cytokeratin 7 किसी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया संभावित trophoblast (चोरियों या अपरा) का संदूषण ।

बहुरंगा इमेजिंग प्रवाह cytometry द्वारा लक्षण वर्णन के लिए, हौसले से पृथक decidual कोशिकाओं सेलुलर व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए एक fixable डाई के साथ दाग थे । कोशिकाओं permeabilized और स्थिर थे, fluorochrome-संयुग्मित माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी लक्ष्यीकरण vimentin-apc, CD45-apc-H7, cytokeratin-FITC और cytokeratin 7-PerCP के साथ दाग के बाद । एंटीबॉडी जानकारी सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध है । फिक्स्ड और सना हुआ कोशिकाओं 4 ° c पर रात भर बफर धुंधला में संग्रहीत करने के लिए मिलकर डाई के पृथक्करण को रोकने और छवि स्ट्रीम MK2 इमेजिंग फ्लो cytometer पर अगले दिन चला रहे थे । विश्लेषण एक सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था । सेल मलबे और समुच्चय तीन अनुक्रमिक सुविधा/मास्क संयोजन (चित्र 1a-B) का उपयोग कर सीरियल गेटिंग द्वारा बाहर रखा गया था । प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) गेटिंग नियंत्रण सकारात्मक decidual कोशिका आबादी और एकल दाग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया मुआवजा (चित्रा 2) के लिए इस्तेमाल किया गया । अंतिम डॉट भूखंडों चार मार्करों (चित्रा 2) और ८०% की सेलुलर व्यवहार्यता (चित्रा 1C) के सकारात्मक रूप से सना हुआ सेल जनसंख्या का प्रदर्शन । सकारात्मक रूप से सना हुआ कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 1 डीमें देखा जा सकता है । इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने पाया है कि जनसंख्या मुख्य रूप से stromal कोशिकाओं (55-60%), ल्यूकोसाइट्स (३५%), उपकला (1%) या trophoblast (०.०१%) कोशिकाओं (चित्रा 1E) के शामिल हैं । प्रयोग तीन बार दोहराया गया । इन परिणामों की शुद्धता की पुष्टि (चोरियों से trophoblast संदूषण की अनुपस्थिति) और प्राथमिक मानव decidual कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता एकत्र और शब्द अपरा के भ्रूण झिल्ली से अलग ।

एक अलग आईसीसी प्रयोग में, हौसले से पृथक decidual कोशिकाओं कांच coverslips (७५,००० कोशिकाओं/coverslip) पर वरीयता प्राप्त थे, संलग्न करने के लिए अनुमति दी है और ४८ घंटे के लिए संस्कृति में बने रहे । गैर-अनुलग्न मृत कक्षों को निकालने के लिए 24 घंटे बाद मीडिया परिवर्तित किया गया था । कोशिकाओं तो ५०% एसीटोन-५०% मेथनॉल, ०.०२% गैर ईओण surfactant और विशिष्ट बंधन के साथ permeabilized अवरुद्ध समाधान के साथ अवरुद्ध किया गया था के साथ तय किया गया । कोशिकाओं तो माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग थे: विरोधी CD45 (पैन-ल्युकोसैट मार्कर), विरोधी cytokeratin (उपकला कोशिका मार्कर) और विरोधी cytokeratin 7 (trophoblast मार्कर), और बकरी polyclonal विरोधी vimentin एंटीबॉडी (stromal सेल मार्कर). गधा विरोधी बकरी और गधा विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया । DAPI को नाभिक के दाग का इस्तेमाल किया गया । माउस आईजीजी, बकरी आईजीजी और माध्यमिक अकेले एंटीबॉडी नकारात्मक और विशिष्टता नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । छवियां एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप पर 20X आवर्धन पर ले जाया गया । इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं और प्रतिनिधि छवियों चित्रा 3में प्रस्तुत कर रहे हैं. हमारे दृश्य अवलोकन से पता चलता है कि संलग्न प्राथमिक decidual कोशिकाओं के बहुमत vimentin पॉजिटिव stromal कोशिकाओं (लगभग ९५%), ल्यूकोसाइट्स की एक छोटी संख्या के साथ (लगभग 1-2%), उपकला (लगभग 1%) और trophoblast कोशिका आबादी (एकल कोशिकाओं थे सभी के < 0.01% के लिए लेखांकन का पता लगाया है) । प्रवाह cytometric और आईसीसी परिणामों के बीच प्रमुख अंतर CD45 सकारात्मक ल्युकोसैट जनसंख्या प्रवाह cytometry द्वारा पता लगाया में कमी है । इस विसंगति को उन पद्धतियों द्वारा समझाया जा सकता है जिनमें दो प्रयोग किए गए थे: प्रवाह cytometry विश्लेषण में पृथक decidual कोशिकाओं को तुरंत प्रोसेस किया गया और दाग लगाया गया, जिसका अर्थ ल्युकोसैट जनसंख्या विश्लेषण में शामिल था. आईसीसी के साथ, कुल decidual सेल निलंबन चढ़ाया और stromal और उपकला कोशिकाओं के लगाव का समर्थन कर रहा था कि ज्यादातर मीडिया में ४८ घंटे के लिए संस्कृति, लेकिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं नहीं था. 24 एच के बाद प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि संलग्न नहीं थे मीडिया परिवर्तन के दौरान हटा दिया गया, इन दो विधियों द्वारा प्रस्तुत परिणामों में अंतर के लिए लेखांकन । हम निष्कर्ष निकाला है कि जटिल गर्भधारण से मानव decidua में ल्युकोसैट उप आबादी के अध्ययन के लिए विशेष एहतियात ल्युकोसैट जनसंख्या के आकस्मिक उंमूलन से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: decidual सेल जनसंख्या भेदभाव के लिए गेटिंग रणनीति । (A) ताज़ा पृथक निश्चित decidual कक्ष प्रारंभ में कक्ष दोहरी को छोड़ने के लिए gated गए थे, और (B) बाद में कक्ष मलबे को छोड़ने के लिए तीन क्रमिक सुविधा/मास्क संयोजनों का उपयोग कर gated । (ग) जीवित कोशिकाओं (गुलाबी गेट, कुल जनसंख्या का ८०%) मृत कोशिकाओं से अलग किया गया (नीले गेट, कुल जनसंख्या का 20%) एक fixable व्यवहार्यता डाई का उपयोग कर । (घ) व्यवहार्यता मार्कर और चार फ्लोरोसेंट-संयुग्मित एंटीबॉडी (Ab) (vimentin-apc, CD45-apc-H7, cytokeratin-FITC और cytokeratin 7-PerCP) के साथ सना हुआ decidual कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों । बिंदीदार स्केल बार 7 माइक्रोन के बराबर होती है । (ङ) एक बार एक मलबे से मुक्त, लाइव सेल जनसंख्या निर्धारित किया गया था, इन मार्करों decidual सेल जनसंख्या के भीतर प्रत्येक कोशिका प्रकार के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. आंकड़े 1b और 1Cके लिए, प्रत्येक बिंदु एकल decidual कक्ष का प्रतिनिधित्व करता है । आंकड़े 1a और 1Cके लिए, डॉट भूखंडों के रंग रेंज कोशिका घनत्व को दर्शाया गया है, लाल के साथ अत्यधिक घने कोशिकाओं और कोशिकाओं के नीले कम घने वाचक । यहां प्रस्तुत डेटा 3 जैविक प्रतिकृति के प्रतिनिधि है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: FMO गेटिंग भूखंडों के साथ प्राथमिक मानव decidual कोशिकाओं का Representativeflow cytometric विश्लेषण. प्रतिनिधि रंग बिंदु decidua से अलग कोशिकाओं के भूखंडों डॉट और के साथ सना हुआ (A) vimentin-APC (stromal सेल मार्कर), (ख) CD45-सुरक्ष-H7 (ल्युकोसैट मार्कर), (ग) cytokeratin-FITC (उपकला कोशिका मार्कर) और (घ) cytokeratin 7-PerCP (trophoblast मार्कर) प्रत्येक संबंधित FMO नियंत्रण के साथ । फ्लोरोसेंट-शूंय से एक (FMO) नियंत्रण, ट्यूब, जो पूर्ण एंटीबॉडी कॉकटेल शूंय से प्रश्न में मार्कर और पूरी तरह से दाग प्रयोगात्मक नमूना को हूबहू तैयार होते हैं, प्रवाह cytometry डेटा विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया गया सच सकारात्मक निर्धारित decidual कोशिका आबादी । FMO नियंत्रण रिश्तेदार पृष्ठभूमि दिखाने के लिए और सही सकारात्मक संकेतों के सटीक गेटिंग के लिए अनुमति देते हैं । यहां प्रस्तुत डेटा 3 जैविक प्रतिकृति के प्रतिनिधि है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: प्राथमिक मानव decidual कोशिकाओं के प्रतिनिधि Immunocytochemical विश्लेषण । प्राथमिक मानव decidual कोशिकाओं ४८ ज के लिए ग्लास coverslips पर बड़े हो गए थे, 24 घंटे के बाद मीडिया परिवर्तन के साथ कोशिकाओं एसीटोन-मेथनॉल और मोनोक्लोनल माउस विरोधी CD45 (ल्युकोसैट मार्कर), विरोधी cytokeratin (उपकला कोशिका मार्कर) के साथ दाग के साथ तय किया गया था और एंटी-cytokeratin 7 (trophoblast मार्कर) एंटीबॉडी, और बकरी polyclonal एंटी-vimentin एंटीबॉडी (stromal सेल मार्कर) । प्रतिनिधि छवियां दिखाएं (क) vimentin-सकारात्मक fibroblasts (माध्यमिक abs: गधा विरोधी बकरी), (ख) CD45 + ल्यूकोसाइट्स (माध्यमिक abs: गधा विरोधी माउस), (ग) cytokeratin सकारात्मक उपकला कोशिकाओं (माध्यमिक abs: गधा विरोधी माउस) और (D) cytokeratin 7-सकारात्मक trophoblast कोशिकाओं (माध्यमिक Abs: गधा विरोधी माउस) का पता लगाया गया (लाल दाग) । DAPI धुंधला करने के लिए कोशिकाओं के नाभिक डाई (नीले दाग) का इस्तेमाल किया गया था । गैर विशिष्ट माउस और बकरी आईजीजी (एम आईजीजी और जी आईजीजी) नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया, प्राथमिक Abs छोड़ माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण (एम 2एन डी केवल और जी 2एन डी केवल) के रूप में इस्तेमाल किया गया । छवियां एक DMI कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप पर 20X आवर्धन पर ले रहे हैं । स्केल बार्स = ३२ माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक लागत और समय प्रभावी प्राथमिक decidual पूरे मानव शब्द अपरा है कि अत्यधिक सुलभ और सीधा है की भ्रूण झिल्ली से एकत्र कोशिकाओं को अलग करने के लिए विधि प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल की सफलता दो महत्वपूर्ण कारकों पर निर्भर है, (1) भ्रूण झिल्ली की चोरियों की परत से स्क्रैप decidual की दक्षता और (2) देखभाल जिसके साथ decidual कोशिकाओं प्रोटोकॉल भर में संचालित कर रहे हैं । यह महत्वपूर्ण है कि चोरियों ऊतक संदूषण यह सुनिश्चित करना है कि कोई भी गलती से decidual परिमार्जन के दौरान शामिल है और की पहचान करने और धोने चरणों के दौरान किसी भी संदूषण को हटाने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है (decidua और चोरियों में अंतर आकृति विज्ञान जो गलती से decidua के साथ एकत्र किया जा सकता है चोरियों की आसान हटाने के लिए अनुमति देता है) । Decidual कोशिकाओं नाजुक इसलिए तेजी से कर रहे है और अक्सर pipetting कम व्यवहार्यता में परिणाम हो सकता है । हम सुझाव है, तो, कि पिपेट बेदखलदार गति सेटिंग धीमी और कम से कम pipetting रहना चाहिए जब कोशिकाओं मिश्रण इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

एक तरीके में जो इस प्रोटोकॉल trophoblast संदूषण रोकता है केवल अपरा के भ्रूण झिल्ली से decidua इकट्ठा करके है (decidua parietalis शामिल), decidua basalis जो बायोप्सी लेने के द्वारा किया जाता है के संग्रह को छोड़कर अपरा के मातृ पक्ष से । इसलिए, जबकि हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल हम अलग decidual कोशिका जनसंख्या की पवित्रता में सुधार, यह decidua के एक वर्ग को बाहर करता है (यानी decidua basalis) जो decidua के इस हिस्से को लक्षित अनुसंधान के लिए एक सीमा के रूप में मुद्रा हो सकता है या जब दोनों decidua के वर्गों की आवश्यकता है । इस अपवर्जन में इस अध्ययन की सबसे बड़ी सीमा शामिल है । इसके अलावा, जबकि मानव रोगियों से अलग decidual कोशिकाओं decidual और गर्भावस्था के अनुसंधान में एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक अंतर्दृष्टि के लिए अनुमति देता है, कम हेरफेर और कम समय अवधि के नैतिक कारणों की वजह से कुतर आधारित अध्ययन की तुलना में अध्ययन किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के दौरान, वहां कदम है जो कठिनाई पैदा साबित हो सकता है, और अगर ठीक से कम नहीं सेल उपज और व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं । circumnavigate करने के लिए, संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है । सबसे महत्वपूर्ण यह सुनिश्चित करने के लिए है कि भ्रूण झिल्ली के बंद परिमार्जन decidual पर्याप्त है (कदम २.४); मानव परिवर्तनशीलता के कारण, प्रत्येक अपरा decidual ऊतक, ऊतक स्थिरता और ऊतक सूखापन के स्तर की मात्रा के मामले में अलग हो सकता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि केवल decidua को हटाया जा रहा है परिमार्जन का नियमन करना जरूरी है. यदि decidua और झिल्ली सूखी हैं, तो पंजाबियों-/झिल्ली पर डाला जा सकता है आसान परिमार्जन के लिए अनुमति देते हैं । दूसरा चरण है decidual सेल के निलंबन (step ३.४) के एरिथ्रोसाइट lysis का । के रूप में उल्लेख किया है, अगर सेल गोली बहुत बड़ी है और रक्त की एक उच्च राशि शामिल है, गोली दो ट्यूबों में विभाजित किया जा सकता है lysing की क्षमता में सुधार होगा । अगर वहां अब भी कर रहे है लाल रक्त कोशिकाओं के बाद इस कदम वहां एक के लिए अधिक से अधिक ट्यूब में गोली विभाजन की जरूरत है अधिक कुशलता के लिए हो सकता है ।

जबकि अलग decidual अवधि अपरा और गैर गर्भवती महिलाओं से एंडोमेट्रियल कोशिका के अलगाव hysterectomies दौर से गुजर रहा है के अलगाव प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित किया गया है18,19, इन तरीकों विभिंन पता नहीं है सीमाएं, जैसे कम कोशिका व्यवहार्यता और आसंन ऊतक संदूषण । हम इन परिभाषित माना जाता है जब यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल डिजाइनिंग, जो अधिक से अधिक कोशिका उपज, वृद्धि की व्यवहार्यता और आसपास के ऊतकों से संक्रमण का खतरा कम करने के लिए सुराग । पहले, स्वचालित dissociations decidual ऊतक19,20को तोड़ने के लिए यांत्रिक रूप से इस्तेमाल किया गया है । इस विधि के रूप में यह एक जोरदार यांत्रिक पृथक्करण जहां decidual ऊतक एक ट्यूब में एकत्र की है, मशीन में डाला जो एक ब्लेंडर के लिए इसी तरह काम करता है जल्दी से कैंची घूर्णन द्वारा ऊतक को तोड़ने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप शामिल है अपेक्षाकृत कठोर है घटी हुई कोशिका व्यवहार्यता. हमारी नई विधि यहां वर्णित एक छोटी (20 मिनट) एंजाइमी कोमल कमाल का पानी स्नान के बजाय यांत्रिक शक्ति ऊतक के लिए लागू आंदोलनों के साथ संयुक्त पाचन को जोड़ती है । एंजाइमी पाचन समाधान कोशिका व्यवहार्यता और उपज में वृद्धि करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, युक्त (1) collagenase decidual ऊतक के extracellular मैट्रिक्स को पचाने के लिए; (२) एक सोयाबीन trypsin अवरोधक collagenase की एक शेष trypsinolytic गतिविधि के कारण गैर-विशिष्ट पाचन को रोकने के लिए; (3) DNase 1 मुक्त-अस्थायी डीएनए को हटाने के लिए (4) भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) प्रोटीन से अधिक पाचन कोशिकाओं की रक्षा के लिए. पिछले अध्ययनों की दूसरी बड़ी सीमा तथ्य यह है कि decidua basalis अपरा के मातृ पक्ष की ऊपरी परत जो संभावित trophoblastic संक्रमण में परिणाम हो सकता है काटने के द्वारा एकत्र किया गया था में रहता है । हमारे नए प्रोटोकॉल धीरे भ्रूण झिल्ली (चोरियों) बंद decidua scraping द्वारा decidua parietalis अलग और धुलाई चरणों के दौरान चोरियों के संक्रमण के आसान हटाने के लिए अनुमति देता है ।

इसलिए, हमारे विधि प्राथमिक decidual अपरा झिल्ली से समय की एक छोटी अवधि में एकत्र की कोशिकाओं के एक सीधी अलगाव के लिए अनुमति देता है (पूरी प्रक्रिया लगभग 3 घंटे लगते हैं) उच्च कोशिका उपज और उत्कृष्ट सेल व्यवहार्यता में जिसके परिणामस्वरूप । एक बार decidual कोशिकाओं अलग किया गया है वे प्रयोगों की एक भीड़ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, मानव प्राथमिक decidual कोशिकाओं immunocytochemical विश्लेषण के लिए coverslips पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है, वे विभिंन उपचार और जोड़तोड़ के लिए संस्कृति में उगाया जा सकता है, साथ ही सीधे बहुरंगा प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए दाग का आकलन करने के लिए गर्भावस्था जटिलताओं के साथ मानव decidua की संरचना अलग सेल उप आबादी की भूमिका को समझने की कोशिश में । जबकि विधि यहां प्रस्तुत अवधि अपरा (मानव हमल की तीसरी तिमाही के अंत) से कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, इस प्रोटोकॉल भी आसानी से पहली और दूसरी तिमाही अपरा हमल चरण के लचीलेपन के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता कि एक के शोध को संबोधित कर रहे हैं ।

पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल स्वचालित dissociations का उपयोग किया है decidual ऊतक या एंजाइमी अकेले पाचन21,22को तोड़ने के लिए । एक सौंय यांत्रिक बल के संयोजन (३७ डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान कमाल) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक एंजाइमी पाचन दोनों पाचन और कोशिका व्यवहार्यता अनुकूलित करने के लिए डिज़ाइन कॉकटेल, प्रोटोकॉल ऊपर उल्लिखित कोशिका उपज और व्यवहार्यता के बीच आदर्श संतुलन बनाता है । इसके अलावा, पिछले प्रोटोकॉल उनके अलगाव और केवल वर्तमान सेल व्यवहार्यता प्रतिशत19से प्राप्त कुल सेल उपज का उल्लेख करने में विफल रहा है । यहां हम सेल गिनती के माध्यम से निर्धारित decidual कोशिकाओं की एक उच्च उपज दिखाने के (10-20 अपरा प्रति लाख से लेकर) । इसके अलावा, वर्तमान प्रकाशनों के कई चूहों से प्राथमिक decidual/एंडोमेट्रियल कोशिकाओं के अलगाव का प्रदर्शन; हमारे प्रोटोकॉल मानव ऊतकों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, यह प्रयोग23के लिए कोशिकाओं के एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक स्रोत प्रतिपादन । इस प्रोटोकॉल को भी आसानी से पहली और दूसरी तिमाही अपरा हमल चरण के लचीलेपन के लिए अनुमति है कि एक अनुसंधान को संबोधित कर रहा है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक बार कोशिकाओं अलग किया गया है, वे immunocytochemistry के रूप में प्रयोगात्मक तकनीकों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता, प्रवाह cytometry, प्रोटीन और आरएनए निष्कर्षण, ल्यूकोसाइट्स के बाद अलगाव, आदि अलग सेल की भूमिका को समझने की कोशिश में उप आबादी । वास्तविक समय पीसीआर या जीनोम व्यापक संबद्ध अध्ययन के उपयोग के माध्यम से स्वस्थ और जटिल गर्भधारण (जैसे preeclampsia या अपरिपक्व श्रम) के बीच decidua में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति में अंतर की पहचान उपंयास लक्ष्य है जो सहायता कर सकते है प्रदान नैदानिक और चिकित्सीय उपकरणों के विकास । इसके अतिरिक्त, decidual कोशिकाओं के अनुपात में फेरबदल, विशेष रूप से ल्यूकोसाइट्स, जो आसानी से प्रवाह cytometry के उपयोग के माध्यम से पहचाना जा सकता है भी गर्भावस्था जटिलताओं के एटियलजि के लिए जवाब प्रदान कर सकते हैं, जैसे दोनों ल्युकोसैट में परिवर्तन उपजनसंख्या अनुपात के साथ ही उनके सक्रियकरण की स्थिति है जो दिखाया गया है दोनों शब्द और अपरिपक्व श्रम24में संग्राहक हो ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

लेखक के लिए दाताओं का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, RCWIH बैंक, और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया मानव नमूनों के लिए प्रसूति और स्त्री रोग के माउंट सिनाई अस्पताल/UHN विभाग । हम Lye लैब के सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा, विशेष रूप से डॉ कैरोलीन डुबो देना विधि विकास के साथ उसकी मदद के लिए । यह काम बरोज स्वागत कोष (ग्रांट #1013759) द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium Prepared in facility (LTRI)
Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium Prepared in facility (LTRI)
Diaper pads Sigma-Aldrich D9542
Large surgical scissors AL Medical 2018-12-20.
Large surgical forceps Fine Science Tools 11000-18
Plastic disposable cell scraper (25 cm) Sarstedt 83.183
250 mm (size 60 mesh) metal sieve Sigma-Aldrich S1020-5EA
Disposable scalpel with plastic handle (#21) Fisher Scientific 08-927-5D
Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) Sarstedt 82.1473.001
Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) VWR 25384-146
Nylon filter (70 mm) VWR/Corning 21008-952
Erythrocyte lysis buffer Qiagen 79217
Trypan blue, 0.4% solution Lonza 17-942E
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Hemocytometer Reichert 1490
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media Invitrogen 11835-055
Fetal bovine serum Wisent 080-150
Normocin (50mg/ mL) Invivogen ant-nr-1
Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) Millipore SCGPT05RE
Collagenase 2, lyophilized powder Sigma-Aldrich C6885
Soy bean trypsin inhibitor, powder Sigma-Aldrich T9003-250mg
DNase powder Roche 10104159001
Bovine serum albumin (BSA powder) Fisher Scientific BP1600-100
Spinning disc confocal microscope - Leica DMI 6000B Leica
Imaging Flow cytometer - Image Stream MK2 Amnis
IDEA software Millipore Sigma
APC-conjugated Vimentin antibody R&D Systems IC2105A
APC H7-conjugated CD45 antibody BD 641399
FITC-conjugated Cytokeratin antibody MACs Miltenyi Biotec 130-080-101
PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody Novus NBP2-47941PCP
eFluor450 Fixable Viability dye Thermo Fisher Scientific 65-0863-14
Vimentin primary antibody Santa Cruz sc-7558
CD45 primary antibody Dako M0701
Cytokeratin primary antibody Dako M0821
Cytokeratin 7 primary antibody Dako M7018
Mouse IgG Santa Cruz sc-2025
Goat IgG Santa Cruz sc-2028
Alexa Fluor 546 secondary antibody Invitrogen A10036
Alexa Fluor 594 secondary antibody Fisher Scientific A-11058
DAPI Sigma-Aldrich D9542

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References

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चिकित्सा अंक १३४ Decidua प्राथमिक कोशिकाओं कोशिका अलगाव अपरा प्रवाह cytometry immunocytochemistry
शब्द अपरा की भ्रूण झिल्ली से प्राथमिक मानव Decidual कोशिकाओं का अलगाव
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Farine, T., Parsons, M., Lye, S.,… More

Farine, T., Parsons, M., Lye, S., Shynlova, O. Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae. J. Vis. Exp. (134), e57443, doi:10.3791/57443 (2018).

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